基于lr-lr蛋白含量的粳稻自交系重组群体的构建及食味品质的影响

基于lr-lr蛋白含量的粳稻自交系重组群体的构建及食味品质的影响

蛋白质是水稻的第二个重要组成，对水稻的食用和质量有重要影响。前人研究表明,总蛋白质含量高的米饭质地较硬,食味往往较差。但不同的观点也很多。向远鸿等认为总蛋白质含量对食味品质的影响因品种类型不同而异;李贤勇等认为总蛋白质含量与食味品质没有显著的相关性。为了更加客观准确地评价稻米食味品质,近年来,快速黏度分析仪(RapidViscoAnalyser,RVA)已得到了广泛应用。许多研究表明,米粉RVA谱的崩解值、消减值和回复值与稻米食味品质存在密切的联系,可以比较灵敏地反映不同品种间稻米食味品质的差异。沈鹏等和刘建等分别以3个和1个粳稻品种为材料,通过不同的田间施氮处理,研究了总蛋白质含量与RVA谱特征值的关系,前者认为总蛋白质含量与消减值呈显著正相关,与崩解值相关不显著;后者认为稻米总蛋白质含量与崩解值呈极显著的负相关,与消减值无相关性。Tan等以51个籼稻品种和12个粳稻品种为材料研究表明,总蛋白质含量与崩解值、消减值相关均不显著。由上可知,许多研究者从食味品质、理化指标和RVA谱特征值等方面,分析了总蛋白质含量与稻米食味品质的关系,但观点不一致。有学者从蛋白质组分与食味品质的关系入手做了研究。根据溶解性的差异,稻米蛋白质可分为清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白。前两者主要存在于胚和糊粉层中,后两者主要存在于胚乳中。因此,精米中的蛋白质以谷蛋白和醇溶蛋白为主,分别占总蛋白的70%～80%和18%～20%。孙平认为,稻米的清蛋白、球蛋白和谷蛋白都由一些优良氨基酸组成,营养丰富而不影响食味,只有醇溶蛋白才导致食味降低。但该推测缺乏直接的试验证据。杨静等以7个粳稻品种为材料,通过不同的田间施氮处理,认为醇溶蛋白含量与回复值呈显著的负相关。关于蛋白质组分与食味品质的关系研究,国内外报道很少,并且所用材料缺乏代表性,难以揭示蛋白质组分与食味品质关系的本质。本实验室培育了一个低谷蛋白含量(lowglutelincontent,LGC)粳稻品种W1721,与普通品种相比,谷蛋白含量明显降低,醇溶蛋白含量大幅度升高,该表型由显性单基因LGC控制。将W1721与广泛应用的杂交粳稻恢复系轮回422杂交,我们构建了包含113个家系的重组自交系群体,存在谷蛋白相对于醇溶蛋白的含量高低差异很大的两种类型,并且类型内总蛋白质含量又有丰富的变异。本研究在排除脂肪影响的情况下(脱脂后),分析了谷蛋白相对于醇溶蛋白的含量差异很大的两种类型在淀粉RVA谱特征值上的差异,以及同一类型内总蛋白质含量与淀粉RVA谱特征值的关系,以期对蛋白质与食味品质关系有较为全面的认识,指导稻米食味品质的改良。1材料和方法1.1交系群体生长亲本W1721和轮回422及113个家系组成的重组自交系群体(F5:6),2007年种植在南京农业大学土桥试验站。每个家系2行,每行8株。成熟后,每个家系随机选择1个单株收获种子,室温下保存3个月后,碾成精米备用。1.2方法1.2.1sds-东南角电泳籽粒蛋白的提取和LGC位点的基因型鉴定参照Wang等的方法。收获后每个单株碾成精米,随机挑选9粒米,分别用钳子夹碎放入9个1.5mL的离心管中,加入500μL65℃温浴的蛋白提取液[4mol/L尿素,质量体积比为4%的SDS,0.125mol/L的Tris-HCl(pH6.8),体积比为5%的β-巯基乙醇],过夜后离心。取5μL上清液点样进行SDS电泳,电泳结束后用考马斯亮蓝R250(CBB-R250)染色。根据SDS带型来判断LGC位点基因型。对纯合型的单株,再取9粒米进行复鉴。1.2.2抽提单元的确定为排除脂肪对RVA谱特征的影响,在测定RVA谱之前对米粉脱脂。对米粉脱脂利用脂肪测定仪SOXTEC2050(FOSS公司,瑞士)进行,具体步骤如下:1)将8g样品用滤纸包好放到浸提纸筒中,样品上面用一团脱脂棉盖住,防止抽提时样品从纸筒中溅出;2)把加有样品的浸提筒和浸提杯放到抽提系统中;3)把50mL沸点为60℃的石油醚加到抽提单元中,开启控制单元开关进行抽提,控制单元程序设置包括样品在沸腾的溶剂中浸泡30min;样品上升到溶剂上面,用冷凝器中冷凝下来的溶剂淋洗1h;回收溶剂10min,使样品和浸提杯中的溶剂尽可能回收;4)抽提结束后,把浸提杯放在105℃烘箱烘30min,即得到脱脂米粉。1.2.3总蛋白质含量的测定利用全自动凯氏定氮仪(FOSS公司,瑞士),按照半微量凯氏定氮法测定总蛋白质含量。具体参照文献方法进行。1.2.4cw的分析按照AACC(美国谷物化学协会)规程(1995-61-02)标准方法,采用澳大利亚NewportScientific仪器公司的Super3型快速黏度分析仪进行测定,用TCW(ThermalCycleforWindows)配套软件进行分析,具体参照文献的方法进行。淀粉黏度单位是RVU(rapidviscosityunit),包括3个一级数据,即峰值黏度(peakviscosity)、热浆黏度(hotviscosity)、冷胶黏度(finalviscosity),以及3个二级数据,即崩解值(breakdownvalue,峰值黏度-热浆黏度)、消减值(setbackvalue,冷胶黏度-峰值黏度)和回复值(consistencevalue,冷胶黏度-热浆黏度)。1.2.5稻米蛋白质的线性回归分析应用单因素方差分析法对两种水稻基因型LGCLGC和lgclgc的RVA谱特征值进行比较,贡献率=基因型变异的平方和/总平方和×100%;LGC的相对加性效应=1/2(基因型LGCLGC的值-基因型lgclgc的值)/基因型lgclgc的值×100%。以总蛋白质含量为自变量,RVA谱的6个特征值分别为依变量,进行线性回归分析,研究稻米蛋白质含量与淀粉RVA谱特征值的关系。贡献率=线性回归方程的回归平方和/线性回归方程的总平方和×100%。以上数据处理均在SPSS16.0上进行。2结果与分析2.1sds-计划带型的检测W1721种子蛋白的SDS带型表现为37～39kD和22～23kD谷蛋白亚基条带浅,而13kD醇溶蛋白亚基条带深;轮回422的表现正好相反,两者的差异非常明显(图1),此差异就是由LGC位点决定的。因此,可利用SDS带型来推断各家系LGC位点的基因型。若来自同一单株的9粒种子电泳带型相同,并与W1721一致,则为纯合型LGCLGC,谷蛋白含量较醇溶蛋白低;若来自同一单株的9粒种子电泳带型相同,并与轮回422一致,则为纯合型lgclgc,谷蛋白含量较醇溶蛋白高;若来自同一单株的9粒种子电泳带型不相同,则为杂合型LGClgc。结果共检测到基因型为LGCLGC的单株42个;lgclgc的单株54个;杂合型LGClgc的单株17个,进一步选用两种纯合基因型的96个单株进行下述研究。2.2不同品种的rva谱特征值的变异对上述两种纯合基因型96个单株的米粉脱脂后,测定RVA谱和总蛋白质含量,结果见表1。本研究用两个粳稻品种构建的重组自交系群体中,96个个体的总蛋白质含量的变幅在6.56%～11.79%。陈能等调查了1518份粳稻品种的总蛋白质含量,主要分布在7%～10%。说明本研究所用群体的不同个体能很好地代表大部分的粳稻品种。6个RVA谱特征值的变幅也很大,具有丰富的变异。应用该群体可在很宽的范围内考查稻米蛋白质组分及总蛋白质含量与淀粉RVA谱特征的关系,结果更加接近真实。2.3不同品种县母稻的崩解值和回复值的比较基因型LGCLGC和lgclgc的平均总蛋白质含量分别为8.97%和9.35%(表2),单因素方差分析表明基因型间的差异不显著。这两种基因型总蛋白质含量的变幅分别在6.56%～11.38%和6.79%～11.79%,涵盖了绝大部分粳稻品种的分布范围。基因型LGCLGC的崩解值和回复值的平均值(分别为132.10和88.86RVU)大于基因型lgclgc的崩解值和回复值的平均值(分别为122.52和81.60RVU),且差异分别达显著和极显著水平(表2)。进一步分析表明,LGC对崩解值和回复值的相对加性效应分别为3.91%和4.45%,贡献率分别为4.81%和12.81%。LGC对RVA谱特征的崩解值和回复值有着明显的效应,但对其他特征值的效应不明显。2.4总蛋白质含量与崩解值、消减值和回复值的线性回归分析为了考查两种基因型内总蛋白质含量与RVA谱特征值之间的关系,以总蛋白质含量为横坐标,RVA谱的6个特征值分别为纵坐标,绘成图2。LGCLGC型的稻米总蛋白质含量与崩解值和消减值分别存在明显的负线性和正线性相关趋势(图2-D和图2-E),线性回归分析表明,总蛋白质含量与崩解值和消减值分别存在着显著的负线性回归和正线性回归关系,贡献率分别为9.86%和11.48%,表明,总蛋白质含量越高,崩解值越低而消减值越高。lgclgc型的总蛋白质含量与消减值和回复值都存在明显的负线性趋势(图2-e和图2-f),线性回归分析表明,总蛋白质含量与消减值和回复值都存在着极显著的负线性回归关系,其贡献率分别为13.41%和27.88%;总蛋白质含量与崩解值也存在着接近显著的正线性回归关系,其贡献率为5.22%(图2-d),表明总蛋白质含量越高,崩解值越高而消减值和回复值越低。其余的线性回归关系不明显。进一步比较两种基因型间总蛋白质含量与RVA谱特征值的关系,从图2-d与图2-D、图2-e与图2-E、图2-f与图2-F的直观比较可知,总蛋白质含量对崩解值、消减值和回复值的影响在两种基因型间是不同的。3谷蛋白和醇溶蛋白总蛋白质含量对稻米食味品质的影响在RVA谱特征值中,崩解值、消减值和回复值是评价稻米食味品质的3个主要特征值。隋炯明等认为崩解值高,而消减值和回复值低的米饭软而黏,适口性好;崩解值低,而消减值和回复值高的米饭硬而黏性小,适口性差。本研究表明,LGCLGC型稻米(谷蛋白含量较醇溶蛋白低)崩解值和回复值的平均值都比lgclgc型(谷蛋白含量较醇溶蛋白高)的高,推测LGCLGC型米饭较lgclgc型的软而黏性小,这与Graeme等和Chrastil的报道相一致:前者发现稻米淀粉中添加来自于稻米的醇溶蛋白,引起了崩解值的极显著上升和硬度、黏性的极显著降低;后者发现稻米的黏性随着谷蛋白含量的增加而增加。这两篇文献的结果也暗示谷蛋白和醇溶蛋白对米饭黏性的效应是相反的。根据以上分析可以认为,谷蛋白相对于醇溶蛋白的含量对稻米食味品质有着一定程度的影响。本研究还表明,LGCLGC型稻米总蛋白质含量与崩解值、消减值分别存在显著的负线性回归和正线性回归关系,说明LGCLGC型稻米的总蛋白质含量升高,崩解值下降而消减值升高,暗示米饭硬而不黏,食味下降;lgclgc型稻米的总蛋白质含量与崩解值存在接近显著的正线性回归关系,与消减值和回复值都存在极显著的负线性回归关系,说明lgclgc型稻米的总蛋白质含量升高,崩解值升高而消减值和回复值降低,暗示米饭软而黏,食味得到改善。以上比较分析表明,LGCLGC型和lgclgc型的稻米,总蛋白质含量对食味品质的影响是不同的。因此,总蛋白质含量对食味品质的影响因谷蛋白相对于醇溶蛋白的含量的不同而异,这可能就是因为前人单纯分析总蛋白质含量与食味品质的关系时结论不一致的原因之一。总之,稻米的食味品质受到谷蛋白相对于醇溶蛋白的含量以及总蛋白质含量的影响;而总蛋白质含量对食味品质的影响又因谷蛋白相对于醇溶蛋白的含量的不同而异,暗示谷蛋白和醇溶蛋白对食味品质的效应是不同的。这启发育种工作者应当同时注意两个方面:1)谷蛋白相对于醇溶蛋白的含量;2)谷蛋白和醇溶蛋白