瘦素受体在正常大鼠下丘脑的分布

瘦素受体在正常大鼠下丘脑的分布

瘦素酶（lr）对中枢和周围的瘦素受体（lr）起着广泛的生物学作用。近年来研究发现,瘦素除了其调节能量代谢平衡的作用外,可能参与了肥胖性高血压的形成,有证据提示这种作用来自中枢神经系统(CNS)。下丘脑是CNS中使机体内环境保持平衡的最重要部位,与脑内的其他部位存在复杂的联系,是较高级的调节内脏的中枢,有可能成为瘦素血压调节的作用位点。如前所述,瘦素的作用的发挥有赖于LR的介导,尽管有报道LR广泛分布于CNS,但尚缺乏其在下丘脑的确切定位。本研究旨在用免疫组织化学的方法观察LR在下丘脑的分布。1材料和方法1.1实验动物与饲料健康、成年、雄性SpragueDawley(SD)大鼠7只,体重250~285g(西安交通大学医学院实验动物中心提供)。喂以颗粒型大鼠饲料,自由饮水,动物房温度维持在18~24℃,光暗周期12h(7:00-19:00)。取脑组织前在上述条件下喂养3d。1.2载玻片片组织化学染色按常规方法麻醉和固定动物。开颅取脑,4℃4%的多聚甲醛中后固定24h,流水冲洗过夜,入80%酒精脱水,透明,石蜡包埋,连续冠状切片,片厚10μm,粘贴于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上。切片分3套,4℃保存待用:第1套做尼氏染色,用于组织学定位;第2套做LR免疫组织化学染色;第3套做免疫组化阴性对照染色。1.3抗羊血清动力学采用免疫组织化学ABC法染色,所有操作严格按照试剂盒说明书进行。步骤如下:石蜡切片经脱蜡水化后,0.3%双氧水(去离子水稀释)封闭内源性过氧化物酶活性;枸橼酸缓冲液(pH6.0)92℃热修复15min;1.5%的封闭血清湿盒中孵育1h(18~20℃);加入抗LR羊血清(1∶50,购自SantaCruze公司,货号sc-1834)孵育,4℃过夜;PBS(磷酸缓冲液)冲洗后加入生物素标记的抗羊IgG室温孵育2h;ABC复合物(ABCstainingsystem,购自SantaCruze公司,货号sc-2023)孵育2h;DAB(二氨基联苯胺)显色;常规脱水透明,中性树胶封片。阴性对照用PBS代替第二抗体,其余步骤同上。2lr在大鼠cns分布7只SD大鼠中,有5只SD大鼠标本制备成功。分析切片发现:多个脑区的神经元的胞体和树突均可见LR阳性反应物质(Leptinreceptor-immunoreactiveties,LR-IR)。LR-IR阳性细胞胞膜有棕色颗粒沉着,胞核及胞浆不着色,呈背景色,典型的LR-IR阳性细胞为“环样”细胞。对照片结果为阴性。结果显示LR在大鼠CNS分布广泛,其中下丘脑是LR的主要存在部位,可见受体分布于下丘脑的弓状核、室旁核、腹内侧核、背内侧核、杏仁基底外侧核等,此外,也可见于扣带、海马、视上核、脑室室管膜上皮细胞和脉络丛等部位。下丘脑室旁核位于第3脑室(3V)顶部两侧,呈楔形,核中可见LR-IR阳性细胞分布,外侧细胞较大,着色深,阳性细胞相对密集,近中线处细胞较小,着色淡,分布稀疏(图1)。背内侧核呈椭圆形,位于3V中部两侧,核团轮廓欠清晰,核中可见LR-IR阳性细胞分布,着色淡,高倍镜下可见细胞胞体三角形或圆锥形,大小较均一,胞膜上可见深棕色颗粒沉着,分布密集(图2)。腹内侧核位于下丘脑结节区内侧带,3V底部两侧,核团大,界限较清晰,核团中有LR-IR阳性细胞分布。高倍镜下见细胞多呈椭圆形,大小不一,胞膜着色深,染色颗粒清晰,细胞呈“环样”改变(图3)。此外,下丘脑弓状核、杏仁基底外侧核、扣带、海马及脑室室管膜上皮细胞和脉络丛亦可观察到LR-IR阳性细胞。均表现为胞膜着色,胞核及胞浆不着色,只是胞体形状、大小、细胞分布密度存在差异。3腹内侧核与散发神经元本研究结果显示LR在大鼠CNS分布广泛,其中下丘脑是LR的主要存在部位,可见受体分布于下丘脑的弓状核、室旁核、腹内侧核、背内侧核、杏仁基底外侧核等。LR在大鼠脑内的分布与人、小鼠、羊、猪等相似。LR在脑内的分布定位,特别是在下丘脑特定核团的分布定位以及与其他神经肽之间的关系,是近几年生命科学研究的热点之一。LR在上述核团的高度表达与瘦素最重要的生理功能即调节摄食、控制体重以及下丘脑的摄食调节机能相吻合。半个世纪前人们已经认识到,下丘脑中的有些核团与进食有关。应用脑区损伤或切断脑区神经通路的研究证实,下丘脑内侧区的弓状核、室旁核、腹内侧核、背内侧核、视交叉上核和外侧下丘脑皆可影响摄食行为。下丘脑是CNS中使机体内环境保持平衡的最重要的部位,与脑内的其他部位存在着复杂的联系,是较高级的调节内脏活动的中枢,因此,除了上述的摄食控制机能外还具有其他一些复杂的生理功能,如调控内脏神经系统、体温、昼夜节律、本能活动、情绪等。研究发现,腹内侧核微注射瘦素可引起循环中儿茶酚胺浓度增高,同时可以促进外周组织对葡萄糖的摄取,这一过程有赖于交感神经系统(SNS)的参与;此外,刺激背内侧核中的某些神经元可以增交感缩血管活性、升高血压、加快心率等;PVN中有神经纤维投射到延髓和脊髓的自主神经结前神经元,并且可以分泌多种与心血管活动调节有关的物质,如血管加压素、NO、CRF等,因此在心血管活动的调节中可能发挥重要作用。因此,上述3个具有LR分布的核团有可能是瘦素激活SNS从而引起血压改变的中枢作用位点,这有待于进一步的研究证实。海马、扣带属于边缘系统,是与情感行为、学习记忆及神经内分泌等高级神经活动相关的重要部位,因此我们推测瘦素在学习、记忆和情绪调节中也可能