单次腹腔注射lps后大鼠脑内神经元和小胶质细胞的表达

单次腹腔注射lps后大鼠脑内神经元和小胶质细胞的表达

神经系统和神经系统之间存在双向信息交流，主要任务的反应受到神经系统（cns）的调节。已知脑内存在广泛的神经元-胶质细胞信息网络。在CNS病损时,神经元发生形态、功能的改变,同时胶质细胞也发生变化,小胶质细胞作为脑组织中固有的免疫效应细胞,可从静止变为激活状态,以助于宿主防御和修复。机体受到外周免疫刺激,小胶质细胞的改变及与神经元的关系尚未见报道。脂多糖(LPS)是革兰阴性杆菌的细胞壁的主要成分,在免疫应答研究中常被作为一种多克隆免疫激发剂来模拟机体免疫激发状态,是研究免疫系统与神经系统之间信息交流的常用模型。本实验单次腹腔注射LPS,利用免疫组织化学方法观察反应性神经元(以Fos作标记物)和小胶质细胞(以OX42作标记物)在前脑的分布、时间规律及相互关系。1材料和方法1.1饲养环境及饲养时间成年SD大鼠49只,体重240～300g,安静温暖、避强光的环境中饲养48h。随机分为实验组(n=42)和对照组(n=7)。1.2血液流变学1%戊巴比妥钠大鼠清醒状态下,迅速腹腔注射100μg/kg的LPS(Sigma),对照组用生理盐水300μl替代LPS做腹腔注射,分别存活30min,1,3,6,12,24和72h(每组n=6)后用1%戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉,经左心室至升主动脉插管,100ml生理盐水冲洗血液,含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PB,pH7.4,4℃)灌注固定。脑组织置于含20%蔗糖的0.1mol/LPB内(4℃)至沉底。冷冻冠状切片,片厚30μm。切片收集于0.01mol/LPBS中。1.3抗th-abc法切片入80%甲醇/双氧水20min,PBS液充分漂洗,入0.3%TritonX-100处理后,切片分为3套,按ABC法分别进行抗FOS和OX42单标和抗FOS/OX42/TH(酪氨酸羟化酶)三标免疫组织化学反应。以三标为例,简述反应过程。依次孵育于:(1)兔抗Fos(1∶3000,SantaCruz)和鼠抗OX42(1∶3000,Chemicon)的混合抗体稀释液24h(4℃);(2)生物素标记的羊抗兔IgG(1∶500,Sigma)和驴抗鼠IgG(1∶500,Sigma)的混合稀释液2h(室温);(3)生物素-卵白素-HRP复合物(ABC,1∶500,Sigma)2h(室温)。以上每一步骤之后均用PBS液充分漂洗3次,每次10min,最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺法显色,阳性产物呈蓝色。显色后,再依次进行抗TH的ABC法染色:(1)鼠抗TH单克隆抗体(1∶3000,Incstar),孵育24h(4℃);(2)生物素标记的驴抗鼠IgG(1∶500,Sigma),3h(室温);(3)ABC复合物(ABC,1∶500,Sigma),2h(室温);(4)葡萄糖氧化酶-DAB溶液呈棕色20min,室温然后常规裱片、脱水、透明、DPX封固、光镜观察。1.4替代实验取实验组切片,用0.01mol/LPBS分别替代抗Fos或抗OX42抗体稀释液,按ABC法进行免疫组化染色,结果为阴性。1.5图像大鼠fos阳性神经元的计数光镜下(BX-60,Olympus,Japan)观察并应用Leica公司的Quantimet570c图像分析仪采集图像。对FOS阳性神经元进行计数,每组共计6只大鼠,每只大鼠2张下丘脑室旁核最大平面切片,60×视野所得。数据以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,进行两因素两水平方差分析(two-wayANOVA)。2结果2.1fos阳性矩阵2.1.1前后脑结构的分区对照组大鼠脑内FOS阳性神经元的数量少,染色浅,散在分布。实验组大鼠脑内Fos阳性神经元的数量明显增加并有区域分布特点。前脑的额顶皮质、扣带皮质(Fig1A)Fos阳性神经元密集分布;梨状皮质、外侧隔核腹侧部、中央杏仁核次之;海马的CA2区、CA3区、齿状回有中等密度分布。间脑主要分布于丘脑室旁核、下丘脑视上核(Fig1B)、室旁核(Fig1C)、弓状核、下丘脑外侧区和第三脑室周围灰质等。2.1.2fos阳性胞核检测根据LPS刺激后PVN内各时点Fos阳性胞核数目统计发现,刺激后30minFos阳性胞核出现,1h数量明显增加,染色加深,3h有所下降,6h后明显减低,72h有回升趋势,略高于12h组(Fig2)。2.2ox42阳性小胶质细胞的检测对照组仅在第三脑室周围灰质有微弱表达,染色淡,胞体小,分支细、短。实验组(Fig1D～G)LPS注射后1h可见到OX42阳性小胶质细胞,3h数量增多,6h达到高峰。反应性OX42阳性小胶质细胞的染色变深,胞体变大,分支增粗,支上的棘状物增粗增多。在扣带回、海马、下丘脑室旁核、第三脑室室周灰质等Fos阳性神经元分布较多的脑区,OX42阳性小胶质细胞也深染和密集分布。2.3li神经元的胞核和th-li水理学三重染色切片镜下可见Fos-LI或TH-LI神经元、Fos/TH-LI双标神经元,以及OX42-LI小胶质细胞。在Fos-LI神经元与OX42-LI小胶质细胞之间,TH-LI神经元与OX42-LI小胶质细胞之间,Fos/TH-LI双标神经元与OX42-LI小胶质细胞之间显示出密切的关系。Fos-LI神经元的胞核呈黑蓝色,胞质不着色;TH-LI神经元胞质呈棕色,胞核不着色。OX42-LI小胶质细胞呈黑蓝色“雪花状”分支。Fos/TH-LI双标神经元,在棕色胞质内有圆形或卵圆形黑蓝色胞核。TH-LI神经元的棕色胞体和突起,被蓝黑色的OX42-LI小胶质细胞的突起包绕或接触;Fos-LI的蓝黑色神经元胞核周围,有蓝黑色OX42-LI小胶质细胞突起,两者之间可有微小未着色空隙;Fos/TH-LI双标神经元为蓝黑色胞核在均匀棕黄色胞质内,周围被蓝黑色的OX42-LI小胶质细胞的突起包绕或接触。这些细胞主要分布于下丘脑室旁核,第三脑室周围灰质等。因Fos和OX42高峰不同,选取包含下丘脑室旁核的连续5张切片,计数6h时间点的第三脑室周围灰质Fos/TH-LI双标神经元与OX42-LI小胶质细胞接触关系,以Fos/TH-LI神经元胞体与“雪花状”分支的OX42-LI小胶质细胞的密切接触为标准,占Fos/TH-LI双标神经元的85%,占TH-LI神经元与OX42-LI小胶质细胞接触形式的34%。3小胶质细胞激活免疫系统与神经系统之间存在双向信息交流,宿主对炎性的反应和局部组织修复受到CNS的调节,存在免疫系统与大脑的通讯。(1)血源性通路,细胞因子参与其中。细胞因子多途径入脑,并且CNS产生新的细胞因子;(2)神经通路,外周免疫刺激引起传入神经(如迷走神经)活动,信息快速传入大脑。尤其当血循环中细胞因子水平低时(如炎症早期)和局部炎性刺激迷走神经,神经系统对机体的调节迅速发生。Fos蛋白作为神经元活动状态的标记物,已被广泛采用。本实验发现LPS注射后30min,在脑内的一定区域有Fos阳性神经元分布,1～3h为表达高峰,表明大鼠脑对外周免疫刺激的调节反应是快速的。Yang等和Ge等发现切断迷走神经后,再给予腹腔注射LPS,大脑Fos蛋白表达明显减少。Brady的c-fosmapping的研究也证实神经通路的存在。小胶质细胞作为脑组织中固有的免疫效应细胞有三种状态:(1)正常状况时的静止状态;(2)非噬菌性反应性状态,多为CNS产生炎性反应时出现;(3)噬菌性反应性状态,常出现在CNS创伤和感染时。CNS受到免疫刺激时,小胶质细胞从静止变为激活状态,被激活的早期表现胞体增大,突起变粗,染色深。小胶质细胞激活后,其功能一方面释放炎性因子和趋化调节因子,扩大神经损伤;另一方面释放神经保护成分,认为小胶质细胞在CNS维持信息整合中扮演角色。有实验表明脑对LPS的免疫反应是剂量相关的。低浓度LPS刺激培养小胶质细胞,OX42-LI小胶质细胞增多,高浓度刺激数量减少,染色浓重。Neuron-glia混合培养,低剂量LPS(0.01～10μg/kg)未引起小胶质细胞形态改变,高剂量LPS(>500μg/kg),OX42-LI小胶质细胞分支增粗,数量随LPS剂量增加而增加。Laia对大鼠活体兴奋性毒性损伤的研究,发现小胶质细胞能够表达IL-1b和TNFa。Hansen发现腹腔注射LPS(10～100μg/kg)后,大鼠下丘脑、海马等处IL-1β蛋白水平增加,呈剂量依赖性。而LPS剂量的高低与细胞因子分布部位有关,腹腔注射大量LPS(>500μg/kg),IL-1b和TNFamRNA全脑表达;小量注射时(0.01～10μg/kg),其表达仅在近脉络膜、室周器官(CVOs)、软脑膜下脑实质处。本实验为单次腹腔注射LPS(100μg/kg),小胶质细胞表现为早期激活状态。先于脑室周围灰质出现,6h达到高峰,对应于Fos-LI神经元表达多的核团(如PVN)深染和密集;形态改变为胞体变大,分支增粗,支上的嵴状物增粗、增多。在表达部位上小胶质细胞与神经元有一致性。外周免疫刺激,小胶质细胞与神经元均活化,细胞因子可能参与其中。在免疫刺激信息入脑过程中,体液通路的作用缓慢而持久。通过大脑脉管系统和CVOs入脑的IL-1β启动一种迟缓的空间效应。IL-1β介导产生某种细胞因子。当IL-1β与其受体结合,激活信号传导通路,诱导IL-1β和其他因子的基因转录。新产生的IL-1β以paracrine形式,又介导较远区域的细胞产生IL-1β。有学者认为,外周的细胞因子介导脑内新的细胞因子由胶质细胞的产生,新的细胞因子在神经元上有受体。小胶质细胞激活后,释放炎性因子,如IL-1β和TNF等因子已被公认。小胶质细胞的激活亦受到来自神经元和其他胶质细胞的细胞因子调节。细胞因子可能成为神经元与小胶质细胞间通讯的桥梁之一。据报道,将神经元加到有小胶质细胞的培养液中,静息状态的小胶质细胞被激活,并延长了神经元的存活和增强轴突的生长,两种细胞的接触是相互作用的最重要因素。已知免疫刺激可引起下丘脑-垂体-肾上腺轴和交感神经系统的活动增强。Yang等观察到腹腔注射LPS,PVN中对免疫刺激起反应的神经元中有7