总皂苷提取分离工艺的研究

总皂苷提取分离工艺的研究

ektomykorriza经常出现。对于具有消肿止痛、祛风除湿、活血化瘀、肿瘤等作用的中药总糖苷，通常提取、分离和提取的乙醇在60%-70%之间的酒精中加热和回流。但正丁醇沸点高、回收难,整个操作过程繁琐费时、成本高,加上有乳化等因素常导致萃取效率较低,而中草药本身总皂苷含量较低,上述方法难以进行大规模生产。大孔吸附树脂分离、纯化中草药有效成分优势显著。用大孔树脂分离、纯化总皂苷,可很好地解决溶剂法提取皂苷时遇到的这些问题。目前,用大孔树脂分离、纯化菝葜总皂苷的研究尚未见报道。本实验以总皂苷吸附量和解吸率为指标,筛选了4种植化分离中常用的树脂,并研究其吸附与解吸优化条件,发现HPD100树脂能很好地分离、纯化菝葜总皂苷,且该方法具有操作简单,周期短的优点。1总皂苷树的药物和树脂7500紫外-可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司,德国PE公司生产)。菝葜根茎,产于湖南邵阳地区,粉碎干燥备用;香草醛,高氯酸,冰醋酸,氢氧化钠和甲醇,均为分析纯;正丁醇和乙醇为化学纯;甾体总皂苷对照品(含量95%,中国药品生物制品检定所)。HPD100,300,6003种大孔树脂(沧州宝恩化工有限公司),D101大孔树脂(天津南开大学化工厂),树脂柱(玻璃柱4根,3cm×30cm)。吸附液(原料液)为本实验室提取的浓缩液。2树脂筛选2.1线性关系考察精密称取甾体总皂苷对照品,用甲醇配成248μg·mL-1的对照品溶液,分别精密吸取0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35,0.40mL对照品溶液及0.40mL甲醇于8支10mL试管中,于70℃恒温水浴锅上蒸干,各试管再分别加入0.20mL的5%香草醛冰醋酸溶液及0.80mL高氯酸,摇匀后置于70℃恒温水浴锅中保温15min,取出迅速加入4mL冰醋酸摇匀,在462nm处测定吸光度,以加甲醇管为空白对照,以浓度(C)对A回归,得回归方程:A=0.0181C-0.0043,r=0.999,样品在5~20μg·mL-1线性良好。2.2准备仔细量取已充分溶胀的4种树脂各16mL,分别装柱,按常规方法对树脂进行预处理,洗脱液为70%乙醇。2.3规定受附液吸附流速一般为4~6BV(树脂床层体积)·h-1,解吸流速为其1/2。以平均流速5BV·h-1,自上而下分别通过吸附液。再以100mL蒸馏水以平均流速5BV·h-1洗柱,洗脱未被吸附的皂苷及杂质,对吸附原料液和4根树脂柱流出液(包括水洗液)分别取样,以备测定。2.4解吸以平均2.5BV·h-1的流速,以200mL70%乙醇解吸液洗脱4根吸附量确定的树脂柱。收集解吸洗脱液备测。2.5总皂苷浓度测定吸附液、收集的各柱吸附流出液(包括水洗液)及解吸洗脱液,分别在旋转蒸发仪上减压真空回收至干,再加20mL热水溶解,以正丁醇120mL,分3次萃取,合并正丁醇液,在旋转蒸发仪上减压真空回收至干,再用甲醇定容到50mL,从中取1mL用甲醇稀释、定容到10mL,吸取0.20mL稀释液,按总皂苷标准曲线的制备项下测其吸光度,根据回归方程计算其浓度。2.6不同树脂吸附的单种成分配比依次按下面公式分别计算各树脂的吸附量及解吸率,结果见表1。吸附量(Q)=原料液浓度×原料液体积-流出液浓度×流出液体积湿树脂体积(Q)=原料液浓度×原料液体积−流出液浓度×流出液体积湿树脂体积解吸率(α)=解吸液中总皂苷含量(mg)吸附量(mg)×100%(α)=解吸液中总皂苷含量(mg)吸附量(mg)×100%从表中数据可以看出,HPD100树脂的吸附量与其他树脂的吸附量差别不大,但其解吸率高于其他树脂的解吸率,故选择这种非极性大孔吸附树脂。3温度和流速的影响一般认为影响吸附效率的主要因素有吸附液浓度、盐离子浓度、吸附液流速及吸附温度。对于实际生产过程,通常的温度变化对吸附效果影响不大,实际吸附过程的温度控制也不易实施。对于流速,常规是较低的流速有利于吸附与解吸,但生产率低,故取中间值5BV·h-1为吸附流速。本实验只就吸附液的pH、添加NaCl的浓度对吸附效率的影响进行实验考察与优化。3.1柱内柱吸附量的测定仔细量取经预处理的HPD100树脂64mL,分成4等份,分别装入4根玻璃柱中,以10%HCl溶液将各等分原料液的pH值分别调为4.0,5.0,6.0,7.0,再分别上柱,流速为5BV·h-1。检测原料液的浓度及各柱流出液的量与浓度,计算各柱吸附量,结果见图1。由图1可见吸附量随pH增大而减小,pH为4.0吸附液的吸附量明显高于其他pH吸附液的吸附量,但与pH为5.0吸附液的吸附量差别不大,因该种树脂规定使用的pH为5.0~8.0,过低的pH会影响、甚至破坏树脂,故实际生产中使用的最适pH宜选为5.0。3.2总皂苷的吸附量取pH5.0的吸附液6等份,依次加NaCl使其浓度分别为0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0mol·L-1,其他条件与2.1同,不同NaCl浓度吸附液的吸附量如图2。从图2可以看出,NaCl浓度从0.5~1.5mol·L-1,总皂苷吸附量随NaCl浓度增加而增加,尤其是从1.0~1.5mol·L-1总皂苷吸附量增加十分明显,两者之间近乎呈线性关系。但当NaCl浓度大于1.5mol·L-1时,单位体积树脂的总皂苷吸附量增加较小,再添加NaCl对吸附量的影响已经很小,故吸附液的NaCl浓度以1.5mol·L-1为宜。因该树脂对Na+,Cl-均不吸附,洗脱前再先经水洗后即可彻底除去Na+,Cl-。故添加NaCl,对于总皂苷纯度及活性不会产生影响。4解吸条件优化4.1不同树脂柱的解吸实验从经济及环境的角度考虑,作者在此仅选择乙醇与水作为洗脱剂,比较不同乙醇浓度的解吸效果。用去离子水将95%乙醇分别调成含乙醇40%,50%,60%,70%,80%,90%浓度的溶液,再分别解吸同样条件(pH5.0,NaCl浓度1.5mol·L-1)吸附饱和的6根树脂柱,流速均为2.5BV·h-1,其解吸率见图3。图3表明,解吸率随乙醇浓度增大而增大,但乙醇浓度超过70%以后,其解吸率增加很小,用80%乙醇比用70%乙醇增加的值较小,影响不明显,而增加乙醇浓度会洗脱更多的杂质,例如色素、树脂等,降低总皂苷纯度,所以宜选用70%乙醇为洗脱液。4.2碱减量法考察总皂苷纯度70%乙醇的解吸效果用10%的NaOH溶液,将4等份的70%乙醇洗脱液依次调pH为7.0,8.0,9.0,10.0,进行脱附效果比较实验(其中70%乙醇洗脱液本身的pH为7.0,70%乙醇即为pH7.0的解吸液,不需要再用10%NaOH溶液调pH,即加0mL的NaOH溶液即可),解吸同样条件(pH5.0,NaCl浓度1.5mol·L-1)吸附饱和的4根树脂柱,流速均为2.5BV·h-1,其解吸率见图4;洗脱液颜色依次为亮黄色,棕色透明,棕红色不透明、有沉淀,黑红色不透明、多沉淀。图4结果表明,洗脱液的pH愈高,其解吸率也愈高,但从洗脱液的颜色及沉淀多少可以看出,pH愈高,洗脱的杂质及色素也愈多,随着pH增加,同时带来了更多的、本应该需要除去的杂质及色素等。杂质过多必然严重影响总皂苷纯度,而且碱度过大,又可能对工艺设备、树脂及总皂苷产品造成不同程度的损害。从图4可见,pH为7.0与8.0时,两者解吸率差别也不大,而且pH为7.0时洗脱液的颜色较浅、透明,提示其杂质、色素较少,故综合考虑,pH还是以7.0为宜。5总皂苷的吸附和解吸性能本研究从4种大孔吸附树脂中筛选出的HPD100非极性树脂,在室温、吸附液pH为5.0,NaCl浓度为1.5mol·L-1和