一种强化微生物降解多环芳烃的方法及微生物菌剂与流程

一种强化物降多环芳烃法及生物剂与1.本发明涉及种强化微生物降多环芳烃的方法，于环境污染生物理技术领域，主要用废水、土壤等多芳烃污染环境的复处理。背技：2.多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbons,pahs)是土壤沉积物、水和大气环境中广泛出的污染物，主来源于人类活动包括化石燃料不完燃烧、工业排放、车尾气等。环境的多环芳烃污染有致癌、致畸和诱作用，对人类健康成潜在风险。多芳烃污染修复是利于人体健康和生系统可持续发展的要环境问题。3.微生物修复一种成本低、效好和环境友好的修方法。但是直接污染土壤等环境中投降解菌的修复方，降解菌活性低降解效果不理想。4.中国专利申公开号为cn104492804a的有技术公开了臭氧处理强化微生物降解修复污染壤的系统及方法针对多环芳烃污土壤，首先采用臭预处理，再向反应器中添加生物表活性剂和液态培基、进行联合降解定期取样测定直至复完成。其采用氧预处理和生物面活性剂增溶技术强化微生物降解联技术，克服了单技术的局限性，操作简便，成本低，运行周期短，去效果好，多环芳的去除率达93％以上，且不产生二污染，大大削弱了环芳烃污染土壤人体和环境的危，为土壤修复提供新的思路。充分利了臭氧预处理、物表面活性剂增强化以及土著微生自身降解作用的相合，使得各种技互为补充，臭氧处理使得后端生物解的修复效果得以高，多环芳烃的除率达93％以上，同时也缩短了修周期。该方法对多芳烃污染土壤进臭氧预处理的步在实验室中容易实，但其难以适用于接针对大面积受染的土体的原位理。技实要素：5.1.要解决的题6.针对现有技中微生物降解多芳烃的效率有限的术问题，本发明供一种强化微生物降多环芳烃的方法通过利用阳离子性蒙脱土调节微生关键酶活性以及矿-微生物界面生物化学过程，从而强微生物生长代等生命活动，进而高污染物的降解率7.2.技术方案8.一种强化微物降解多环芳烃方法，包括将微生接种于阳离子改蒙脱土的步骤；所述生物包括mycobacteriumsp.njs-1，保藏于中国普微生物菌种保管理中心，保藏cgmcc1.10964。本发明通过利用阳离子性蒙脱土调节微物提供微生物生介质，表面阳离子响关键酶活性以及物-微生物界面生物化学过程，从而强微生物生长代等生命活动，进而高污染物的降解率9.优选地，所阳离子改性蒙脱包括fe(iii)改性蒙脱土、co(ii)改性蒙脱土、na(i)改性蒙脱土中一种或多种，特优选fe(iii)改性蒙脱土。10.优选地，所述环芳烃包括芘、并[a]芘、菲、荧蒽、蒽中的一种多种。[0011]优选地，具体包以下步骤：[0012]s1采用灭菌营肉汤培养基培养扩繁mycobacteriumsp.njs-1菌，随后用灭ph7.0磷酸盐缓冲液清洗液并调节细菌数或细菌密度达到特定值；[0013]s2向阳离子改蒙脱土中加入灭无机盐培养基，后接种步骤s1所述mycobacteriumsp.njs-1菌；[0014]s3将接种菌后阳离子改性蒙脱与含有多环芳烃污染物在适当条件混合培养，降解多环烃；[0015]或[0016]s1采用阳离子性蒙脱土吸附固含有多环芳烃的染物；[0017]s2采用灭菌营肉汤培养基培养繁mycobacteriumsp.njs-1菌，随后用灭ph7.0磷酸盐缓冲液清洗液并调节细菌数或细菌密度达到特定值；[0018]s3向吸附有污物的阳离子改性脱土中加入灭菌机盐培养基，随后种步骤s2所述mycobacteriumsp.njs-1菌在适宜条件混合培养，降解环芳烃。[0019]优选地，通过离交换法制备阳离饱和改性蒙脱土选取蒙脱土k10，研磨过筛，所述过筛筛孔大小为不小200目。[0020]优选地，所述阳子改性蒙脱土通离子交换法制备具体包括：[0021]a)蒙脱土与金阳离子的氯化物液固液比为1:20；[0022]b)金属阳离子量浓度为0.1n；[0023]c)采用离子交法，交换次数不于2次；[0024]d)每次交换震平衡时间不小于2h；[0025]e)交换完成后用超纯水清洗4次以上直无cl-。[0026]优选地，所述降菌为mycobacteriumsp.njs-1，分离自多环芳污染农田，能以芘为唯一碳源长，并能降解苯a]芘、菲、荧蒽、蒽等[0027]优选地，所述降菌mycobacteriumsp.njs-1扩繁条件包括好氧培养，在灭营养肉汤培养基接种适量菌液，℃和160rpm避光件下培养过夜；灭菌ph7.00.1m磷酸盐缓冲液清两次，调整菌密度为od600＝0.30。[0028]优选地，所述步s2或s3降解体系改性蒙土与无机盐培养固液质量比为1:(20～100)，mycobacteriumsp.njs-1菌株接种稀释od600不小于0.03。[0029]优选地，相对于添加铁离子改性脱土的原始菌密，铁离子改性蒙脱使mycobacteriumsp.njs-1菌种的菌密度1～3d内提高3倍以上。[0030]一种微生物菌剂包括mycobacteriumsp.njs-1，保藏于中国普微生物菌种保管理中心，保藏cgmcc1.10964；还包括铁离子改性蒙脱。阳离子改性蒙土能够显著促进解菌mycobacteriumsp.njs-1生长，提高关键酶性以及生物电化活性。[0031]优选地，所述铁子改性蒙脱土中离子的交换率在50％～100％范内。[0032]3.有益效果[0033]相比于现有技术本发明的有益效为：[0034](1)蒙脱土特有的比表面积及孔隙构能影响微生物的布、调节微生物性，并缓解不利环(重金属、有机染物等)对微生物造成的胁压力；蒙脱土与微生物的相互作可以获得更好的存竞争力和更有的微生物活性，从在一定程度上强化目标污染物的生修复作用；阳离改性蒙脱土具有亲特征，具有较强“离子-π键”交互作，有利于微生物污染物的附着和布；本发明通过利阳离子改性蒙脱土节微生物关键酶性以及矿物-微生物界面生物化学过程，基于脱土、微生物及环芳烃的相互作用利用蒙脱土表面固的阳离子调节矿电化学特性，促微生物在矿物表面长形成生物膜，提微生物-矿物-污染物间的生物化学过程，达到化微生物降解多芳烃的目的；[0035](2)本发明的铁离改性蒙脱土用于化微生物降解多环烃具有突出的效，这可能是由于fe是一氧化还原蛋白的基，通过自身价变化来调控酶性以及传递电子，时可以作为胞外子受体，在微生-矿物界面生物电学过程中发挥重作用；从菌密度增长可以得知铁离改性蒙脱土对微生具有较强亲和力能够促进微生物长；从过氧化物酶性、双加氧酶活及电子传递活性果可以得知，铁子改性蒙脱土能够效强化微生物氧化原酶和生物电化活性；[0036](3)本发明的铁离改性蒙脱土和微物共培养后，制作微生物菌剂，操简单，不产生二次染，铁离子改性脱土对微生物生化学过程具有显著促进作用，菌剂可用于土壤和污水环境原位生物修。附图说明[0037]图1为本发明实施1中不同阳离子改性蒙脱土存下接种微生物()和不接种微生物(-)条件下降解芘的力学曲线(芘初始浓度15mg/l)，mt为改性蒙脱土在接菌条件下的处理[0038]图2为本发明实施1中不同阳离子改性蒙脱土存下培养不同时间微生物对芘的降解率(芘始浓度100mg/l)，其中blank为接种菌且不加蒙土的处理，mt为未性蒙脱土且未接种的处理；[0039]图3为本发明实施2中不同阳离子改性蒙脱土存下芘降解过程中a：菌密度变化；b：过氧物酶活性变化；c：双加氧活性变化；d：菌密度芘降解率的关系；e：过化物酶活性与芘解率的关系；f：双加氧酶活性与降解率的关系；[0040]图4为本发明实施2中不同阳离子改性蒙脱土存下芘降解过程中生物电化学活性(a:电子递活性及b：电子传递容量)变化其与芘降解的关。具体实施方式[0041]除非另有定义，文所使用的所有技术和科学术语属于本发明的技术域的技术人员通常解的含义相同；文所使用的术语“和/或”包括个或多个相关的所列项目任意的和所有的合。[0042]实施例中未注明体条件者，按照规条件或制造商议的条件进行。所试剂或仪器未注明产厂商者，均为以通过市售购买得的常规产品。[0043]浓度、量和其他值数据可以在本中以范围格式呈。应当理解，这样范围格式仅是为了便和简洁而使用并且应当灵活地释为不仅包括明确述为范围极限的数值，而且还包括盖在所述范围内所有单独的数值子范围，就如同每数值和子范围都被确叙述一样。例，约1至约4.5的数值范围应当解释为不仅包括明确叙的1至约4.5的极限值，且还包括单独的字(诸如2、3、4)和子范围诸如1至3、2至4等)。同的原理适用于叙述一个数值的范围，诸如“于约4.5”，应当将其解释为括所有上述的值范围。此外，无论所描述范围或特征的广如何，都应当适这种解释。[0044]以下结合附图和例对本发明的具实施作进一步说，但本发明的实施和保护不限于此。需出的是，以下若未特别详细说明过程，均是本领域术人员可参照现有术实现或理解的所用试剂或仪器注明生产厂商者，为可以通过市售购得到的常规产品[0045]作为举例，以下施例中采用芘和枝杆菌mycobacteriumsp.njs-1进行实验。所菌株是以芘为唯碳源的降解菌，自中国普通微生菌种保藏管理中心，革兰氏阳性菌。[0046]实施例1[0047]一、阳离子改性脱土的制备[0048]阳离子改性蒙脱制备过程，包括下步骤，具体为[0049](1)蒙脱土的前处[0050]将蒙脱土研磨，200目尼龙筛。[0051](2)离子交换法制阳离子改性蒙脱[0052]称取3.0g蒙脱置于一系列100ml离心管中，别加入60ml超纯水超分散清洗两次，随后入60ml当量浓度为0.1nnacl,cucl2，，nicl2，fecl3，加盖后于25℃，160rpm震荡平衡2h，然后4000rpm心10min，弃去上清液，分别再加入60ml0.1n上述金属离子溶液，在25℃，160rpm震荡平衡2h，以达蒙脱土完全被阳离子饱和的的。样品离心后弃上清液，加入60ml超纯水荡清洗5min，然后4000rpm离心10min，去上清液，相方法再重复清洗3次以洗去弱结合态离子和cl-离子。样品60烘干，研磨过200目尼龙筛制得不同阳离子饱改性蒙脱土，储存于玻璃剂瓶备用。改性脱土中阳离子含及交换率如表1所示。[0053]表1改性蒙脱土金阳离子含量(mg/kg)及交换[0054][0055]二、多环芳烃污阳离子改性蒙脱[0056]使多环芳烃与阳子改性蒙脱土混，包括以下步骤具体为：[0057]称取0.2g第一中阳离子改性蒙土于50ml玻璃离心管，加入0.4ml丙酮配置的芘溶液(浓度500mg/l或5000mg/l)，轻轻匀，然后静置与风橱中，待丙酮完全挥发制得芘含量为1mg/g或10mg/g的污蒙脱土。[0058]三、降解菌的培扩繁[0059]降解菌的活化和繁，降解菌为mycobacteriumsp.njs-1，保藏于中国普微生物菌种保管理中心，保藏cgmcc1.10964。该菌分离筛选自多环芳污染农田，能够芘为唯一碳源和源生长。活化和扩包括如下步骤，具为：[0060]将保存于-80℃甘油中的解菌解冻，接种灭菌的营养肉汤培基中，接种比例每100ml培养基接0.2ml保藏液，随后于28，160rpm好氧避光培养过，待菌株生长至对数，取出，转移至菌离心管中5000rpm离心收集下菌体，然后采用灭菌磷盐缓冲液(ph7.0)清液2次，新悬浮后调节细密度使得od600＝0.30,菌数量约为1.6×108cfu/ml。[0061]四、阳离子改性脱土表面芘的微物降解实验[0062]阳离子改性蒙脱表面芘的微生物解，包括如下步，具体为：[0063]在50ml玻璃离管中向第二项所芘污染的改性蒙脱中加入灭菌无机培养基，随后接种第项中降解菌，接后使细菌密度od600不小于0.03。降解体系中改性蒙脱土无机盐培养基溶质量比为1:50(1:20～1:100均)。然后置于28℃，160rpm恒温摇床光培养。培养不时间后采用有机剂提取，高效液相色谱(hplc)法定提取液中剩余的含量，绘制降解力学曲线(图1)，并计算芘解率。如表2所示，零级力学和一级动力均能较好表征芘降解规律。芘(c015mg/l)在5天内降解率达95％以上，fe(iii)改性蒙脱土处理效果最优在3天后降解率达到93.6％，其为na(i)和co(ii)性蒙脱土的处理，5天降解率均高于95％。如图2，当浓度增大到100mg/l时，fe(iii)、co(ii)、改性蒙脱土处理在16天内降解率达95％以上，而不加蒙脱的处理降解率仅不到60％。以上结果说明阳离子改的蒙脱土(特别是fe(iii)性蒙脱土)处理够显著强化芘的生物(mycobacteriumsp.njs-1)降解效果。某些对微生物生和代谢不利的阳离如cu(ii)、ni(ii)等阳离子改性蒙脱土抑制该降解菌对的降解。[0064]表2阳离子改性蒙土表面芘微生物解动力学参数(c0＝15mg/l)[0065][0066]实施例2[0067](一)阳离子改蒙脱土促进微生物生长的究[0068]阳离子改性蒙脱促进微生物生长研究，包括如下骤，具体为：[0069]采用实施例1的方构建微生物-矿物(mycobacteriumsp.njs-1-阳离子改性蒙脱土降解芘(c0＝15mg/l)的培体系，在培养第1天和3天分析微生物生长状，采用方法为平计数法，具体过为：吸取0.1ml培养液于9ml无菌水中，匀，通过逐级稀法稀释样品，稀释至104和倍，别吸取0.1ml稀释后的品接种到无菌营肉汤固体培养基，涂布均匀后的养皿倒置于28℃培养箱中培养48h，然后对形成的菌落进计数，获得细菌长密度变化。结如下(图3a)：培养1天和3天后，相对于添加铁离子改性脱土的原始菌密度阳离子改性蒙脱的处理cfu较接种分别增长了3～4倍和8～10倍，与芘降解率密切关(图3d)，表明离子改性蒙脱土进了降解菌的生，其中fe(iii)改性蒙脱土的强化处理效最好。[0070](二)阳离子改蒙脱土强化微生降解酶活性的研究[0071]阳离子改性蒙脱强化微生物降解活性的研究，包如下步骤，具体为[0072]采用实施例1的方构建微生物-矿物(mycobacteriumsp.njs-1-阳离子改性蒙脱土降解芘(c0＝15mg/l)的培体系，在培养第1、3、5天测定双加氧酶活性和子传递活性及容，具体方法如下[0073](1)过氧化物酶活：具体过程为：取0.2ml样品液，加入2ml含有5mm的二羟基苯丙氨酸(-dopa,ph7.0pbs缓液配制)和0.1％h2o2，在28℃下养1.5小时后，用光光度法在460nm波长检测产物的生量(ε460＝37000m-1cm-1)。结果显示图3b)：不同阳离子改性蒙脱的处理过氧化物活性随芘降解呈现不同的变规律，fe(iii)改性蒙脱土的理过氧化物酶活始终处于较高的水平。[0074](2)双加氧酶活性(儿酚2,3双加氧酶catechol2,3-dioxygenase，c23o)具体过程为：吸0.2ml样品液，加入1ml有0.5mm的儿茶酚(pbs冲液配制，ph7.0)在28下培养4小时后，用分光度法在375nm波长下检产物的生成量(ε375＝36000m-1cm-1)。结果显示图3c)：随着芘的逐渐降解，加氧酶活性升高降解第5天酶活性达到最大其中fe(iii)和na(i)改性蒙土的处理双加氧活性最大。[0075]通过相关分析可发现芘降解过程细菌过氧化物酶性与芘降解率(图3e)，以及双加氧酶活与芘降解率(图3f)具有显的相关关系，表明高关键酶活性是阳离子改性脱土增强芘降解一个主要途径。[0076](三)阳离子改蒙脱土强化微生生物电化学活性研[0077]阳离子改性蒙脱强化微生物生物化学活性研究，括如下步骤，具体：[0078]采用实施例1的方构建微生物-矿物(mycobacteriumsp.njs-1-阳离子改性蒙脱土降解芘(c0＝15mg/l)的培体系，在培养第1、3、5天测定双加氧酶活性和子传递活性及容，具体方法如下[0079](1)电子传递活性(electrontransportsystemactivity，etsa)：吸0.5ml样品液，加入0.5mlpbs冲液(ph7.0)0.5ml碘硝基四唑紫(int，0.1)，30℃避光培养培养结束后加入5ml甲醇止反应，提取产甲臜(intf)，然后采用分光度计490nm处测定产物吸光度根据标准曲线计产物intf。电子传递活性以单时间内生成的intf来表示。果显示(图4a)，na(i)改性蒙脱土处理电子传活性随芘降解而加，而fe(iii)改性蒙脱土处理下降趋势，总的来说fe(iii)性蒙脱土的处理子传递活性高na(i)改性蒙脱土，这可能是由于fe是一氧化还原蛋白的基，通过自身价变化来调控酶性以及传递电子，时可以作为胞外子受体，在微生-矿物界面生物电学过程中发挥重作用，因此，铁子改性蒙脱土界面降解速度更快。[0080](2)电子传递容量采用电化学工作，记录样品电流时(i-t)曲线，测量品供电子能力(edc)。体过程如下：向解池中加入9mlpbs缓冲液(ph7)和0.1m的kcl，平衡所的氧化还原电位至0.61v，随后加入0.1ml的电子转移质abts(10mm)出氧化峰电流，再达到恒定的背景电后，向电解池中入0.1ml样品液，现样品氧化峰电流通过如下公式计样品电子供给能力[0081][0082]其中v为样品体积iox为基线校正后的氧化电，f为法拉第常数(f＝96485cmol-1)，edc单位μmole-ml-1。结果显示(图4b)：阳离子改性蒙脱土-微生物降解系统有较高电子供给力，随芘降解先高后降低，fe(iii)改性蒙脱土的处理电供给能力初期稍于na(i)改性蒙脱土，但在后期相反。结果说明随着芘解，降解系统供子能力先增加后小。结合以上结果以得知，阳离子改蒙脱土通过调控解酶活性和生物化学活性强化芘降。[0083]以上结果表明fe(iii)co(ii)、na(i)金属阳离子改性脱土能够通过促微生物生长和关酶代谢活性，促矿物-微生物间的电子递等生物电化学程，进而强化对环芳烃(芘)的降解，其中以fe(iii)改蒙脱土的强化效果好，在土壤污染复中具有较好的应潜力。[0084]在一些实施例中阳离子改性蒙脱强化微生物降解用采用如下的方法实现：[0085]s1采用灭菌营肉汤培养基培养繁mycobacteriumsp.njs-1菌至细菌数量细菌密度达到特值；s2向阳离子改性蒙脱土中加灭菌无机盐培养基，随接种步骤s1的mycobacteriumsp.njs-1菌；s3将接菌后的阳离子改蒙脱土加入含有多芳烃的污染溶液行混合培养，降解多芳烃，例如芘，对于单独的mycobacteriumsp.njs-1菌直接用于降芘，具有更高的解率；且相对于改性的蒙脱土与mycobacteriumsp.njs-1菌混合后降解，具有更高的降率。[0086]在一些实施例中采用不同批次制的铁离子改性蒙土来强化微生物降作用，其中铁离子交换率在50～100％范围，相对于单独的mycobacteriumsp.njs-1菌直接用于降芘，具有更高的解率；且相对于改性的蒙脱土与mycobacteriumsp.njs-1菌混合后降解，具有更高的降率。[0087]以上实施例仅为发明较优的实施式，仅用于解释发明，而非限制本明，本领域技术员在未脱离本发精神实质下所作改变、替换、修饰均应属于本发明的护范围。技特：1.一种强化微物降解多环芳烃方法，其特征在于包括将微生物接于阳离子改性蒙脱土步骤；所述微生包括mycobacteriumsp.njs-1，保藏于中国普微生物菌种保管理中心，保藏cgmcc1.10964。2.根据权利要求1所述的化微生物降解多芳烃的方法，其特在于，所述阳离改性蒙脱土包括fe(iii)、co(ii)或na(i)改性蒙脱土的一种或多种。3.根据权利要求2所述的化微生物降解多芳烃的方法，其特在于，所述多环烃包括芘、苯[a]芘、菲、荧蒽、蒽中的种或多种。4.根据权利求1所述的强化微生物降多环芳烃的方法其特征在于，包以下步骤：s1采用灭菌营养肉汤培养基养扩繁mycobacteriumsp.njs-1菌，随后调节菌数量或细菌密达到特定值；s2向阳离子改性蒙土中加入灭菌无机盐培基，随后接种步s1所述mycobacteriumsp.njs-1菌；s3将接菌后的阳离子改蒙脱土与含有多环烃的污染物在适条件下混合培养，降多环芳烃；或s1采用阳离子性蒙脱土吸