DB34T 4487-2023 水禽坦布苏病毒和星状病毒双重PCR检测技术规程

发布安徽省市场监督管理局2023发布安徽省市场监督管理局2023083120230731TechnicalregulationfordoublePCRdetectionmethodofwaterfowlTembusuvirusandAstrovirus34CCSB3134安 徽 省 地 方 标 准DB34/T4487—2023PCRIDB34/T4487—2023I前 言本文件按照GB/T《标准化工作导则 第1部分标准化文件的结构和起草规则的规起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由安徽农业大学提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。心、定远县畜牧兽医局、合肥华盟生物技术有限公司、安徽省皖西白鹅原种场有限公司。段倩倩、伍唯、张新。1PCR扩增仪。台式低温高速离心机：最大离心力17000g以上。电泳仪：电压10-300V,电流4-400mA,功率最大75W。1PCR扩增仪。台式低温高速离心机：最大离心力17000g以上。电泳仪：电压10-300V,电流4-400mA,功率最大75W。20×20-21×26cm,302nm。4 主要仪器设备星状病毒 Astrovirus星状病毒(Astroviruses,AstV)RNA25～35nm。5～6个突起，结构呈星形，故称之为星状病毒。肠炎、肾炎及尿酸盐沉积等症状，是引发雏鹅痛风的重要原因之一。坦布苏病毒 Tembusuvirus坦布苏病毒(Tembusuvirus,DTMUV)属于黄病毒科(Flauiviridae)、黄病毒属(Flaoivirus)。坦苏病毒病(Tembusuvirusdisease):通常会引起严重的产蛋率下隆、共济失调，卵巢出血、发炎的现象。下列术语和定义适用于本文件。3 术语和定义水禽坦布苏病毒和星状病毒双重PCR检测技术规程范围本文件规定了水禽坦布苏病毒和星状病毒双重PCR品、操作步骤、结果判定、生物安全管理及废弃物处理。本文件适用于水禽坦布苏病毒和星状病毒核酸检测。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方GB19489 实验室生物安全通用要求NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T1948 兽医实验室生物安全要求通则SN/T4835 实验室生物废弃物管理要求2样品的采集与处理样品采集应按照NY/T541的规定执行，无菌采集感染或病死禽类各种组织与器官（肝脏、脾脏、肾脏）。2样品的采集与处理样品采集应按照NY/T541的规定执行，无菌采集感染或病死禽类各种组织与器官（肝脏、脾脏、肾脏）。样品处理取待检组织样品适量（1g)，按1:5倍（W/W)加入无菌0.1MpH7.4PBS，于灭菌并烘干的研钵或组织匀浆器中充分研磨，反复冻融3次后，4℃8000rpm/min离心20min，取上清1mL转至无菌的1.5mL离心管中，编号备用。7 操作步骤扩增星状病毒（GAsTV）的引物，扩增DNA片段大小为300bp。——上游引物：5'-AGAAGGTGCGGAAGAGTGGTATGA-3'——下游引物：5'-GCGAAGAGTGCGTAAGAGGTTGT-3'扩增坦布苏病毒（DTMUV）的引物，扩增DNA片段大小为404bp。——上游引物：5'-CTGATGGCTTTGGTCCTGTTC-3'——下游引物：5'-ACACCTATTCTCACCACATCTAAC-3'阴性对照品：灭菌超纯水。阳性对照品：坦布苏病毒cDNA和星状病毒cDNA。6 引物与标准品：-20℃；-80℃微波炉。0.001g水浴锅。微量移液器：2.5µL、10µL、20µL、200µL、1000µL。超净工作台。5 试剂RNA：TrizolRNA氯仿、异丙醇、无水乙醇：为分析纯。ReactionBuffer(5dNTPRNaseInhibitor20U/µL)、RandomHexamerprimer。1×TAEA。0.1MpH7.4PBS：ADNA1％A。GB/T6682，121℃、20min，高压蒸汽灭菌。ddH2O：双重蒸馏水。DB34/T4487—2023RNATrizolRNA200µL1mLTrizolEP，4℃10～20min,轻轻颠倒混匀。加入200µL5min；12000rpm4℃离心15min，吸取上清于新EP加入750µL10min；12000rpm4℃离心10min，吸弃上清，留下沉淀。1mL，轻轻颠倒，洗涤管壁；12000rpm4℃离心10minEP2～3min，ddH2O，-80℃保存备用。反转录（cDNA）PCR11µLRNA，4.0µLReactionBuffer(5×)，2.0µLdNTPMix，1.0µL反转录酶，1.0µLRNaseInhibitor(20U/µL)、1.0µLRandomHexamerprimer。PCR25℃10min，42℃1h，-20℃保存备用。PCRPCR总体积为20µL，2×TaqPlusMasterMixII(DyePlus)10µL，DTMUV和GAsTV上游引物各0.5µL，DTMUV和GAsTV下游引物各0.5uL，反转录产物2µL添加ddH2O至20µL。PCR预变性95℃3min，变性95℃15s，退火52℃20s，延伸72℃15s，循环30次，延伸72℃5min。每次PCR均应设阳性对照和阴性对照。电泳1.0％琼脂糖凝胶板。5µLPCR产物，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。加入分子量标准。90V左右，电泳30～40min。PCR片段大小。结果判定在阳性对照出现300bp，404bp（见附录B）。300bp404bp300bp404bp300bp404bp生物安全管理及废弃物处理生物安全管理和废弃物处理应按照GB19489、NY/T1948和SN/T4835的规定执行。34在微波炉加热至完全融化沸腾后，加入核酸染料2µL，混匀后铺板。4在微波炉加热至完全融化沸腾后，加入核酸染料2µL，混匀后铺板。A.3 0.1MPBS（pH7.4）的配制氯化钠 8.0gNa2HPO4.12H20 2.9gKCL 0.2gKH2PO4 0.2g用灭菌超纯水定容至1L，调节pH至7.4。0.4g40mLA.2 1％琼脂糖凝胶琼脂糖（电泳级）1×TAE附录A（资料性试剂配制1×TAE50×TAE缓冲液50×TAE缓冲液Tris 121gNa2EDTA.2H20 18.6g冰乙酸 28.55mL灭菌超纯水 定容至500mL1×TAE缓冲液于10mL50×TAE缓冲液，加入490mL灭菌超纯水，混匀后即可。5星状病毒阳性对照