第十三章：基因工程的操作过程

第十三章基因工程的操作过程基因工程操作的基本过程目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因，即准备要分离、改造、扩增或表达的基因。一、目的基因的获取已知基因的获得目前目的基因的获取方法主要有以下2类：PCR分离法化学合成法未知基因的获得直接分离法基因文库分离法已知基因的获得如果知道目的基因的全序列或其两端的序列，通过合成一对与序列互补的引物，就可以十分有效的扩增出所需的目的基因。模板可以是基因组DNA，也可以是mRNA序列，或是已克隆到某一载体上的基因片段。PCR分离法采用PCR分离目的基因省时、省力，但他一般要求待扩增的片段是已知的，至少要求DNA片段两端长约20bp的序列已知的，这样才能设计出有效的引物。PCR扩增的片段需要进行测序以便进一步验证扩增片段是否为目的基因。化学合成法对于基因比较小，核苷酸序列已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。磷酸二酯法磷酸三酯法固相亚磷酸三酯法未知基因的获得直接分离法限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。应用对象：适合于从简单的基因组中分离目的基因，如质粒或病毒的大小只有几千碱基，大的也超不过几十万碱基，编码基因比较少，获得也比较简单。对已定序列的DNA分子，只需要用已知识别序列的限制性内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需要的DNA片断，与适当载体连接。对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的酶切识别位点，一次就可以获得。即使含目的基因的DNA分子未定序或定位，也只须通过酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，从中调出目的基因。随机片断化限制性内切酶局部消化法机械切割法超声波---可使其断裂成约300bp的随机片断高速搅拌---1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断基本原理：DNA分子的两条链存在着G≡C、A＝T碱基配对，其中GC间存在3个氢键、AT间存在2个氢键，如果不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等也明显不同，采用相应的方法即可达到从生物基因组中分离目的基因的目的。物理化学法密度梯度离心法---由于富含碱基GC的双链DNA片段浮力密度较大，利用精密的密度梯度超速离心技术可使切割成适当片段的不同DNA按密度大小分离开来。然后通过与某种放射性的mRNA杂交来检验，分离相应的基因。非洲爪瞻5SDNA和海胆组蛋白基因就是根据此分离得到。单链酶解法---DNA分子中某基因片段GC碱基含量高，则其热稳定性高，即其解链温度（Tm）值就高。据此，可以通过控制解链温度使富A=T区变性解链，而富G≡C区的DNA的片段仍为双链。海胆rDNA分子内GC含量可高达63%，通过热变性和S1酶解处理可得到提纯50倍的rDNA。分子杂交法---单链DNA与其互补的序列总有“配对成双”的倾向，这是分子杂交的原理。1969年，美国哈佛大学Beckwith等应用DNA-DNA分子杂交，成功分离了β-半乳糖苷酶基因。基因文库分离法基因组文库（genelibrary）是指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体形式出现。某生物DNA片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落（或噬菌斑）（或成活细胞）即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。基因组文库使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来是分离克隆目的基因的主要途径复杂基因组作图的重要依据构建基因组文库的意义：细胞染色体大分子DNA的提取和大片段的制备；载体DNA的制备；载体与外源大片段连接；体外包装及基因组DNA文库的扩增；重组DNA的筛选和鉴定。基因组文库构建的一般步骤：N：克隆数目P：设定的概率值（如：0.99）x：插入片段平均大小（15～20kb）y：植物基因组大小（以kb计）基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。如果插入片段平均大小为20kb某植物基因组大小为4x106bp，P=0.99时，根据上式N≈1×105。含1×105个克隆的基因文库相当覆盖了500倍的基因组，在片段随机分布时，从文库中找到任一序列的概率不低于0.99。cDNA文库利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增。不含内含子序列。可以在细菌中直接表达。包含了所有编码蛋白质的基因。比DNA文库小的多，容易构建。cDNA文库的特点细胞总RNA提取并分离纯化出mRNA；合成cDNA第一链；将mRNA－DNA杂交分子转变成双链cDNA；双链cDNA重组到载体上。前3步为cDNA合成，第④步为cDNA克隆。cDNA文库的构建cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA所需要的克隆数目。N：克隆数目P：文库包含了完整mRNA的概率（99%）1/n：某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例筛选文库中目的克隆最常用的方法是探针杂交法。利用同源探针筛选目的克隆二、基因表达载体的构建用一定的限制性内切酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端；用同一种限制性内切酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端；将切下的目的基因片段和质粒用DNA连接酶连接，形成一个重组DNA分子（重组质粒）。vector构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。因此，一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子和标记基因等。三、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物，从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumorinducingplasmid），简称为Ti质粒。农杆菌介导法植物转基因的理论基础野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA区（transferredDNAregion），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulenceregion）。用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T-DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。农杆菌介导法：就是将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。基因枪法粒子轰击(particlebombardment)高速粒子喷射技术(High-velocityparticlemicroprojection)基因枪轰击技术(genegunbombardment)，是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。基本原理它具有应用面广，方法简单，转化时间短，转化频率高，实验费用低等优点。对于农杆菌不能感染的植物，采用该方法可打破载体法的局限。花粉管通道法是指在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。通过花粉管通道途径渗透进入胚囊的转基因片段就有可能被吸入受精卵细胞，并进一步地通过尚不明确的机理被整合进入受体基因组中。

优点：不依赖于植物组织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程。应用于任何开花植物，极大地扩大了基因工程目的基因的来源，和受体植物的范围。

利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞进行转化，直接获得的产品即是转基因植株。转化速度较快，转化效率可达1%左右，一般当年即可获得转基因植株。方法简便有效，易于常规育种工作者掌握，适合于大规模的农作物遗传化。缺点：工作时间受自然花期限制。在自然田间进行操作，受环境条件的影响很大。由于转基因以随机的方式整合进入受体染色体基因组中，转基因工程植株的后代的遗传情况较为复杂。操作的经验性很强，需要一定的技术摸索和技巧。对单籽粒的小花农