第一章 蛋白质结构

医学分子生物学

MedicalMolecularBiology第一章蛋白质结构Section1

Part1,氨基酸AminoAcid(AA)氨基酸是组成蛋白质的基本单位Aminoacidsarethebuildingblocksofproteins.氨基酸的结构Whatisthestructureofaminoacid?组成蛋白质的氨基酸仅有20种，且为α氨基酸。C,alpha-carbonatom(Cα)氨基酸的性质CharacteristicsofAminoAcid组成蛋白质的氨基酸都是L-α氨基酸

All20aminoacidsfoundinproteinsareL-α

-aminoacids.WhatisChiralcenterandD,Lnomenclature?不对称碳原子AllCαatomsofaminoacidsareasymmetriccarbonatomexceptGlycine.CharacteristicsofAminoAcid氨基酸在水中电离可呈酸性和碱性Aminoacidscanactasacidsandbaseswhendissolvedinwater.等电点pI,氨基酸在此pH值下为电中性。

ThecharacteristicpHatwhichthenetelectricchargeiszeroiscalledtheisoelectricpointorisoelectricpH,designatedpI.氨基酸的分类ClassificationofAminoAcidsAminoacidscanbeclassifiedbythepropertiesofRgroup.非极性疏水Nonpolar,AliphaticAAs(7)Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro,Met极性中性Polar,UnchargedAAs(8)Ser,Thr,Tyr,Trp,Asn,Gln,Cys,Gly酸性AcidicAAs(2)Glu,Asp碱性BasicAAs(3)Lys,Arg,HisClassificationofAminoAcids非极性疏水氨基酸Nonpolar,AliphaticAAs丙氨酸AlanineAla缬氨酸ValineVal亮氨酸LeucineLeu异亮氨酸IsoleucineIle蛋氨酸MethionineMet苯丙氨酸PhenylalaninePhe脯氨酸ProlineProClassificationofAminoAcids极性中性氨基酸Polar,UnchargedAAs甘氨酸GlycineGly丝氨酸SerineSer苏氨酸ThreonineThr酪氨酸TyrosineTyr色氨酸谷氨酰胺天冬酰胺半胱氨酸TryptophanTrpGlutamineGlnAsparagineAsnCysteineCysClassificationofAminoAcids酸性氨基酸AcidicAAs谷氨酸天冬氨酸Glutamicacid(Glu)Asparticacid(Asp)ClassificationofAminoAcids碱性氨基酸BasicAAs赖氨酸精氨酸组氨酸LysineLysArginineArgHistidineHisSomespecialAAs芳香氨基酸ArometicAAs

苯丙氨酸酪氨酸色氨酸PhenylalaninePhe，TyrosineTyr，TryptophanTrp

SomespecialAAs蛋氨酸（甲硫氨酸）半胱氨酸

MethionineMetCysteineCys

含硫氨基酸Section1

Part2,肽键和肽Peptidebondandpeptide组成蛋白质的氨基酸是由肽键连接的。Proteinsarecomposedofaminoacidsjoinedbypeptidebonds.一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的

α-氨基通过缩水反应，脱去一个水分子，形成肽键。carboxylgroupC-terminalaminogroupN-terminal肽键PeptidebondPeptideunitAminoacidresiduesPeptideunit肽和蛋白质PeptideandProtein肽peptidesand蛋白质proteinsarepolymersofaminoacids.

两个氨基酸形成的肽叫二肽，三个氨基酸形成的肽叫三肽，以此类推。一般十肽以下称寡肽（oligopeptide）;十肽以上者称多肽（polypeptide）;50个氨基酸以上组成的多肽链称

蛋白质（protein）。三、蛋白质的分类

(proteinclassification)根据功能分类：活性蛋白质：行使生物功能，运输和贮存蛋白结构蛋白质：起保护和支持作用Proteinfunctions•Enzymes:substratebinding,catalysis•Signaling:ligand,receptor•Transportandstorage:hemoglobin(血红蛋白)•Structureandmovement:collagen,keratin,tubulinincytoskeleton,actinandmyosinformusclecontraction•Nutrition:casein(酪蛋白)andovalbumin(卵清蛋白)•Immunity:antibodies•Regulation:transcriptionfactors（转录因子）根据结构的分类纤维状蛋白：由较为单一的重复二级结构组成球形蛋白：混合二级结构，多含有相对独立的结构域

1、纤维状蛋白：由2~3股α-helix相互缠绕而成的超螺旋，或称盘绕圈结构（coiledcoils），其氨基酸序列含7个残基组成的周期性重复，第1、4个残基多为疏水性氨基酸——纤维蛋白原由3条肽链形成的“三链螺旋”(triplehelix)——胶原蛋白由β-片层组成——蛛丝蛋白，蚕丝蛋白具有无定形结构的蛋白——弹性蛋白2、水溶性球形蛋白特征：（1）分子内部核心基本上是由疏水性残基组成，而表面存在的主要是亲水性残基（2）肽链折叠形成三维结构主要靠非共价作用3、膜蛋白特征：跨膜区段表面带有较多疏水残基，主要含有一个或多个螺旋或片层结构。膜外部分与一般水溶性球形蛋白相似Section2

蛋白质结构ProteinStructure一级结构PrimaryStructure二级结构SecondaryStructure三级结构TertiaryStructure四级结构QuaternaryStructureSection2

Part1,PrimaryStructureofProteinTheprimarystructureofaproteinisitslinearsequenceofaminoacidsandthelocationofanydisulfide(-S-S-)bridges.一级结构：蛋白质中氨基酸的排列顺序（序列）以及二硫键的位置。1953年，Sanger首先测定了牛胰岛素的一级结构TheprimarystructureofinsulineAchain:GIVEECCTSICSLYQLENYCNBchain:FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPLA细胞色素C（104AA)

保守：70-80不变，14、17Cys不变差异：人—黑猩猩相同猴子1猪-牛-羊相同酵母44鲸-猪牛羊1

猪牛羊10Section2

Part2,Secondarystructureofprotein蛋白质的二级结构（secondarystructure)是指某段多肽链中主链骨架在局部空间有规律的盘绕和折叠（regularfoldingofregions），肽平面绕Cα旋转，由于角度不同而产生的不同构象二级结构的结构单元1、α-螺旋(α-helix)2、β-折叠(β-pleatedsheet)3、β-转角(β-turn)4、无规卷曲(randomcoil)α-helix①α-helix是顺时针方向，即右手螺旋②螺旋一圈由3.6个氨基酸组成，螺距0.54nmα-helix(cont.)③每个残基的N-H与前面隔三个残基的C=O形成氢键，这是α-螺旋稳定存在的因素，氢键方向与螺旋中心轴方向平行,这样形成的氢键包围13个原子，故称3.613α-螺旋表示方法β-pleatedsheet③两段肽链可以是平行的，也可以是反平

行的。前者两条链从N端到C端是同方向，

后者是反向的。①β-折叠是多肽链中较为伸展的结构②它是由平行的两条或两条以上肽链或一

条肽链内部的两段肽链形成的。β-sheet平行反平行稳定因素是链间肽键的C=O与N-H形成的氢键。β-sheet(cont.)β-turn③第一个残基C=O与第四个残基的N-H形成氢键。①一条肽链形成180°回折的结构称β-转角②以四个残基（三个酰胺平面）构成为常见无规律性的那部分肽链的构象称无规卷曲。

结构模体（motif）

某些蛋白质的二级结构的肽段，在空

间上互相接近，形成一个特殊的空间构

象，呈现出一个二级结构的聚集体，称

之为结构模体，或基序。

结构模体具有特征性的氨基酸序列，并发挥特殊的功能。1、锌指结构Zincfingermotif

存在于许多结合DNA的转录因子蛋白中，每一个大约30个AA组成的重复序列中都在相同位置上含有2个Cys和2个His，与一个Zn2+形成配位键。

Cys2His2,Cys4钙离子结合蛋白,DNA结合蛋白中常见模序（螺旋-环-螺旋）由两个相互垂直的螺旋以及之间的连接环组成，Ca2+结合在环上2、亮氨酸拉链Leucinezipper

某些肽段上每7个AA出现一个Leu，连续8个这样的周期。这样的肽段以a-螺旋存在时，所有的Leu都沿螺旋排列在一条直线上。两条这样的a-螺旋上的Leu可以像拉链一样相互交叉在一起，使蛋白二聚化核苷酸结合模序bab单位由两个相互平行的b链，以及一个连接他们的a螺旋组成核苷酸总是结合在b链的C端和a螺旋的N端Section2

Part3,三级结构指在二级结构、motif的基础上，由于侧链R基团的相互作用，整条肽链进一步折叠和盘曲成球状分子，即整条肽链所有原子在三维空间的排布位置。由一条多肽链组成的蛋白质，只有具有完整的三级结构才具有生物活性。稳定三级结构的因素包括侧链R间的共价键（主要是二硫键）及R之间的非共价键（包括氢键、疏水键、离子键和范德华力）。结构域（domain）

分子量大的蛋白质三级结构，常常由两个

或数个球状或纤维状的区域组成，每个区

域的结构和功能相对独立，称为domain

。结构域由100-200个氨基酸残基组成。

各个结构域自身折叠得很紧密，有疏水核心和极性表面，如同一个小的球状蛋白。结构域间的关系相对松弛，以无规卷曲连接，形成所谓“铰链区”。Whatis‘domain’?不同的蛋白质分子中其结构域的数目不同，同一蛋白质中几个结构域可彼此相似或完全不同。球形蛋白三级结构的构象特点疏水基团在分子内部形成一结构区域，较紧密；结构区域之间为松散的无规卷曲含a-螺旋的多较稳定，含b-折叠多的蛋白稳定性稍差，但是与其生物学功能关系密切有的含有辅基，协助行使生物学功能Section2

Part4,四级结构Quaternarystructure由两条或两条以上具有独立三级结构的多

肽链以非共价键连接的空间排布和接触部

位的布局称蛋白质的四级结构。维系亚基间聚合成四级结构的力量是氢键、疏水键、离子键和范德华力。相同亚基构成的四级结构称均一四级结构，

由不同亚基构成的则称为不均一四级结构具有四级结构的蛋白质的每条具有独立三级

结构的多肽链称为亚基或亚单位（subunit）。§3.蛋白质变性proteindenaturalization蛋白质在某些理化因素的作用下，空间结构发生改变,导致生物学功能丧失,理化性质发生改变,称为蛋白质的变性。仅空间结构发生变化，而一级结构不改变1、鉴定（1）测定蛋白质活性，如酶活（2）测物理性质：O.D.，粘度，溶解度，圆二色性，电泳迁移率等（3）测化学性质：颜色反应（变性后加强）（4）免疫法测抗原性2、变性因素温度热变性pH——破坏盐键有机溶剂——削弱疏水作用尿素，盐酸胍——氢键，疏水作用表面活性剂

SDS与蛋白质结合后使其表面带有大量负电荷，非常稳定地溶解于水中2、蛋白质的复性（renaturation）蛋白质较轻程度的变性后，去除变性因素后，仍可恢复或部分恢复其原有的空间结构与功能（天然活性），称为复性。第二章蛋白质研究方法蛋白质研究对象的选择和样品的获取蛋白质检测和鉴定蛋白质结构分析蛋白质生物学功能分析蛋白质研究的发展趋势一、蛋白质研究对象的选择和样品的获取1、研究对象的选择往往是组织中含量较高，相对比较稳定的蛋白质，不过一些新的蛋白质正在成为研究者的目标直接从生物组织中提取、纯化蛋白根据基因组测序获得的信息，获取有关基因的cDNA全序列，再通过重组DNA技术去表达重组蛋白质2、蛋白质的提取破碎细胞：通过机械的方式，如研磨、超声、高压等去垢剂处理溶解膜蛋白许多蛋白质在体内与质膜结合，需要以去垢剂分离包括：脱氧胆酸钠，SDS，TritonX-100,NP-40稳定从细胞中释放的蛋白加蛋白水解酶抑制剂：PMSF,Leupeptin,Aprotinin

低温操作去除细胞碎片——离心离心悬浮在溶液中的各种粒子沉降速度是不一样的，质量越大、密度越高的粒子沉降速度越大。相对离心力（×g)：

RCF=F离心力/F重力=mω2x/mg=ω2x/gg=980cm/s2

RCF=1.119×10-5n2x

n:转数/分，x:悬浮粒子离转轴的距离（厘米）沉降速度dx/dt=d2(ρp-ρm)ω2x/18η（eta）沉降系数：单位离心力作用下粒子的沉降速度（Svedberg单位，1S=10-13s）3、蛋白质纯化目的：把目标蛋白单独分离出来以供研究使用方法：根据蛋白质自身性质，可以采用多种方法分子大小：凝胶分子筛层析溶解度：盐析电荷：离子交换层析，等电点沉淀，电泳特异亲和性：亲和层析基因表达（1）盐析(saltingout):盐溶：溶液中离子强度较低时，蛋白质溶解度随着盐浓度的增加而增加盐析：当溶液离子强度较高时，蛋白质溶解度随盐浓度的增加而降低常用盐：Na2SO4,(NH4)2SO4;透析或凝胶层析去除（2）离子交换层析（ion-exchangechromatography）利用表面带电荷的基团修饰过的树脂柱，在特定pH下和流过的蛋白溶液发生离子交换，并结合带相反电荷的蛋白质，从而分离纯化阳离子交换树脂，CM-纤维素CM52，CM32阴离子交换树脂，DEAE-纤维素DE52，DE23Ion-exchangerchromatography（3）排阻层析：根据蛋白质分子大小（球状蛋白）的差异来分离葡聚糖凝胶(sephadex)，琼脂糖凝胶(sepharose)SephadexG-10~200Sephadex的型号以G值来表示，代表每克干胶吸水的量

G-200：20ml/gG值越大，孔径越大，胶越软，分子筛效应：分子越大走的越快Gelfiltrationchromatography（4）亲和层析（affinitychromatography）根据要分离的目标蛋白能与某种被称为配基的其它分子特异性相互结合的特点而设计配基可以是酶的底物，抗体/抗原，重组蛋白特异序列（GST-GSH；His6-Ni2+）（5）基因工程重组蛋白

（Recombinanttechniques）•Clonetheinterestedproteinencodinggeneinanexpressionvectorwithapurificationtagaddedatthe5’-or3’endofthegene•Proteinover-expressioninacell•Proteinpurificationwithaffinitychromatography.

GST-fusionprotein,sixHis-fusionproteinaffinity:GSH-sepharoseNi2+-sepharose4、蛋白质浓缩

超滤

冷冻干燥5、浓度测定克氏定氮N–16%比色法Folin-酚法，BCA法紫外吸收法排除核酸干扰(mg/ml)=1.55A280-0.76A260二、蛋白质检测和鉴定