6%番茄红素油树脂重结晶法制备番茄红素晶体

6%番茄红素油树脂重结晶法制备番茄红素晶体

0番茄红素抗氧化能力研究番茄红素是类风湿性关节炎药物，其结构为cs0h56，样品为174（反式）。它不溶于水、脂，也不溶于油脂。晶体呈红色。由于其最早在番茄中发现,故称为番茄红素。其分子结构中有11个不饱和共轭双键和两个非共轭不饱和双键,是目前发现的抗氧化能力最强的类胡萝卜素,在诸多抗氧化剂中番茄红素猝灭单线态氧的能力最强。研究者认为,在人机体内,氧自由基与生物大分子反应对体内DNA、蛋白质、脂类和碳水化合物等重要物质反应,将损害人机体功能,对人体健康造成威胁。番茄红素及其他类胡萝卜素可以保护机体内大分子物质避免受氧化伤害。因此,自20世纪50年代以来,其已经成为功能性食品添加剂和抗肿瘤保健食品研究开发的热点之一,并应用于保健食品、医药和化妆品行业。但是,高纯度的番茄红素较难取得,而且易于氧化,给研究者造成很大不便。美国Sigma等公司有标准品出售但价格昂贵;江南大学李伟曾经报道制备出高纯度番茄红素,但未见形成商品。本研究用重结晶法制备出高纯度番茄红素晶体,操作简便,为一般研究者取得高纯度的番茄红素提供了一条有效途径。1实验材料、方法和仪器1.1仪器、试药与仪器6%番茄红素油树脂,华北制药集团生产;番茄红素标准品,美国Sigma公司生产;正己烷等有机溶剂及药品均为分析纯。高效液相色谱仪,美国WATERS公司生产;Q10差示扫描量热分析仪,美国TA公司生产;UV-2100紫外分光光度计,产自北京;BrukerFT-IR红外光谱仪,产自美国;OLYMPUS显微镜,产自日本;RE-52型真空旋转蒸发仪,产自上海博通;XMT-420自动控温仪,北京朝阳自动化仪表厂生产。1.2实验方法1.2.1高纯度的番茄红素晶体的制备参考李伟和邸进申的方法,利用番茄红素在溶液中的溶解度随温度降低而下降的性质,采用降温结晶的方法对番茄红素进行纯化。步骤如下:1)称取一定量6%番茄红素油树脂,加适量BHT以防氧化,分散于适量正己烷中,加等体积的无水乙醇KOH饱和液,在氮气保护下皂化后加适量蒸馏水除去水溶性物质,静置分层并用正己烷回收水层中的番茄红素,加适量蒸馏水洗上层溶液至中性;2)番茄红素溶液经无水Na2SO4脱水,真空挥去部分溶剂,冷却析出晶体;3)滤出晶体溶于热溶剂中达到饱和,匀速缓慢降温析出晶体;4)多次重复得到高纯度番茄红素晶体;5)选取不同皂化条件和不同重结晶溶剂对高纯度番茄红素晶体得率影响进行单因素实验,来确定最佳制备条件。皂化和重结晶等过程应在避光与充氮气条件下进行。番茄红素晶体得率Z采用下式计算式中M1—番茄红素晶体的质量(g);C1—番茄红素晶体的纯度(%);M0—番茄红素油树脂的质量(g);C0—油树脂或重结晶母液中番茄红素的含量(%)。1.2.2红外光谱及番茄红素纯度将适量番茄红素晶体溶于正己烷中,在350∼550nm范围内扫描测定紫外吸收光谱。采取高效液相色谱法分析,用保留时间定性与单点校正法测纯度。色谱条件:色谱柱为C18;柱温为25℃;流动相为甲醇/乙腈/二氯甲烷(体积比44:44:12);流速为1mL/min;检测器为二极管阵列检测器;检测波长为475nm;采用KBr压片法测定红外光谱。DSC法测定番茄红素纯度,检测条件为:起始平衡温度为120℃,终止温度200℃,升温速率为5℃/min。记录样品熔化曲线,用DSC纯度分析软件进行分析。2结果与分析2.1皂化时间对一级结晶晶体得率的影响番茄红素油树脂经正己烷-无水乙醇KOH饱和液组成的体系皂化后,一级结晶的番茄红素晶体得率按式(1)计算,纯度用DSC法测定(下同)。不同温度条件下皂化60min,一级结晶番茄红素晶体得率及纯度见图1所示。由图1可见,番茄红素晶体得率随皂化温度提高呈下降趋势。这是因为番茄红素在高温下氧化降解和发生异构化而损失,而结晶纯度却与得率呈相反的变化趋势。70℃条件下不同皂化时间的一级结晶晶体得率及纯度如图2所示。从图2发现,皂化30～50min后晶体得率变化不显著,50～70min后得率明显下降;相反,纯度随皂化时间增加显著升高。番茄红素油树脂中除含番茄红素外,还含有大量的油脂和类脂等脂溶性成分与胶类杂质等杂质,采用皂化法去除原料中的脂质等可皂化物,要求碱液与脂质充分混合,以使脂类被彻底皂化除去。除了利用正己烷作脂类分散剂、无水乙醇作皂化助剂外,因番茄红素在碱性条件下的性质较稳定,如果皂化反应强度过大,番茄红素发生氧化降解速度较快,会引起番茄红素的损失,影响得率,因此可以添加适量的抗氧化剂BHT来减少番茄红素的损失。而温度较低或时间不足则皂化不彻底,会降低番茄红素晶体的纯度。也就是说,皂化反应进行得越完全,脂类等杂质去除得越彻底,所得晶体纯度就越高。因为本实验目的是为了取得高纯度的番茄红素样品,并且各反应条件对应的得率之间差异不大,实验选定皂化条件在稍过量碱存在下温度为70℃,时间为60min。70℃皂化一次结晶晶体得率为56.10%,纯度达到94.53%。2.2重结晶溶剂对番茄红素稳定性的影响番茄红素在溶剂中的稳定性和溶解特性是选择降温重结晶溶剂的主要依据,不同溶剂下二级结晶的晶体得率如图3所示。由图3可知,用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿和四氢呋喃作重结晶溶剂,所得晶体得率明显不同。其中,正己烷、乙酸乙酯所得晶体的得率较高,分别是64.6%和65.4%,二氯甲烷所得晶体的得率还不足50%。这说明,番茄红素在正己烷、乙酸乙酯中的稳定性比另外3种溶剂高,与文献的研究结果相吻合。由于番茄红素在乙酸乙酯中的溶解度高于在正己烷中的溶解度,并且随温度升高呈现缓慢增加的变化,有利于重结晶,所以选取乙酸乙酯为重结晶溶剂。2.3同重结晶级数的纯度和得率用乙酸乙酯作重结晶的溶剂,一级、二级与三级重结晶所得样品用差示扫描量热法和高效液相色谱单点校正法检测纯度,不同重结晶级数的纯度和得率如表1所示。按DSC法测定的数据中,二级重结晶所得样品比一级结晶的纯度提高了4.86%,三级重结晶比二级结晶所得样品的纯度又提高了0.60%,达到了99.17%。但因番茄红素氧化降解和异构化是和结晶同时发生的,结晶时间越长、重结晶次数越多,番茄红素的损失越大,得率越低。因此,本研究认为三级重结晶比较合适。2.4dsc纯度分析番茄红素紫外吸收扫描如图4所示。由图4可知,番茄红素正己烷溶液在350∼550nm范围内,样品在444nm,472nm,502nm处有较大吸收,且峰形、吸收强度与标准样品的紫外吸收非常一致。番茄红素样品红外光谱如图5所示。由图5可知,该样品为典型的共扼多烯结构,其特征吸收与全反式番茄红素的标准红外吸收图谱一致。其中,3038cm-1处的吸收峰为饱和C-H键的伸缩振动;1560cm-1处的峰是C=C伸缩振动吸收峰;959cm-1为反式单烯双取代的CH=CH剪切振动吸收峰;在730∼665cm-1内,没有出现吸收峰,这一范围是出现顺式单烯双取代的CH=CH剪切振动的吸收峰区域,说明晶体样品中没有顺式结构存在。经HPLC检测得出,样品在11.32min出峰,与标准品的保留时间完全一致。用标准样品作外标,采用单点校正法计算出样品纯度为104.03%。这说明,样品为全反式番茄红素,三级重结晶晶体的纯度高于标准品纯度。用显微镜观察,番茄红素单晶直径大于100µm,晶体质地均一色泽深红透明。DSC法适用于小分子有机化合物的定性和纯度测定,在精确度与准确度上优于UV,GC和HPLC法,且测定时间短,不需要标准品做对照。根据范特霍夫熔点下降理论,杂质的摩尔分数与熔点下降量成正比关系。样品纯度越高,其熔融吸热产生的DSC曲线峰形越尖锐。番茄红素3次结晶的DSC曲线和纯度分析结果如图6所示。由图6可知,随重结晶次数增加,样品DSC曲线峰形逐渐尖锐。用DSC纯度分析软件分析,3次重结晶样品纯度分别为94.01%,98.58%,99.17%。用式(1)计算总得率为24.7%。DSC仪同时测出第3次重结晶样品的熔融热为118.9J/g,熔点为175.03℃。其熔点略高于174℃的文献值,根据范特霍夫熔点下降理论判断,样品纯度很高。3量热法与热法的重结晶法1)在碱稍过量、70℃条件下,皂化60min可以去除番茄红素油树脂原料中绝大部分脂质等可皂化杂质,一级结晶晶体得率为56.1%。2)采用紫外扫描光谱、红外光谱和高效液相色谱以及差示扫描量热法对样品定性与定量分析,其结果表明,所得样品为全反式番茄红素。3)用乙酸乙酯作重结晶溶剂,以6℃/h的速率缓慢降温,重结晶过程中番茄红素氧化降解和异构化产物没有随全反式番茄红