糖尿病视网膜mller细胞的病理改变

糖尿病视网膜mller细胞的病理改变

糖尿病性视网膜病变（iii）是糖尿病的严重并发症。人们普遍认为，针灸主要是视网膜。微血管病变,但目前许多临床及实验性糖尿病动物模型研究发现:在DR微血管病变发生以前,神经视网膜已有病理改变。本实验通过观察3个月糖尿病鼠视网膜Müller细胞超微结构的变化,GFAP、VEGF表达的改变,以及AGEs对体外纯化培养鼠视网膜Müller细胞活性的影响,旨在研究糖尿病视网膜Müller细胞的病理改变及其机制,初步探讨Müller细胞损伤在DR中的作用,从而更好地了解DR的发病机制。1材料和方法1.1实验动物雄性成年SD大鼠20只(复旦大学放射医学研究所动物部),体重(200±20)g,随机分为正常对照组6只,糖尿病组14只。1.2实验细胞和培养基抗兔IgG-FITC二抗、抗鼠IgG-Cy3二抗(华美生物工程公司),链脲菌素(STZ)、小鼠抗大鼠GFAPIgG抗体、兔抗大鼠VEGFIgG抗体(Sigma公司),DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司),JEB-1200EX透射电镜。1.3糖尿病大鼠成模试验糖尿病组14只雄性大鼠腹腔注射STZ(65mg/kg,0.1mmol/L柠檬酸钠缓冲液,pH4.0),对照组注射等体积的柠檬酸钠缓冲液,72h后,血糖大于17mmol/L为糖尿病鼠,有10只大鼠成模,其中1只糖尿病鼠在饲养期间死亡。3个月后麻醉下处死,摘除眼球,3只糖尿病鼠及1只正常对照组视网膜组织作电镜观察,其余6只糖尿病鼠及5只对照组,左眼球作冰冻切片(10μm)。1.4蛋白质质量浓度检测AGE-BSA的制备将质量分数为5%的无球蛋白的牛血清白蛋白与0.5mol/LD-葡萄糖和1.0mol/L苯甲基磺酰氟共同溶解于0.2mol/L磷酸缓冲液中,过滤除菌后置37℃孵箱内孵化90d。然后在4℃PBS溶液中透析72h,测定葡萄糖浓度为零,考马斯亮蓝方法定量蛋白质质量浓度,荧光分光光度计鉴定AGE-BSA。AGE-BSA对照物的制备:除不加葡萄糖外,其他材料及方法同上。1.5gfapg抗体检测糖尿病鼠眼球冰冻切片用VEGFIgG抗体、GFAPIgG抗体双标染色,二抗用抗兔IgG-FITC及抗鼠IgG-Cy3,染色程序同常规免疫组织化学染色。激光共聚焦显微镜下观察照相。1.6视网膜组织电镜观察取视网膜组织,2.5%戊二醛、1%锇酸固定,JEB-1200EX透射电镜观察照相。1.7视网膜神经元细胞内皮细胞的制备出生5～7dSD乳鼠无菌条件下断头处死,钝性分离视网膜,0.125%胰蛋白酶37℃条件下消化20min,含血清的培养液终止消化,1000r/min离心5min,除去上清液,加入培养液(80%DMEM,20%胎牛血清)吹打使之成为细胞悬液,调整培养液量使细胞密度为3×105/mL,接种于包被鼠尾胶的40mL培养瓶,于37℃,5%CO2的培养箱内培养。24h后反复吹打除去漂浮的视网膜神经元细胞及血管内皮细胞。细胞融合后传代,选取2～4代细胞进行鉴定和实验。1.8视网膜中的最小细胞免疫组织化学预先在24孔培养板中置入盖玻片,细胞贴壁融合后PBS冲洗,4%多聚甲醛固定,用ABC法进行GFAP免疫组织化学鉴定。1.9最大od值的测定细胞以4×103/孔接种于96孔培养板,实验组与对照组各4孔,2h后分别在实验组、对照组加入AGEs及其对照物2500μg/mL,培养20h后加入MTT(1.5mg/mL,PBS配制)20μL/孔,4h后在ELISA仪上测OD值。组间差异的显著性用t检验完成。2结果2.1女性评估AGE-BSA溶液作扫描检测,激发光波长峰值为370nm,发射光波长峰值为440nm,以此波长,AGE-BSA产生最强荧光。2.2vegf阳性染色正常大鼠视网膜内界膜下、神经节细胞层见GFAP阳性染色,但整个视网膜未见VEGF阳性染色(图1)。糖尿病鼠除视网膜内界膜下、神经节细胞层有GFAP阳性染色外,其余各层也可见丝条状贯穿于内外界膜之间的GFAP阳性染色,并且在上述部位有GFAP和VEGF的共表达(图2～4)。2.3视网膜组织电镜观察与对照组相比,3个月糖尿病鼠视网膜Müller细胞有明显的病理改变(图5,6)。2.4视网膜成像中的细胞培养和鉴定培养的细胞90%表达GFAP(图7)。第2代纯化培养的视网膜müller细胞呈融合状态(图8)。2.5体外细胞活性检测对照组的OD值为0.225±0.009,实验组的OD值为0.262±0.007,细胞活性增加,与对照组相比,差异有显著性意义(P<0.01),并且Müller细胞在活性增加的同时,其突起大部分消失。3dr微血管病变与视网膜屏障结构相关关系探讨DR是糖尿病引起的严重并发症,以往人们研究最多也最为深入的是其微血管病变,但目前越来越多的临床及动物实验研究表明:神经视网膜在DR的发生发展中起重要作用。中枢神经系统研究发现胶质细胞参与许多疾病的病理生理过程,如中风、Alzheimer病等。Müller细胞是视网膜主要胶质细胞,其突起除包绕神经元及轴突外,还附着在血管外作为支架构成血-视网膜屏障的一部分,具有维持血-视网膜屏障以及神经元正常生理功能的作用。在DR发生发展中,作为视网膜主要胶质细胞的Müller细胞表现如何?它和微血管病变之间又有哪些关系?目前这方面的研究受到越来越多的关注。本实验对3个月糖尿病鼠视网膜超微结构进行观察,发现Müller细胞的突起大部分消失,但微血管内皮细胞、周细胞却未见明显的病理改变。本实验同时发现3个月糖尿病鼠视网膜Müller细胞有GFAP表达,而正常鼠体内视网膜中仅有分布于神经节细胞层及神经纤维层的星型胶质细胞表达GFAP,而Müller细胞并不表达。尽管体内Müller细胞表达GFAP的作用机制尚不清楚,但其意义在于:它被公认为视网膜受损后,Müller细胞产生反应性胶质化增生的重要标志,如机械性损伤、视网膜脱离、青光眼等,Müller细胞在产生反应性胶质化增生的同时,均有GFAP表达。以上实验结果说明:在DR微血管病变前,Müller细胞可能已有反应性胶质化增生以及突起消失等病理改变。血-视网膜屏障破坏也是糖尿病早期的一个重要特征,Qaum等研究发现:糖尿病早期血-视网膜屏障破坏呈VEGF依赖性,其机制可能是通过打开内皮细胞的紧密连接和增加细胞内囊泡运输完成,因微血管内皮细胞及周细胞未见明显的病理改变。3个月糖尿病鼠视网膜有GFAP及VEGF的共表达,说明在糖尿病早期,不仅已有Müller细胞反应性增生等病理改变,而且反应性增生的Müller细胞还可分泌VEGF,进而促进DR微血管病变的发生发展,但是Müller细胞在糖尿病血-视网膜屏障破坏中的确切机制,如是否影响内皮细胞紧密连接蛋白的表达等,有待进一步研究。为探索其发病机制,本实验在体外纯化培养鼠视网膜Müller细胞,观察AGEs对其活性的影响。AGEs是由还原糖(如葡萄糖、果糖)和蛋白质的氨基末端经非酶促反应形成的终末产物之一,近年来研究认为:体内AGEs的形成和沉积是DR微血管病变的重要发病机制。本实验在研究AGEs对体外纯化培养鼠视网膜Müller细胞活性的影响时,发现AGEs可引起Müller细胞的活性明显增加,并且Müller细胞在活性增加的同时,其突起大部分消失,这就可解释上述糖尿病体内实验所观察的现象,由于细胞活性能反映其增殖状态,所以糖尿病鼠体内Müller细胞突起消失这一现象可能是其反应性增生的结果。由此推测:(1)反应性胶质化增生可能是糖尿病早期Müller细胞的主要病理改变,导致其作为视网膜支架结构的破坏。(2)AGEs可能是DR中视网膜Müller细胞反应性胶质化增生的重要致病因素,但AGEs能否促进Müller细胞表达GFAP及VEGF有待进一步研究。正常情况下,Müller细胞在体内不表达GFAP,但在体外培养Müller细胞时,2周后绝大部分细胞表达GFAP,本实验用GFAPIgG抗体鉴定体外培养的鼠视网膜Müller细胞,阳性率为90%。本实验结果表明反应性胶质化增