补肾健脾方对脾肾两虚型大鼠骨质疏松症的治疗作用

补肾健脾方对脾肾两虚型大鼠骨质疏松症的治疗作用

中医认为，骨质疏松症的发生与脾虚是其根本原因。脾虚是主要原因之一。脾虚与肾虚有关。因此,补肾法、健脾法及补肾健脾法均是骨质疏松症治疗的重要法则。本研究在此理论基础上,深入探讨补肾健脾方对脾肾两虚型大鼠骨质疏松症的治疗作用,对补肾法、健脾法以及补肾健脾法对其的治疗作用进行对比分析,以期为骨质疏松发生过程中脾肾相关性研究提供实验依据。材料表面1.强、弱、小分子的风险选用健康雌性SPF级Wistar大鼠86只,体质量200-220g,由中国药品生物制品检定所提供,许可证编号:SCXK(京)2009-0017,在中日友好医院临床研究所动物室屏障系统饲养,实验动物室许可证号:SYXK(京)2010-0011。补肾方药采用龟鹿二仙汤,组成:龟板胶9g,鹿角胶6g,人参9g,枸杞9g,常规水煎制,含量为3.04g生药/kg,给药浓度为0.304g/mL。健脾方药采用四君子汤,组成:人参9g,茯苓9g,白术9g,甘草6g,常规水煎制,含量为3.04g生药/kg,给药浓度为0.304g/mL。补肾健脾方药采用龟鹿二仙汤合四君子汤,组成:龟板胶9g,鹿角胶6g,人参9g,枸杞9g,茯苓9g,白术9g,甘草6g,常规水煎制,含量为5.26g生药/kg,给药浓度为0.526g/mL。己烯雌酚:合肥久联制药有限公司生产(批号:20100120),规格:每片1mg,使用时用蒸馏水制成浓度为0.0046mg/mL的混悬液,给药体积为1mL/100g体质量,给药剂量为0.046mg/kg体质量。大黄浓煎液:川大黄,水煎制,浓缩至200%。甲基丙烯酸甲酯由北京益利精细化学品有限公司生产(批号:20050317);甲基丙烯酸丁酯由北京益利精细化学品有限公司生产(批号:980716);聚乙二醇400由北京化学试剂公司生产(批号:050425);苯甲酸甲酯有华北地区特种化学试剂开发中心(天津)生产(批号:980923);过氧化苯甲酰由北京金龙化学试剂有限公司生产(批号:20000420);N,N-二甲基对甲苯胺(N,N-Dimethyl-p-toluidine)由ALDRICH公司生产(批号:04327MB-235)。Ⅰ液:100mL甲基丙烯酸甲酯+35mL甲基丙烯酸丁酯+5mL苯甲酸甲酯+1.2mL聚乙二醇400;Ⅱ液:Ⅰ液+0.4g干燥过氧化苯甲酰;Ⅲ液:Ⅱ液+0.8g干燥过氧化苯甲酰;戊巴比妥钠由美国Sigma公司生产(批号:20090305);盐酸四环素由美国Amresco公司生产(批号:20090301)。LEICACTR6000显微镜:德国Leica公司;LeicaQwin图像分析仪系统:德国Leica公司;冷冻切片机:英国TBS公司;Reicheit-Jung2040切片机:德国。组织前药剂量设计选用清洁级健康雌性Wistar大鼠86只,随机分为3组:正常对照组12只、假手术组12只、卵巢切除组62只。所有大鼠适应性喂养1周后,将卵巢切除组大鼠以45mg/kg剂量的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,腹位固定,行卵巢切除术。假手术组只是切除小块脂肪组织,但不摘除卵巢。术后10周,将卵巢切除组大鼠随机分为:脾肾两虚模型组(12只)、己烯雌酚组(12只)、补肾组(12只)、健脾组(13只)及补肾健脾组(13只)。脾肾两虚模型组大鼠用大黄浓煎液灌胃,4mL/只,每日1次,连续14d;同时,其余各组大鼠胃饲等容积的蒸馏水。随后,己烯雌酚组、补肾组、健脾组及补肾健脾组大鼠分别给予己烯雌酚、补肾方药、健脾方药及补肾健脾方药,每日1次,连续6d,休息1d,再连续给药6d,每周称重1次,据此调整给药量;同时,脾肾两虚模型组大鼠给予200%的大黄浓煎液灌胃,每周2次。如此给药3个月。正常对照组、假手术组按同法灌服等体积的蒸馏水。处死前16d和前3d分别腹腔注射盐酸四环素30mg/kg体质量,以对骨进行荧光标记。给药结束后,取大鼠右侧胫骨近端1/3,制作不脱钙骨切片,进行骨组织形态计量学指标的检测。2.指标检测2.1组织嵌入法n-二甲基法取大鼠右侧胫骨近端1/3,置于4%多聚甲醛溶液(pH值7.4)中固定24h,然后进行脱水,程序为80%乙醇2d,95%乙醇2d,100%乙醇2d,二甲苯2d。接着,标本依次在塑料聚合液Ⅰ液、Ⅱ液、Ⅲ液中各浸泡3d。以上固定、脱水和浸泡过程均在4℃进行。最后,将400μLN,N-二甲基对甲苯胺加入到100mL预冷(4℃)Ⅲ液中,用磁力搅拌器搅拌10min后,在青霉素小瓶中注入约7mL的Ⅲ液,将骨标本按同一方向放入瓶底,用注射器抽空包埋瓶中空气,然后置于-20℃冰箱中聚合1周左右,则可变为无色透明的坚硬包埋块。修块后,在Reicheit-Jung2040切片机上,每块骨组织用钨钢刀切出5μm的纵向不脱钙骨切片各2张。其中1张用于甲苯胺蓝染色,另1张用于荧光观察。2.2骨小梁表面因变质trabeculabe用LeicaQwin图像分析系统进行计量分析:(1)骨量的检测:用骨小梁体积百分比(percentageoftrabecularbonevolume,TBV%),即骨小梁体积占被测骨髓腔总体积的百分比进行表示,它是衡量骨量水平的主要标志。(2)骨吸收情况的检测:用骨小梁吸收表面百分比(percentageoftrabecularboneresorption,TRS%)表示,即不规则、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比,它也可以判断破骨细胞的活性。(3)骨形成情况的检测:(1)骨小梁形成表面百分比(percentageoftrabecularboneformation,TFS%):有成骨细胞被覆的类骨质表面占骨小梁表面的百分比,它也可以判断成骨细胞的活性;(2)骨小梁矿化率(mineralizationrateoftrabecularbone,MAR):骨小梁表面荧光双标记带的平均距离除以2次标记相隔的天数;(3)类骨质平均宽度(widthofosteoid,OSW):皮质内表面有成骨细胞被覆的类骨质的平均宽度;(4)骨皮质矿化率(mineralizationrateofcorticalbone,mAR):皮质内表面荧光双标记带的平均距离除以2次标记相隔的天数。3.统计方法实验结果均以表示,采用方差分析(ANOVA)处理,组间两两比较,采用q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。肾两虚型统一模型大鼠软骨trs%和tfs%的变化,主要有两种方法1.补肾法、健脾法和补肾健脾法对脾肾两虚型骨质疏松大鼠胫骨TBV%的影响见表1。脾肾两虚模型组大鼠胫骨TBV%显著性低于假手术组。补肾组、健脾组、补肾健脾组、己烯雌酚组大鼠胫骨TBV%均显著性高于脾肾两虚模型组(P<0.05,P<0.01),但明显低于假手术组(P<0.01)。与健脾组相比,补肾组及补肾健脾组的TBV%明显增高,且补肾健脾组的TBV%较补肾组亦有显著增高(P<0.01)。2.补肾法、健脾法和补肾健脾法对脾肾两虚型骨质疏松大鼠胫骨TRS%和TFS%的影响见表2。与假手术组相比,脾肾两虚模型组大鼠胫骨TRS%和TFS%均显著性增高(P<0.01)。补肾组、健脾组、补肾健脾组、己烯雌酚组大鼠胫骨TRS%和TFS%均显著低于脾肾两虚模型组(P<0.01),且补肾健脾组、己烯雌酚组大鼠胫骨TRS%和TFS%相较于假手术组无明显差异,但补肾组、健脾组大鼠胫骨TRS%和TFS%仍明显高于假手术组。与健脾组相比,补肾组及补肾健脾组的TRS%和TFS%明显降低(P<0.05,P<0.01),且补肾健脾组的TRS%和TFS%较补肾组降低更为显著(P<0.05,P<0.01)。3.补肾法、健脾法和补肾健脾法对脾肾两虚型骨质疏松大鼠胫骨OSW、MAR和mAR的影响见表3。脾肾两虚模型组大鼠胫骨OSW、MAR和mAR较之假手术组均显著性增高(P<0.01)。与脾肾两虚模型组相比,补肾组、健脾组、补肾健脾组、己烯雌酚组大鼠胫骨OSW、MAR和mAR均显著性降低(P<0.01)。与健脾组及补肾组相比,补肾健脾组的MAR和mAR均明显降低(P<0.01),但OSW无明显差异。见表1:肾有机溶剂绝经后骨质疏松症是中老年妇女绝经后的一种常见病、多发病,是由生理性退行变化引起的全身单位体积骨量减少,骨密度降低,易发生骨折的一种代谢性疾病。中医将骨质疏松症归于“骨痹”或“骨痿”的范畴。中医理论认为,“肾为先天之本”,“肾生骨髓”,“其充在骨”。骨的生长、发育、强劲、衰弱与肾精盛衰关系密切,肾精充足则骨髓生化有源,骨骼得以滋养而强健有力;肾精亏虚则骨髓生化乏源,骨骼失养而痿弱无力。《灵枢·经络》篇曰:“足少阴气绝,则骨枯……骨不濡则肉不能著也;骨肉不相亲则肉软却……发无泽者骨先死”。从以上论述可以看出,肾虚是引起骨质疏松症的根本原因。以往的研究显示,肾虚(卵巢切除)可使大鼠的骨量显著降低,使其骨形成和骨吸收均增高,造成高转换型的骨质疏松症。中医认为,“脾为后天之本”。脾主运化,输布精微,可充养肾精。若脾气虚弱,中阳不振,精微不布,则肾精乏源,进而使骨髓失养而致骨痿。因此,脾虚可通过导致肾虚进而引起骨质疏松症的发生。本研究结果显示,脾肾两虚模型组大鼠胫骨TBV%显著低于假手术组,而TRS%、TFS%、OSW、MAR和mAR较之假手术组均显著增高。同时大鼠表现出毛色不光,食量减少,行为迟缓,喜聚堆,弓背蜷缩,反应不灵敏等脾虚的症状。说明卵巢切除术后,再灌胃给予大黄浓煎液14d,即是在肾虚的基础上叠加了脾虚的因素,可使大鼠的骨量明显减少,骨转换明显增高,造成了大鼠脾肾两虚型骨质疏松模型。龟鹿二仙汤,出自《医便》,具有滋阴填精,益气壮阳之功。研究证实,该方对于绝经后及老年性骨质疏松症均有较好的治疗作用。四君子汤,出自《太平惠民和剂局方》,具有益气健脾之效,是治疗脾胃气虚证的基础方,后世众多补脾益气的方剂多由此方化裁而来。研究发现,四君子汤对于去卵巢所致的骨质疏松症具有一定的治疗作用。龟鹿二仙汤善于温肾益精,四君子汤长于补脾益气。将两方合用,方中鹿角胶甘咸而温,善于温肾壮阳,益精补血;龟板胶甘咸而寒,长于填补精髓,滋养阴血,两者为血肉有情之品,最能峻补阴阳而化生精血;人参善于固气,气固则精不遗;枸杞善于滋阴,阴滋则火不泄;白术苦温,补气健脾;茯苓甘淡,健脾渗湿;甘草甘平,和中益土。诸药合用,脾借肾中阳气之温煦得以运化水谷精微;肾精赖水谷精微之滋养得以不断充实,如此,可达补肾健脾之功效。从中医角度来看,对于骨质疏松症的治疗,两方合用,补肾健脾,可取得比单纯补肾或单纯健脾更好的治疗效果。本研究结果也证实了这一点。与脾肾两虚模型组相比,补肾组、健脾组、补肾健脾组大鼠胫骨TBV%均显著增高,TRS%、TFS%、OSW、MAR和mAR均显著降低。与健脾组相比,补肾组及补肾健脾组的TBV%明显增高,TRS%和TFS%明显降低,且补肾健脾组TBV%的增高及TRS%、TFS%、MAR和mAR的降低较补肾组更为明显。这一结果说明,补肾法、健脾法以及补肾健脾法对脾肾两虚型的骨质疏松症均具有治疗作用,能增加骨量,降低骨转换率,而3种方法中,补肾法的作用优于健脾法,而又以补肾健脾法的疗效最佳。这从治疗的角度证明了骨质疏松症的发生,肾虚是其根本原因,脾虚是主要因素。本研究首次建立了骨质疏松症脾肾两虚型病证结合动物模型,并采