红蟹ropomeosin肌肉中变应原基因的克隆及免疫学特性鉴定

红蟹ropomeosin肌肉中变应原基因的克隆及免疫学特性鉴定

随着生活水平的提高，人们对水（如虾、螃蟹、鱼等）的消费越来越频繁，导致过敏疾病的数量也在增加。据伍秋容研究发现,在4岁以后,引起患者过敏的食物变应原逐渐以虾、蟹为主。其临床表现主要有恶心、呕吐、腹痛、腹胀、腹泻、皮疹、鼻炎、哮喘等,严重的可导致休克甚至危及生命。红星梭子蟹(Portunussanguinolentus)是我国南方食用蟹之一,属于梭子蟹科、梭子蟹属,在我国主要分布在南海一带,在日本、夏威夷、菲律宾等环太平洋沿岸的暖水区亦有分布,是我国南方特别是广东地区最常食用的水产食品之一。赵绮华等运用免疫印迹的方法分析了花蟹(Portunuspelogicus)的主要致敏成分为分子量74.4kD和48.7kD的两个蛋白。但目前国内有关蟹变应原的分子生物学研究尚未见报道。本研究利用简并引物从红星梭子蟹蟹肉中克隆获得一个Tropomyosin基因,并将该基因在大肠杆菌中表达,获得有活性的重组蟹Tropomyosin,并用MALDI-TOF-MS质谱技术对其进行了鉴定,现将结果报道如下。1材料和方法1.1原核表达载体pet-28a红星梭子蟹(Portunussanguinolentus)购自深圳市南山菜市场。RNA提取试剂盒购于Qiagen公司;AMVFirstStrandcDNASynthesisKit购于BBI公司;pMD18-TVector、限制性内切酶NdeI和XhoI、T4DNA连接酶均购于Takara公司。原核表达载体pET-28a购自Novagen公司。ProteoExtractAll-in-OneTrypsinDigestionKit购自英韦创津公司。血清由深圳市第一人民医院提供:选择临床上有吃蟹过敏史的患者,其血清经法码西亚CAP过敏原自动检测系统检测,收集蟹特异性IgE阳性且反应达2级或2级以上的患者血清12人份,另取健康(无过敏病史)人血清5人份,分别分装后放-80℃低温保存备用。1.2方法1.2.1筛选保守区域从SWISS-PROT、TrEMBL以及NCBI的数据库下载到17个动物性变应原Tropomyosin的核酸序列。利用CLUSTALW程序对这些序列进行同源性比对,确定其保守区域。根据保守区域序列,设计并合成简并引物(由上海生工合成):Trop5a:ATGGA(C/G)GC(C/A)ATCAAGAAGAAGATGC;Trop3b:TTA(G/A)TAGCCAG(T/A)(C/A)AGTTCGC。1.2.2逆转录合成第一链Tropomyosin基因的克隆与测序从新鲜蟹肉中提取总RNA,提取过程按照Qiagen公司试剂盒说明书进行。采用AMVFirstStrandcDNASynthesisKit,以总RNA为模板进行逆转录合成第一链。以RT产物为模板进行PCR反应,结束反应后将目的条带连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌Top10。经菌落PCR验证后将阳性菌落进行序列测定(由上海生工完成)。1.2.3序列分析与同源性比对1.2.4pcr扩增pet-28a表达载体的制备在蟹TropomyosincDNA的5′和3′末端通过PCR反应分别引入NdeI和XhoI酶切位点,PCR引物序列如下:C5:GGACATATGGAGGCCATCAAG(划线部分为NdeI酶切位点)和C3:GAGCTCGAGTTAATAGCCAGTCAG(划线部分为XhoI酶切位点)。回收PCR产物连接到pMD18-T载体上经测序无误后,提取质粒进行NdeI和Xho1双酶切,暴露出基因片段两端的NdeI和Xho1黏端,与同样经过NdeI和Xho1双酶切的pET-28a表达载体,在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜。挑取可疑阳性重组质粒进行双酶切鉴定和测序验证。1.2.5重组蛋白的纯化参照Novagen公司的pETSystemManual(11thEdition)进行重组蛋白的诱导表达,Ni2+亲和层析柱进行纯化,用40mmol/L咪唑和200mmol/L咪唑洗脱,收集洗脱峰,SDS电泳检测后对含目的蛋白洗脱组分进行透析并冻干保存。1.2.6阳性混合血清和阳性混合血清血清学印像检测以重组表达产物进行SDS电泳,经电转移到硝酸纤维膜上,用蟹过敏性患者阳性混合血清为一抗,生物素标记的羊抗人IgE为二抗,用辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素对阳性信号进一步放大,以3,3′5,5-四甲基联苯胺(TMB)为底物进行显色,进行Western-blot印迹检测。1.2.7质量分析的确定2结果2.1rt-pcr产物的检测提取的蟹肉总RNA经反转录合成cDNA第一链,然后以为此为模板,用简并引物进行PCR扩增。扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳(图1),在855bp左右有一亮带,大小与理论预计值相符。回收RT-PCR产物并与pMD18-TVector连接后转化E.coliTop10。挑取阳性菌落进行测序,结果用NCBI中的BLAST程序进行序列同源性比较,发现它们与GenBank中已知的虾、蟹、螨、蟑螂等的原肌球蛋白基因(Tropomyosin)序列同源性较高。2.2强化同源性分析克隆得到的蟹Tropomyosin基因(图2)由855个碱基组成,其中开放阅读框为855个碱基(含终止密码子),编码285个氨基酸。经计算分析,推测该蛋白的等电点为4.71,理论分子量为32.8kD。利用EMBL-EBI的CLUSTALW(1.82)程序进行氨基酸序列同源性比对,结果显示由红星梭子蟹Tropomyosin基因推导的氨基酸序列与Leung,etal.克隆得到红蟹Tropomyosin和Mykles,etal.克隆得到的美洲螯龙虾Tropomyosin的同源性较高,均为97%,而且与其他已知动物性泛变应原Tropomyosin的同源性也较高(图3),如与中国龙虾和刀额新对虾泛变应原Tropomyosin的同源性均为92%;与尘螨和美洲大蠊的同源性分别为92%和83%。由此可认定该基因为蟹Tropomyosin基因,将其提交GenBank数据库,登录号为EF143836。根据变应原命名法则将该基因推导的蛋白暂命名为Pors1。2.3tropomiolin基因片段鉴定提取经菌落PCR鉴定为阳性的重组表达质粒,进行NdeI和XhoI双酶切鉴定(图4),载体片段约为5000bp,插入的蟹Tropomyosin基因片段为855bp,同预期的大小一致。DNA序列测定结果显示克隆的片段为Pors1的完整编码框(包括起始密码子和终止密码子)。2.4sds-东南角电泳分析含有pET28a-Pors1的表达菌株BL21(DE3)经终浓度为1mmol/LIPTG诱导过夜获得重组蛋白,SDS电泳分析显示在约38kD处有外源蛋白表达条带出现(图5),比理论分子量(32.8kD)稍大,与预期结果基本相符。采用Ni柱亲和层析的方法纯化重组蛋白,收集各峰峰液,进行SDS分析后发现,用200mmol/L咪唑洗脱的峰中含有大量高纯度目的蛋白。2.5血清蛋白的ige结合活性测定结果用12个蟹过敏患者的混合血清作为一抗进行免疫印迹试验,结果显示在约38kD处有一明显的识别条带(图6),而阴性混合血清组则没有,说明Pors1重组蛋白具有良好的IgE结合活性。2.6重组蛋白的同源性根据MALDI-TOF-MS获得的肽指纹图谱(PMF,图7)在数据库搜索比对,重组蛋白与Chaf1(Q9N2R3)有很高的同源性,多肽覆盖率达到60%(图8)。这证明目的条带确为大肠杆菌表达的蟹Tropomyosin蛋白。3tropomiin基因家族在细胞培养中的作用蟹是最常见的致敏水产品之一,其品种繁多,如雪蟹、梭子蟹、青蟹等。早在1982年,美国的职业安全与健康学会(NIOSH)就发表了关于雪蟹在加工过程中能引发工人职业性哮喘的研究报告。该IgE介导的超敏反应在随后的许多报道中得到了证实。Leung,etal.第一次报道了红蟹(Charybdisferiatus)的主要变应原为34kD蛋白,其氨基酸序列与虾原肌球蛋白(Mete1)变应原有极高的同源性。这引起了科学家们的极大兴趣。据资料显示,引发食物性过敏反应的食用性的甲壳类(如虾、蟹、龙虾、螯虾等),其主要变应原是肌肉蛋白原肌球蛋白(Tropomyosin)。它的分子量在35—38kD左右,由两个多肽链组成,含一个α-螺旋和一个卷曲螺旋结构;该蛋白质家族具有高度保守性,并含多种亚型。越来越多的资料显示,原肌球蛋白在甲壳类和软件动物中具有高度保守性,并且是主要的交叉变应原。目前直接和间接的证据都表明,引起相似临床症状的不同种类的甲壳动物(虾、蟹、龙虾)和其他一些食用性无脊椎动物(乌贼、章鱼)的Tropomyosin都具有IgE抗体的交叉反应性。而且,正是由于Tropomyosin的这种特殊致敏性,研究者发现屋尘螨变应原与海产品变应原之间存在一定的联系,特别是在利用尘螨粗提液进行免疫治疗的时候。最近一项研究表明,暴露在屋尘螨Tropomyosin下可以导致患者对虾Tropomyosin过敏。因此有必要对海产的Tropomyosin变应原进行研究。本研究利用上述Tropomyosin特殊的保守性,通过生物信息学分析了多种甲壳类和软体动物的变应原Tropomyosin基因序列,根据其高度保守区域设计简并引物,RT-PCR成功克隆出红星梭子蟹Tropomyosin变应原的完整基因。序列分析结果显示该基因与已知的虾、尘螨、蟑螂等变应原Tropomyosin基因有很高的同源性(>80%),如与红蟹Chaf1和美洲螯龙虾Homa1的同源性均为97%;与中国龙虾Pans1和刀额新对虾Mete1的同源性均为92%。目的基因通过pET-28a载体在原核表达系统进行高效表达,经Ni2+亲和层析柱纯化后重组蛋白纯度达96%以上。Western-blotting检测结果显示纯化后的重组蛋白具有良好的免疫学活性,MALD