食品酶学复习资料

食品酶学第一章

酶学概论酶学（Enzymology）：是研究酶的构造、性质，酶的反应机理和作用机制，酶的生物学功能及应用的一门科学。三、酶工程简介酶工程由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学,亦即将酶或者细胞、细胞器等在一定的生物反应装置中，运用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将对应的原料转化成有用物质并应用于社会的一门科学。酶工程分为：化学酶工程与生物酶工程。生物技术的四大支柱：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程生物酶工程重要研究内容（1）用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）（2）用蛋白质工程技术定点变化酶构造基因（突变酶）（3）设计新的酶构造基因，生产自然界从未有过的性能稳定、活性更高的新酶。第二节酶作为催化剂的特点酶和一般催化剂的共性：1.用量少而催化效率高2.不变化化学反应的平衡点，仅变化反应速度，缩短平衡抵达的时间。3.减少反应的活化能,酶自身在反应前后不发生变化酶作为生物催化剂的特性：催化效率高、专一性强、反应条件温和、酶的不稳定性及可调整性酶作用的专一性：酶的专一性是指一种酶只能催化一种或一类构造相似的底物进行某种类型的酶反应。根据酶的专一性程度不一样，可分下列三种：绝对专一性：指一种酶只能催化一种物质进行反应，这种高度的专一性称绝对专一性。相对专一性：一种酶能催化一类构造相似的物质进行某种相似类型的反应，这种专一性称相对专一性。1）键专一性2）基团专一性立体异构专一性：一种酶只能催化一种立体异构进行某种类型的化学反应，而对另一种立体异构体则无作用，这种专一性称立体异构专一性。酶不稳定，易失活：由于酶是蛋白质，凡引起蛋白质变性的原因，亦可使酶变性失活。酶的可调性：由于酶的催化作用可受多种原因的调整，从而变化其催化活性，尤其是代谢过程中某些关键性酶，往往是重要的调整对象。第三节酶分子构造和功能1.酶分子的构成①酶蛋白酶的一级构造:它是酶的基本构造,是由许多氨基酸按特定的次序排列成的肽链,氨基酸之间通过肽键(-CH=NH-)连接。酶的二级构造:肽键深入盘绕成α-螺旋或并列排列成β-折叠，由不一样长短的α-螺旋及不一样长度的β-折叠构成了蛋白质的二级构造。酶的三级构造:蛋白质的二级构造，再加上某些没有规则的肽链段落装配而成，在此基础上再盘绕成更高级的三级构造（称作一种亚基）。酶的四级构造:相似或不一样的亚基构成更完整更严密的空间构象成为四级构造。任何破坏稳定二级构造的氢键或稳定三级构造的二硫键、盐键、酯键、范德华力、金属键等，均会使空间构象受破坏，导致蛋白质构造松散，溶解度减少，从而失去其生物学功能，这称为蛋白质变性作用。酶蛋白有三种形式：①单体酶：单体酶是一条或多条肽链构成的，仅具有一种活性中心的酶。②寡聚酶：由2个或多种相似或不相似的亚基组合而成的酶。单独的一种亚基一般不具有酶活性。③多酶复合体系：指多种酶靠非共价键互相嵌合催化持续反应的体系前一种反应产物为后一种反应的底物，反应依次连接，构成一种代谢途径或代谢途径的一部分。大多数的辅酶为核苷酸和维生素或它们的衍生物,辅酶或辅基中往往具有B族维生素。在结合酶中：1.酶催化作用的专一性由酶蛋白部分决定；2.辅基辅酶的作用是在反应中起传递基团、原子和电子的作用;3.金属离子的作用是：有的是稳定酶蛋白分子的构象所必需，有的是构成酶的活性中心；有的是在酶与底物之间起桥梁作用，亦有的是中和阴离子，减少反应中的静电斥力。酶学研究认为，在酶蛋白分子上，不是所有构成多肽的氨基酸都起作用，而只有少数的氨基酸残基与酶的催化活性直接有关。这些特殊的氨基酸残基，一般比较集中在酶蛋白的一种特定区域，这个区域称为酶的活力部位或活性中心（activesiteoractivecenter)。酶的活力部位或活性中心由底物结合部位和催化部位两个部分构成。酶分子不仅有催化功能，同步也具有调整功能。因此酶的构造中不仅存在着酶的活力部位，并且存在调整部位，这个调整部位称酶的别构部位（allostericsite)。酶的别构部位结合别构配体，这种配体称为效应剂。增进酶的催化能力为正效应剂，减少酶的催化能力为负效应剂。酶原与酶原的激活生物体内合成的蛋白质，有时不具有生物活性，通过蛋白水解酶专一作用后，构象发生变化，形成酶的活性部位，变为活性蛋白。不具有生物活性的蛋白质称为前体(precursor)。假如这个前体能变为酶(活性蛋白质)，这个前体称为酶原(proenzyme)。酶的多形性与同工酶诸多酶也许催化相似的反应,但其构造和物理性质有所不一样,这种现象称为酶的多形性。同工酶：指能催化相似的化学反应，但由于构造基因不一样，或基因相似,但基因转录产物mRNA或者其翻译产物是通过不一样的加工过程产生的酶的一级构造、物理性质以及其他性质有所差异的一组酶。同工酶有下列特点：存在于同一种属或同一种体的不一样组织或同一组织的不一样细胞中。

b.一级构造不一样，理化性质包括带电性质不一样，免疫学性质不一样，但空间构造中的活性中心相似或相似。

c.往往是四级构造的酶类。

d.已发现一百多种酶具有同工酶性质。发现最早研究最多的是乳酸脱氢酶，它有五种同工酶。第四节酶的命名与分类三、酶的数字编号系统根据目前已知的3600多种酶催化反应的类型，将酶分为六大类：（1）

氧化还原酶类（oxidoreductases）（2）

转移酶类（transferases）（3）

水解酶类(hydrolases)（4）

裂合酶类(lyases)（5）

异构酶类(isomerases)（6）

合成酶类(ligases)同工酶的命名国际生化协会同工酶分委员会提议同工酶根据他们在电泳中分离的位置确定,从电泳中向着阳极移动最远的酶开始依次编号。第二章酶促反应的动力学酶促反应动力学也称酶催化反应动力学(kineticsofenzyme-catalyzedreactions),是研究酶促反应速度以及影响此反应速度的多种原因的科学。一、酶活力的测定检测酶含量及存在甚微，很难直接用酶的“量”（质量、体积、浓度）来表达，而常用酶催化某一特定反应的能力来表达酶量，即用酶活力的大小来表达。1、酶活力酶活力(Enzymeactivity)：是指酶催化某一化学反应的能力，其大小可以用在一定条件下该酶所催化的某一化学反应的反应速度(reactionvelocity)来表达。它表达样品中酶的含量。酶活力一般以在最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。酶催化的反应速度可用单位时间内底物的减少许产物的增长量来表达。研究酶反应速度以酶促反应的初速度(initialspeed)为准引起酶反应速度减少的原因：底物浓度的减少；酶的部分失活；产物对酶的克制；产物增长引起的逆反应速度的增长2．酶的活力单位酶活力单位即酶单位（U）是衡量酶活力的大小即酶含量的多少的指标。酶单位的定义是：在一定条件下，一定期间内将一定量的底物转化为产物的酶量。（U/g或U/mL）1961年国际酶学会提出采用统一“国际单位”（IU）来表达酶活力，规定为：在最适反应条件下（温度25℃），1min内催化1μmol底物转化为产物所需的酶量定为该酶的一种活力单位。即1IU=1μmol/min。1972年国际酶学委员会又推荐一种新的酶活力国际单位，即Katal（简称Kat）单位。规定：在最适反应条件下，每秒钟能催化1摩尔（mol）底物转化为产物所需的酶量，定为1Katal单位。Kat单位和IU单位之间的换算关系如下：1Kat=60×106IU1IU=16.67×10-9Kat酶的总活力：样品的所有酶活力。总活力=酶活力×总体积（ml）或=酶活力×总质量（g）比活力（Specificactivity）:指每毫克蛋白质所含酶活力的单位数（单位/毫克蛋白）。比活力是酶纯度指标，比活力愈高表达酶愈纯。回收率（产率,Yield）：回收率是指提纯后与提纯前酶的总活力之比。它表达提纯过程中酶的损失程度，回收率愈高，其损失愈少。提纯倍数：是指提纯后与提纯前比活力之比。提纯倍数愈大，提纯效果愈佳。在酶的分离纯化中每一步一直贯穿比活力和总活力的测定、比较，才能确定酶的分离纯化程度3、酶活力测定措施终止反应法:酶反应进行到一定期间后终止其反应，再用化学或物理措施测定产物或反应物量的变化。持续反应法:不必终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测持续测定反应过程中产物/底物的变化量，对测定的成果进行分析，然后计算出酶活力。测定产物增长或底物减少的措施１、分光光度法原理：运用产物和底物在紫外光或可见光部分光吸取的不一样，选择某一合适的波长，测定反应过程中反应进行的状况。2、荧光法原理：根据酶促反应的产物或底物的荧光性质的差异来进行酶活力的测定。3、同位素法原理：放射形同位素的产物或底物在经酶作用后所得的产物，通过合适的措施进行分离，从而只需要测定产物的脉冲数即可换算出酶的活力单位。一般用于标识底物的同位素重要包括3H、14C、32P、35S、131I等。4、电化学措施pH测定法，其原理：常用玻璃电极配合一台高敏捷度的pH计，跟踪监测反应过程中H+浓度变化的状况，从而用pH值的变化来测定整个酶促反应的速度，到达测定有关酶活力的目的。离子选择电极测定法如氧电极测定某些耗氧的酶（葡萄糖氧化酶）。二、底物浓度对酶反应速度的影响酶反应速度与底物浓度的关系曲线米氏常数的意义当V=Vmax/2时，Km=[S]（Km的单位为浓度单位）Km是酶在一定条件下的特性物理常数，通过测定Km的数值，可鉴别酶。Km可近似表达酶和底物亲合力，Km愈小，E对S的亲合力愈大，Km愈大，E对S的亲合力愈小。（最小的底物称为酶的最适底物或天然底物）。在已知Km的状况下，应用米氏方程可计算任意[s]时的v，或任何v下的[s]。（用Km的倍数表达）三、pH值对酶促反应速度的影响过酸过碱导致酶蛋白变性影响底物分子解离状态影响酶分子解离状态影响酶的活性中心构象四、温度对酶促反应速度的影响在到达最适温度此前，反应速度随温度升高而加紧酶是蛋白质，其变性速度亦随温度上升而加紧酶的最适温度不是一种固定不变的常数五、激活剂对酶促反应速度的影响但凡能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂（activator）。金属离子：K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+、Co2+、Fe2+无机阴离子：Cl-、Br-、I-、CN-、PO43-有机分子:还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽金属螯合剂：EDTA六、克制剂对酶促反应速度的影响但凡使酶的必需基因的化学性质发生变化,但酶并未发生变性而引起酶活力减少或丧失的作用则称为克制作用(inhibition)。导致酶发生克制作用的物质称为酶的克制剂（inhibitor）。类型:可逆的克制作用不可逆的克制作用应用:研制杀虫剂、药物研究酶的作用机理，确定代谢途径克制作用类型和特点不可逆的克制作用分为：非专一性不可逆克制作用和专一性不可逆克制作用。可逆的克制作用分为：竞争性克制作用、非竞争性克制作用和反竞争性克制剂作用。不可逆克制作用(irreversibleinhibition)：指克制剂与酶蛋白中的必需基团以共价形式结合，引起酶活力减少或丧失,不能用透析或超滤等物理措施除去克制剂而使酶复活,这种克制作用是不可逆的,称之为不可逆克制作用。例如：二异丙基氟磷酸与胰凝乳蛋白酶和乙酰胆碱酯酶的活性中心丝氨酸结合克制酶活性。非专一性不可逆克制作用：此类克制剂作用于酶分子上不一样的基团或作用于几类不一样的酶。专一性不可逆克制作用：此类克制剂只作用于与酶活性部位有关的氨基酸残基或一类酶。实例：有机磷杀虫剂。可逆克制作用(reversibleinhibition)：克制剂与酶蛋白以非共价方式结合而引起酶活力减少或丧失，但可以通过透析、超滤等物理措施除去克制剂而使酶复活，这种克制作用是可逆的，称之为可逆克制作用。竞争性克制作用(competitiveinhibition)的特点:Km增大当[S]→∞时,则Vmax不变竟争性克制作用可以通过增大底物浓度,即提高底物的竞争能力来消除克制剂和底物竞争酶的同一种结合位点（酶的活性中心），克制剂构造和底物构造类似非竞争性克制作用(noncompetitiveinhibition)特点Km不变Vmax变小非竞争性克制剂与酶活性中心以外的基团结合。此类克制作用不会因提高底物浓度而减弱反竞争性克制作用(uncompetitiveinhibition)的特点：Km变小Vmax变小可逆克制的动力学比较克制类型VmaxKm无克制剂VmaxKm竞争性克制作用不变变大非竞争性克制作用变小不变反竞争性克制作用变小变小某些重要的克制剂不可逆克制剂有机磷化合物—与酶活性直接有关的丝氨酸上的-OH牢固地结合，从而克制某些蛋白酶或酯酶。（DFP、敌百虫、敌敌畏、农药1605等）有机汞、有机砷化合物—与酶蛋白上的-SH作用，从而克制含-SH酶的活性。（对氯汞苯甲酸）氰化物—与含铁卟啉的酶中的Fe3+结合，使酶失活.重金属—能使大多数酶失活，加入EDTA可以除去.烷化剂—使酶蛋白中的–SH、-NH2、-OH等发生烷基化,失活。青霉素—与糖肽转肽酶活性部位Ser-OH共价结合，使酶失活。可逆克制剂在可逆克制剂中最重要的是竞争性克制剂。如：磺胺药、氨基叶酸等互动专题题目及分组◆酶在焙烤食品、制糖工业中的应用（10117001-13）◆酶在糊精、麦芽糊精、环糊精及油脂生产中的应用（10117014-26）◆酶在果蔬加工中的应用(10117027-39)◆酶在肉制品加工的应用(10117040-52)◆酶在乳制品中的应用(10117053-64,10108008,39,42)◆酶在贮藏保鲜中的应用(10118001-13)◆酶在发酵方面的而应用（10118014-26)◆酶在食品分析中的应用(10118027-39)◆酶与食品卫生及安全的关系(10118040-52)◆酶在功能食品中的应用((10118053-65,10128023)第三章酶的生产、分离和纯化酶来自生物体，包括动物、植物和微生物。酶的生产：通过预先设计，通过人工操作控制而获得所需要酶的过程。酶生产的措施：1、提取2、化学合成3、发酵法第一节酶的发酵生产50年代后期酶生产的重要措施，指运用动植物细胞或微生物细胞，重要是微生物细胞的生命活动而获得人们所需要的酶的过程，称为酶的发酵生产。1894年，日本人高峰让吉初次用米曲霉固体发酵生产淀粉酶作为消化剂。19，Boidin与Effront以枯草杆菌生产淀粉酶用于织物退浆。1947年，日本开始采用液体深层发酵生产a-淀粉酶。运用微生物发酵措施制取酶的长处是：1）微生物种类繁多，酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样；2）微生物生长繁殖快，发酵周期短，易提取酶，尤其是胞外酶；3）微生物培养简朴，培养基来源广泛，价格廉价。4）可采用微电脑等技术控制酶发酵生产过程，生产可持续化、自动化，经济效益高。5）可运用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育新菌种、增长酶产率和开发新酶种。1、产酶菌的获得1）生产菌的规定安全可靠，不是致病菌，在系统发生上与病原体无关，也不产生毒素。FDA(FoodandDrugAdministration)鉴定、审核后认为可用于食品工业和医药工业的生产菌有：枯草杆菌（Bac.subtilis）、黑曲霉（Asp.niger）、米曲霉（Asp.oryzae）、啤酒酵母（Sac.cereusia）、脆壁酵母（Sac.fragieis）。不易变异退化、不易感染噬菌体，产酶稳定性好。产酶量高，酶的性质符合应用需要，最佳是产胞外酶的菌株。能运用廉价原料，发酵周期短，轻易培养。产酶菌可从菌种保留机构如ATCC（AmericanTypeCultureCollection）和有关研究机构获得；一般都是通过筛选（screening）得到。筛选包括如下环节：菌样采集，菌种分离、纯化和生产性能鉴定。2）常见的产酶微生物细菌：枯草杆菌淀粉酶制糖、脱浆大肠杆菌青霉素酰化酶制备青霉素母核异型乳酸杆菌葡萄糖异构酶制果糖短小芽孢杆菌碱性蛋白酶皮革脱毛酵母：假丝酵母脂肪酶、尿酸酶等乳品增香、绢丝脱脂等啤酒酵母用于酿造啤酒、饮料酒和酒精等霉菌：黑曲霉酸性蛋白酶啤酒澄清、医药红曲霉葡萄糖淀粉酶制葡萄糖米曲霉糖化酶和蛋白酶制果糖青霉葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酶、果胶酶等木霉纤维素酶根霉淀粉酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等毛霉蛋白酶、糖化酶、果胶酶、凝乳酶等3）菌样采集相近菌种产生的酶在性质上一般相近或相似。胞外酶的稳定性和最适反应条件一般和菌的最适生长条件一致；但胞内酶的热稳定性一般比菌的最适生长温度稍低。为获得可以降解某种物质的产酶菌株，一般可从该物质比较丰富的地方寻找。4）菌种分离、纯化和生产性能的鉴定产酶菌可采用平板划线法或直接稀释法分离纯化。初筛多采用平板透明圈法。如筛选水解酶的生产菌，可以该酶的底物作为平板培养基的重要碳源或氮源，这样假如菌株包括所需要的酶，通过一段时间的培养后，就会在菌落的周围形成一透明的水解圈（clearingorlysiszone），从透明圈的大小可大体判断出菌株的产酶能力。5）产酶菌的筛选：重要依托其催化的反应的性质、底物和产物的特异性等进行设计。胞外酶筛选：使待检测的微生物在具有酶作用的不溶性底物如淀粉、纤维素、酪素、细胞壁等作为培养基中生长，培养后，根据菌落周围产生的透明圈的大小可以晒选到产淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和溶菌酶的高活性菌株。(平板透明圈法)根据催化反应的产物的酸碱性，在培养基中加入底物和酸碱指示剂，培养后，根据产生酸或碱，根据菌落周围变色圈的大小和颜色深浅进行判断，从而进行产目的酶菌株的晒选。设计特定的底物，使其在酶的作用下产生产物，产物遇底物有颜色的变化，菌落周围产生色圈，则可筛选到产酶的菌株。胞内酶筛选：对于酶作用的底物分子质量较小，能透过细胞膜在细胞内发生反应，可以将其加在培养基中，根据菌落的颜色进行筛选。对于大多数的胞内酶，是采用培养细胞或细胞破碎物作酶源，经酶反应后，根据酶反应产物的特点，运用产物对紫外的吸取，如辅酶NAD，直接用紫外分光光度法测定；或通过产物的显色反应等。2.产酶菌的保留和培养1）菌种的保留防止污染，尽量减少转移次数；防止对种子培养基进行长时间高热灭菌，以防对种子产生不良影响。菌种保留的基本原理：通过采用低温、干燥与缺氧的条件，以中断菌种的繁殖，减少其新陈代谢，使之处在休眠状态。菌种保留的措施诸多，常用的为斜面低温保留法，液体石蜡保留法等。有条件的还可采用冷冻真空干燥保留法。2）菌种的活化和扩大培养将保藏状态的菌种放入合适的培养基中培养，逐层扩大培养以恢复菌种的活力，这就叫菌种活化。为了发酵时有足够的菌种，活化了的菌种一般要通过一级至数级的扩大培养。3）培养措施固体培养。又称表面培养（surfaceculture）、曲式培养，即以麸皮、米糠等为基本原料，再加入适量的无机盐和水分（一般50%左右）作为培养基进行的一种培养方式。设备简朴，便于推广，尤其适于霉菌类的培养，由于菌丝体在这种培养基中能很好地伸展、生长，产酶率高。如曲霉和毛霉生产淀粉酶和蛋白酶，青霉和曲霉生产果胶酶，木霉生产纤维素酶；缺陷是：物料运用不完全，劳动量大，易染菌，并且不适于胞内酶的生产液体培养。又称浸没式培养（submergedculture），采用液体培养基，在发酵罐内进行的一种搅拌通气式培养，是目前酶制剂和其他发酵产品的重要培养方式。液体发酵需要一定的设备和技术条件，动力消耗也较大，但原料运用率和产量都较高，并且培养条件轻易控制。3）培养条件培养基的构成：碳源。不适宜使用葡萄糖等易被运用的碳源为培养基，也不适宜提供太丰富的碳源营养。某些碳源是酶的诱导物，定向地增进某些酶地合成，如淀粉可诱导淀粉酶的合成。氮源。氮源是菌体蛋白质和核酸的原料。多种微生物对氮源的运用状况相称复杂，有的喜欢无机氮，有的喜欢有机氮，氮源的性质，使用的浓度都能对菌的生长和酶的形成带来不一样程度的影响。碳氮比。在某些状况下，对菌的生长和产酶也有直接关系。无机盐。这些离子直接参与细胞物质的构成，或者作为酶的活性构成部分与活化剂发挥作用。生长因子。某些微量有机物质，重要是B族维生素。它们对微生物的代谢起调整作用，有时作为辅酶的构成部分，影响酶的活性。在玉米浆、酵母膏和麦芽浸液等天然物质中一般具有这些生长因子，不需要此外添加。产酶增进剂。指在培养基中添加某种少许物质,能明显提高酶的产率,此类物质称为产酶增进剂。一般有两种:一种是诱导物，可以是底物、产物或底物类似物。如纤维二糖诱导纤维素酶。另一种是表面活性剂，如吐温-80的浓度为0.1%时能增长许多酶的产量,增长细胞的通透性，改善氧的传递速度,还可保护酶的活性影响菌种产酶的原因：◆培养温度。产酶菌生长繁殖和产酶的最适温度往往不一致。培养温度也也许直接影响酶合成后的稳定性，尤其是酶的耐热性。如：55℃下培养形成的α-淀粉酶的热稳定性比35℃培养的高许多。◆pH。培养基的酸碱度对产酶影响很大。相称多的水解酶，产酶的最适pH与酶作用的最适pH相近；有些水解酶和氧化酶则相距甚远。诸多微生物能同步产生几种有关的酶，变化培养基的pH，也许影响到多种酶的合成比例。通气量。大多数产酶菌是好气菌，因此调整通气量对提高酶产量往往有直接意义。采用液体深层发酵时，较小的通气量有助于霉菌的孢子萌发和菌体生长。而较大的通气量则常可增进酶的形成。固体发酵时，菌体生长一般规定通以空气，而较小的通气量却能明显提高酶的产量。湿度。对于固体发酵比较重要，它直接影响产酶率，也与产酶到达高峰的时间有关。第二节提高酶发酵产量的措施1、酶的合成调控机制酶和其他蛋白质同样，它的合成可在复制（replication）、转录（transcription）和翻译（translation）等多种水平上进行调整控制。原核生物的转录调整机制目前普遍接受的是操纵子模型。这是通过调整酶的合成来调控。此外可通过克制酶的活性来调控。细胞所生产的物质的合成有两个负的调整系统，即通过克制酶的活性和阻遏酶的合成来调整。1）诱导酶合成的调整(添加诱导物提高酶产量)合用于可诱导的酶类，食品工业应用的酶如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、乳糖酶等均属于诱导酶。在酶合成时最佳的诱导物为该酶的作用底物或其构造类似物。加入诱导物后，一般要通过一种极短暂的潜伏期(例如几分钟)，诱导才会出现，除去诱导物后，诱导立即停止。2）酶合成的反馈阻遏(通过减少阻遏物浓度提高酶产量)反馈阻遏是指酶作用的终产物对酶合成产生的阻遏作用，引起反馈阻遏的终产物往往是小分子物质，也称为共阻遏物。调整基因产生立体阻遏物，当终产物或共阻遏物存在时，两者互相结合并与操纵基因结合，RNA聚合酶不起作用，使操纵基因关闭，酶合成受到反馈克制。若解除阻遏物即无终产物,RNA聚合酶起作用，使操纵基因启动，酶合成继续.3）分解代谢对酶合成的阻遏作用分解代谢阻遏作用（或称为葡萄糖效应）是指培养基中由于葡糖糖的存在微生物虽然能迅速生长，但明显抑某些分解代谢诱导酶的形成。葡萄糖的存在影响细胞内环腺苷酸（cAMP）的产生，cAMP是启动RNA聚合酶作用中不可缺乏的辅助因子，cAMP的缺乏导致对分解代谢的酶形成阻遏作用。4）酶合成的细胞膜透性调整调整胞外酶的分泌积极运送的调整（透性酶或表面酶）间隔作用调整（酶的催化速率受到亚细胞器构造的影响）2、通过发酵条件的控制提高酶产量菌种产酶性能是决定发酵效果的重要条件。为了提高酶产量，需对发酵过程的参数进行优化。(1)通过控制pH来提高酶产量(2)通过控制温度来提高酶产量(3)通过中间补料提高酶产量(4)通过溶解氧来提高酶产量溶氧速率的调整措施：◆调整通气量◆调整氧分压◆调整气液接触时间和面积3、通过基因突变提高酶产量基因突变（genemutation）可发生在构造基因上，也可发生在操纵子其他部位上。前者往往导致酶的构造和性质变化，而后者则一般引起酶产量升高或减少。基因突变可自发地发生，即自然育种，但机率很小，故在实际工作中需采用某些措施进行诱变，即诱变育种：物理措施：紫外线、γ-射线（Co-60）及快中子辐射等。直接引起核酸分子中四种脱氧核苷酸，尤其是C、T发生变化，导致DNA损伤和畸变。化学措施：5-溴尿嘧啶等，通过代谢渗透到DNA中引起突变；亚硝胍等，直接和DNA中地A、C、G等反应而导致异变；口丫啶黄染料等，能引起DNA链中核苷酸的插入或缺失而导致移码突变。生物诱变剂：噬菌体用来进行诱变的出发菌株选择时应注意如下几点：（1）有一定的目的产物的生产能力（2）对诱变剂敏感的菌株变异幅度大（3）生产性能好的菌株（4）可选择已经诱变后的菌株筛选的目的（1）高产菌株的筛选（2）抗分解代谢阻遏突变株的筛选（3）无孢子突变株的筛选（4）药物抗性突变株的筛选4、通过基因重组提高酶产量体内基因重组（generecombination），包括通过接合、转导、转化等措施进行的少数或者个别基因的重组；也包括通过原生质融合进行的整个染色体的重组。如：质粒（plasmid）整合、噬菌体转导（phagetransduction）、转化、原生质融合（protoplastfusion）。体外基因重组（generecombinationinvitro），简称DNA重组技术（recombinatantDNAtechnique），或基因工程（geneengineering）。它是运用酶学措施将外源基因与载体DNA在体外进行重组，然后将形成的重组子转化到受体细胞，使所需要的外源基因在受体细胞中复制体现，从而到达改造生物遗传特性目的的一种技术与措施。5、其他提高酶产量的措施（变化碳氮比，添加产酶增进剂等）添加表面活性剂。表面活性剂，尤其对胞外酶来说，也许由于能增大细胞膜的通透性，从而提高酶产量。常用的表面活性剂有:Tween80、TritonX-100(聚氧乙烯异辛基苯基醚)、油酸等。或是酶的诱导物。食品常用酶发酵生产举例：α-淀粉酶的生产枯草杆菌糖化酶的生产黑曲霉蛋白酶的生产脂肪酶的生产假丝酵母果胶酶的生产臭曲霉固态法第三节酶的分离纯化措施酶分离纯化的基本原则：1）防止酶失活（denaturation-deactivation），操作必须在低温下进行，防止过酸过碱，重金属能使酶失效，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋白质水解酶的存在能使酶分解破坏；2）选择有效的纯化措施；3）酶活力测定贯穿纯化过程的一直1.酶的抽提1)预处理与细胞破碎提取酶前，一般对原材料进行合适的预处理（pretreatmention）。例如：动物材料要先剔除结缔组织、脂肪组织；油质种子最佳先用乙醚等脱脂；种子研磨前应去壳；微生物材料应将菌体和发酵介质分离；部分酚类物质含量高的材料如茶鲜叶在细胞破碎的同步应防止多酚吸附蛋白质。动植物材料先要进行细胞破碎（celldisruption），一般采用匀浆器（homogenizer）或加砂研磨。许多材料研磨后可先制成丙酮粉（acetonepowder）。材料粉碎后，低温下加入5~10倍预冷的丙酮，搅拌均匀后过滤，低温干燥。丙酮处理首先能有效地破坏细胞壁（膜），有助于除去大量脂质，使某些与膜结合的酶易于溶解，此外丙酮粉含水量低，便于保留。但有些酶不能采用此法。细胞破碎的措施：(1)机械(匀浆)法(2)超声波法(3)冻融法(4)渗透压法(5)酶消化法(6)化学破碎法（有机溶剂处理和表面活性剂处理riton、Tween）2)抽提措施大多数酶属于球蛋白类，一般都溶于稀盐、稀酸或稀碱的水溶液。抽提液的选择要考虑酶的溶解性、稳定性以及怎样最有助于切断酶和其他物质的联络。选择的pH不能超过酶的稳定范围，远离目的酶的等电点。大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度，因此一般采用等渗盐溶液。抽提温度多控制在0-4℃左右。根据酶抽提时采用的溶剂或溶液的不一样,酶的提取措施有如下几种:(1)盐溶液提取(2)酸溶液提取(3)碱溶液提取(4)有机溶剂提取(1)盐溶液提取大多数酶溶于水,并且在一定浓度的盐存在的条件下,酶的溶解度增长,这称之为盐溶现象,不过盐浓度不能太高,否则溶解度反而减少,出现盐析现象。一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控制在0.02~0.5mol/L的范围内。(2)酸溶液提取有些酶在酸性条件下溶解度较大并且稳定性好，这种酶宜用酸溶液提取。(3)碱溶液提取有些酶在碱性条件下溶解度较大且稳定性很好，应采用碱溶液提取。(4)有机溶剂提取有些与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多的酶,不溶或难溶于水、稀酸、稀碱和稀盐溶液中，需用有机溶剂提取。常用的有机溶剂是与水可以混溶的乙醇、丙酮、丁醇等。3)浓缩浓缩（concentration）首先减少纯化操作容积，同步酶的稳定性也能提高。工业上可用真空减压浓缩、薄膜浓缩、冷冻浓缩和逆向渗透作用进行浓缩。对于少许酶液下述措施浓缩更合适：超过滤浓缩（ultrafiltration）；凝胶浓缩；聚乙二醇浓缩法。2.酶的纯化原理与措施1）根据溶解度的不一样，有盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法及选择性沉淀法和等电点沉淀法等。2）根据分子大小的差异，有凝胶过滤（层析）法、筛膜分离法和离心法等。3）根据分子的解离性质和所带正负电荷的种类及量的不一样，有吸附（层析）法、离子互换层析法、电泳法以及聚焦层析法。4）基于酶和底物、辅助因子以及克制剂间具有专一亲和作用的特点而建立的多种亲和分离法等。5）运用稳定性差异而建立的的分离措施有选择性热变性法、酸碱变性法和表面变性法等。6）色谱法。7）结晶。在酶蛋白质提纯过程中，当酶的纯度到达一定浓度就可以进行酶蛋白质的结晶。目前，对蛋白质结晶的爱好重要在于制备适合于X-射线衍射研究、中子衍射研究的晶体。合用于这种研究的单晶（最小晶体），其线性大小至少在0.2毫米以上。要培养出这样的单晶，必须寻找合适的结晶条件。常用的分离措施(1)沉淀法:盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、非离子型聚合物沉淀法、聚电解质沉淀法和高价离子沉淀法等。(2)凝胶过滤(3)亲和层析(4)染料层析(5)疏水层析(6)电泳法(1)沉淀法沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的措施。但目前仍然广泛应用在工业上和试验室中。沉淀法由于成本底、收率高，因而一般作为初步分离的一种手段。根据所加入的沉淀剂的不一样,沉淀法又分为:盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、非离子型聚合物（PEG)沉淀法、聚电解质沉淀法和高价离子沉淀法等。(2)凝胶过滤(gelfiltrationchromatography)凝胶过滤又称凝胶层析、凝胶排阻层析、分子筛层析等，它是根据溶质分子的大小进行分离的措施。在酶纯化中占有重要位置。长处：操作以便、物质不变性、可反复使用等。应用：脱盐、生物大分子按分子的大小分级分离以及分子量的测定。凝胶的种类1、葡聚糖凝胶白色粉末,不溶于水和盐溶液,因具有大量羟基,亲水性大,在水中即显膨胀,它对弱酸和弱碱稳定,其商品名是SephadexG-X。G-后的数字表达每克干胶吸水量的10倍。2、聚丙烯酰胺凝胶以丙烯酰胺为单体，通过交联剂共聚而成的凝胶物质，其商品名是Bio-GelP-X，P-后的数字乘以1000表达其分离的最大分子量。3、琼脂糖凝胶琼脂糖是琼脂抽去琼脂胶之后所得半乳糖自动缔合而成的网眼构造物质,孔径大小由胶的浓度决定。有商品Sepharose2B、4B、6B等规格,SepharoseCL,Bio-GelA。凝胶层析的操作凝胶的选择装柱加样洗脱凝胶的再生和保养(4)染料层析：用染料做亲和配基，这些染料构造中都具有三嗪环。(5)疏水层析：将疏水性基团固定到介质上，这些基团与蛋白质生物大分子上的疏水区亲和。同一疏水基团对不一样蛋白质的亲和力存在差异，从而到达分离的效果。(6)电泳法:是靠溶质在电场中移动速度不一样而分离的措施。在电泳中，常伴有电渗现象。在电场中，液体相对于一种固定固体的相对移动，称为电渗。3.酶分离、纯化的评价酶纯化收支表环节酶活力蛋白浓度总体积总活力总蛋白比活力产量纯化倍数（U/ml）(mg/ml)(ml)(U)(mg)(U/mg)(%)一般用电泳法检测酶的纯度，最终的纯度原则，当然是唯一的氨基酸次序，但很少用它来鉴定纯度。SOD酶纯化过程新鲜动物血分离红血球生理盐水洗涤破裂红细胞有机溶剂萃取沉淀热变形盐析过离子互换树脂柱透析冷冻干燥酶制剂4.酶分子量的测定一般采用超离心沉降速度、凝胶层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳措施和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF）测定酶的分子量。5.酶的剂型与保留酶制剂常以四种剂型供应：液体酶制剂。在除去菌体后不再纯化而直接制成或加以浓缩，比较经济，但不稳定，并且成分复杂。固体酶制剂。发酵液通过杀菌后直接浓缩干燥制成，有的则加有淀粉等填充料。纯酶制剂。包括结晶酶在内，一般用作分析试剂或用作医疗药物，规定有较高的纯度。固定化酶制剂。是借助物理措施或化学措施将酶固定于水不溶性或者水溶性载体而制成的一种酶制剂形式。影响酶保留期的原因(1)温度:在低温条件下(0~4℃)使用、处理和保留。(2)pH值:pH应在酶的pH稳定范围内，采用缓冲液保留。(3)酶蛋白的浓度:一般酶浓度高较稳定,低浓度时易于解离、吸附或表面发生变性失效。(4)氧:有些酶易于氧化而失活。(5)为提高酶的稳定性常加入稳定剂。（底物、克制剂和辅酶；对巯基有保护作用的保护剂；Ca2+保护淀粉酶；Mn2+保护溶菌酶）共价调整酶共价调整酶（covalentregulatoryenzyme）是一类由其他酶对其构造进行可逆共价修饰，使其处在活性和非活性的互变状态，从而调整酶活性。共价调整酶一般都存在相对无活性和有活性两种形式，两种形式之间互变的正、逆向反应由不一样的酶催化。磷酸化是可逆共价修饰中最常见的类型。蛋白激酶的调整作用能被催化水解磷酸基团的蛋白质磷酸酶逆转。通过磷酸化和脱磷酸化作用，使酶在活性形式和非活性形式之间互变。此外尚有腺苷酸化/脱腺苷酸化、甲基化/脱甲基化，乙酰基化/脱乙酰基化等。抗体酶(Abzyme)具催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶或催化抗体。通过变化抗体中与抗原结合的微环境，并在合适的部位引入对应的催化基团，所产生的具有催化活性的抗体。由两种途径获得抗体酶：①采用过渡态的底物类似物诱导；②在既有的抗体基础上，通过化学修饰或通过蛋白质工程向其配体结合部位导入催化基团。1986年——Pollack,S.J.等人报道了具有催化活性的抗体，被认为抗体酶。抗体酶具有经典的酶反应特性；抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。第四章酶的稳定性和固定化第一节酶的稳定性的分子原因酶的稳定性是指酶抵御多种原因的影响，保持其活性的能力。酶的催化活性是由其特殊的空间构造决定的。稳定的酶的空间构造是由稳定酶空间构造的力决定的。稳定蛋白质构象的力：◆盐键、氢键和范德华力蛋白质中盐键的数目较少，但由于它能维持二级构造，对蛋白质的稳定性作用明显。◆二硫键、酯键蛋白质分子内形成二硫键，使伸展蛋白质的熵急剧减少，因而天然蛋白质和变性蛋白质的自由能间的差异增长。◆疏水作用带有非极性侧链的氨基酸大概占蛋白质分子总体积的二分之一，蛋白质的非极性部分总是趋向于使其不与水接触，并尽量地隐藏在蛋白质的内部。这种疏水作用使蛋白质稳定性增长。酶稳定的分子原因：◆稳定蛋白质构象的力(盐键、氢键、二硫键、酯键、范德华力和疏水作用)。金属离子、底物、辅助因子和其他低相对分子量配体和酶互相作用使酶蛋白构象稳定。金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（尤其是拐弯处），可以明显增长酶的稳定性。酶蛋白质与其他的生物大分子尤其是蛋白质与脂的作用。在生物体内，蛋白质常与脂类或多糖互相作用形成复合物，屏蔽了蛋白质表面的疏水区域，从而明显增长蛋白质的稳定性。氨基酸残基的坚实装配蛋白质分子中存在约25%的体积的空隙，这些空隙一般为水分子所充斥。由布朗运动调整的极性水分子与蛋白质疏水核的接触会导致蛋白质不稳定。对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低活性部位的氨基酸残基的氧化作用是酶失活的最常见机理之一。如半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环，对氧化尤其敏感。第二节酶不可逆失活的原因和机理蛋白质水解酶作用微生物和外源蛋白水解酶作用催化肽键水解。由基因工程菌纯化真核细胞多肽时收率低，是由于体外蛋白水解导致的。聚合作用聚合作用首先使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂，导致蛋白质可逆变性；另一方面，蛋白质分子彼此缔合，以减少疏水氨基酸的不利裸露；最终，假如蛋白质分子具有半胱氨酸和胱氨酸残基，则会发生分子间二硫键互换反应。聚合作用有时可通过还原和再氧化再生天然二硫键，使蛋白质再活化。聚合和简朴沉淀是有区别的，后者并未使蛋白质发生明显的构象变化。极端pH极端pH条件下，一旦远离蛋白质的等电点，蛋白质分子内相似相似电荷间的静电斥力会导致蛋白质伸展，埋藏在蛋白质内部的非电离残基会电离，这些构象变化能导致不可逆失活。此外，强酸条件下或中等pH和高温相结合的条件下，肽键轻易发生水解。如:碱催化的β-消除反应可破坏蛋白质的二硫键。氧化作用多种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。常见的蛋白质氧化剂：分子氧、过氧水和氧自由基。表面活性剂(去污剂)阴离子去污剂如十二烷基硫酸钠（SDS）与蛋白质结合时导致蛋白质伸展，使原先埋藏的疏水氨基酸暴露，有助于SDS的深入结合，直至到达饱和为止，SDS汇集在蛋白质暴露的疏水区域周围。对于所有蛋白质来说，每克蛋白质结合SDS的最大量类似，大概1.4g/g。阳离子去污剂也能结合蛋白质，而它的临界胶束浓度（CMC）是SDS的10倍，因而，蛋白质更能抵御阳离子去污剂的变性作用。非离子去污剂如TritonX-100一般不能使蛋白质变性。变性剂（脲和盐酸胍、高浓度盐、螯合剂、有机溶剂）重金属离子和巯基试剂重金属阳离子如Hg2+、Cd2+、Pb2+能与蛋白质的巯基反应（将其转化为硫醇盐），也能与组氨酸和色氨酸残基反应。此外银或汞能催化水解二硫键。巯基试剂通过还原二硫键也能使酶失活，但一般是可逆的。热热失活是最常见的蛋白质失活方式。酶可逆伸展使它的反应基团和疏水区域暴露，随即互相作用导致不可逆失活。机械力机械力（压力、剪切力、振动）和超声波能使蛋白质变性。冷冻和脱水低温减弱了疏水互相作用，引起蛋白质的解离和变性。冷冻过程中，蛋白质伴随水分子结晶而被浓缩，引起酶微环境中的pH和离子强度的剧烈变化，从而引起寡聚蛋白质的解离。尚有一原因是二硫键互换和巯基氧化。酶的失水和冷冻是相似的。辐射作用电离辐射（如X射线、γ射线、电子、α粒子）由于形成自由基引起蛋白质一级构造的变化，导致天然构象丧失或聚合。非电离辐射，如可见光或紫外线辐射也能使蛋白质失活。它能吸取光，然后氧化蛋白质分子中的敏感基团（半胱氨酸、色氨酸、组氨酸）。第三节酶的稳定化一、固定化酶固定到载体上后产生空间障碍，其他大分子难以与酶作用。固定化后，载体阻挡酶不能与失活剂结合，因而能克制化学失活。在固定化系统中，氧向酶的扩散可被多价电解质支持物的盐析效应所遏止，因此可稳定对氧不稳定的酶蛋白。酶包埋在多孔颗粒内部，首先使酶的构象愈加结实，从而制止酶构象从折叠态向伸展态过渡,克制酶的自降解；另首先，对底物的扩散克制可明显使固定化酶稳定化。固定化酶由于微环境的变化，其最适pH、底物专一性和动力学常数会发生变化。二、非共价修饰反相胶束是由两性化合物在占优势的有机相中形成的，它可以包埋酶或使酶微囊化，使酶在不利的环境下起作用。许多化合物可增长溶液酶或冻干过程中酶的稳定性。此类添加剂分为3类：专一性的底物和配体；非专一性的中性盐和多羟基化合物；与酶失活剂竞争的物质如蛋白质、螯合剂、还原剂。蛋白质间非共价相连,由于从蛋白质表面互相作用区域排除水，因而减少自由能，增长蛋白质的稳定性。酶的聚合体的活力和稳定性也常比其单体高。三、化学修饰可溶性大分子修饰酶。如聚乙二醇、右旋糖酐、肝素等多糖以及白蛋白、多聚氨基酸等，可通过共价键连结于酶表面，形成一种覆盖层，这种可溶性的固定化酶有诸多有用的新性质。可溶性小分子修饰酶。由于修饰“关键功能基团”也会到达稳定化，会获得不一样于天然蛋白质构象的更稳定构象；用非极性试剂修饰会加强蛋白质中的疏水作用，蛋白质的表面基团亲水化。四、蛋白质工程用基因操作技术高度专一性地变化目的蛋白质。第四节固定化酶和固定化细胞固定化酶（immobilizedenzyme）是指在一定空间范围内起催化作用,并能反复和持续使用的酶。固定化酶的长处:极易将酶与底物、产物分开；可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱持续反应；在大多数状况下，可以提高酶的稳定性；酶反应过程可以加以严格控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；较游离酶更适合于多酶反应；可以增长产物的收率，提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本减少。固定化酶的缺陷:固定化时，酶活力有损失；增长了生产的成本，初始投资大；只能用于可溶性底物，并且较合用于小分子底物，对大分子底物不合用；与完整菌体相比不合适于多酶反应，尤其是需要辅助因子的反应；胞内酶进行固定化时必须通过酶的分离纯化操作。固定化酶的制备原则:必须注意维持酶的催化活性及专一性。固定化应有助于生产自动化、持续化。。固定化酶应有最小的空间位阻。尽量不阻碍酶与底物的靠近，以提高产物的量。酶与载体必须有一定的结合程度。即不影响酶的原有构象,又使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用。固定化酶应有最大的稳定性。所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。固定化酶成本要低。以利于工业使用。一、吸附法物理吸附法：酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化措施。无机载体有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等；有机载体有淀粉、纤维素、胶原等；近来，大孔型合成树脂、陶瓷等载体也十分引人注目；此外尚有疏水基的载体（丁基或己基-葡聚糖凝胶），以及以单宁作为配体的纤维素衍生物等载体。物理吸附法酶活力损失少，但轻易脱落。离子吸附法(ionbinding)：酶通过离子键结合与具有离子互换基的水不溶性载体的固定化措施。用于此法的载体有阴离子互换剂如DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶；阳离子互换剂如CM-纤维素，Dowex-50等。二、共价结合法(covalentbinding)酶与载体以共价键结合的固定化措施，是载体结合法中报道最多的措施。归纳起来有两类，一是将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应；另一种是在载体上接上一种双功能试剂，然后将酶偶联上去。可与载体结合的酶的功能团有氨基、羧基、巯基、羟基、咪唑基、酚基等，参与共价结合的氨基酸残基不应是酶催化活性所必需的，否则会导致固定后酶活力丧失。所用载体分三类：天然有机载体（如纤维素、葡聚糖凝胶等）、无机物（玻璃、陶瓷等）和合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等），其活化措施依载体性质各不相似。三、交联法(crosslinking)用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物与微生物细胞之间交联的固定化措施。最常见的交联剂是戊二醛。交联法反应条件比较剧烈，固定化酶活回收率一般较低。包埋法(entrapment)将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为凝胶包埋(gel/latticentrapment)。载体材料有海藻酸纳、角叉菜胶、明胶和卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光胶联树脂等合成凝胶或树脂。天然凝胶采用溶胶状天然高分子化合物在酶或微生物存在下凝胶化的措施。合成高分子则采用合成高分子单体或预聚物在酶或微生物存在下聚合的措施，但会引起酶的部分失活。网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的措施。将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微囊型包埋(microentrapsulation)。微囊型固定化酶一般直径为几微米的球状体，颗粒比网格型的要小得多，适合小分子底物和产物的酶的固定化，如脲酶、过氧化氢酶等。其制造的措施有：界面沉淀法、界面聚合法、二级乳化法和液膜法等。固定化后酶活力的变化及其原因:固定化酶的活力在多数状况下比天然酶小，其专一性也能发生变化。原因也许是：酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至会影响活性中心的氨基酸残基；固定化后，酶分子空间自由度受到限制，直接影响到活性中心对底物的定位作用；内扩散阻力使底物分子与活性中心的靠近受阻；包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶靠近。固定化对酶稳定性的影响大多数状况下，酶固定化后稳定性有所提高：固定化酶热稳定性提高；对多种有机试剂及酶克制剂的稳定性提高；固定化酶对pH稳定性、对蛋白酶稳定性、贮存稳定性和操作稳定性均有提高。固定化后酶稳定性提高的原因：酶分子与载体多点连接，可防止酶分子变形；酶活力的缓慢释放；克制酶的自降解。辅酶物质的固定化举例：酪氨酸脱羧酶的固定化需要磷酸吡哆醛为辅酶。此类酶可以直接偶联固定，也可以通过辅酶物质对酶蛋白进行亲和吸附固定。可采用下面三种措施：CNBr活化结合法、重氮反应或烃化反应加臂偶联法；通过磷酸吡哆醛亲和结合法。亲和固定法的长处是它对酶蛋白的高级构造影响较小；缺陷是由于在亲和结合中要用去酶的一种活性中心，酶将因此失去部分催化能力。酶蛋白和辅酶结合弱，固定化后需要补充此外对应的辅酶物质，酶才能发挥其正常的催化功能。为了防止辅酶物质的流失，一般的措施是先将它们结合于水溶性载体如葡聚糖等上，然后再和固定化的酶蛋白混合一并放于半透膜内。偶联酶系的固定化某些生化反应需要多种酶协同完毕，固定化的偶联多酶系统是符合这种规定的高效而简便的应用形式。偶联的多酶系统可以通过多种方式进行固定化：用胶或微囊进行混合包埋；以共价偶联方式共固定于同一载体上或分别固定于不一样颗粒或膜构造上。固定化细胞优越性：1)无需进行酶的分离、纯化，减少酶活力的损失，减少成本；2）可以进行多酶反应，且不需添加辅助因子；3）保持酶的原始状态，酶的稳定性更高，对污染的抵御力更强；4）细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快。固定化细胞的缺陷：1)菌体自溶，影响产物纯度；2）细胞内蛋白酶对目的酶的分解；3）胞内多酶的存在会形成副产物；4）载体、细胞膜、细胞壁会导致底物渗透与扩散障碍。固定化细胞物理吸附法重要运用细胞与载体之间的静电引力和专一的亲和作用，使细胞规定在不一样的载体（如硅藻土、陶瓷、玻璃和塑料）上。如酵母细胞带负电荷，在固定化时可用带正电荷的载体使其固定化。包埋法将细胞包埋在多孔在体内而制成固定化细胞的措施。这是固定细胞最常用的措施。包埋法分为凝胶包埋法和半透膜包埋法等。常用的包埋材料为聚丙烯酰胺、琼脂、明胶、海藻酸钙和角叉（菜）胶等，其中聚丙烯酰胺应用最多最早。直接固定化法不用载体，借助物理或化学措施将细胞直接固定的措施。这种固定化既可发生在细胞构造上，也可通过细胞汇集来完毕。对于微生物，可以借助加热、冰冻或β-射线等物理手段进行固定化，也可应用柠檬酸、多种絮凝剂、交联剂和变性剂等处理到达固定化。固定化酶在食品工业中的应用：固定化酶在淀粉和糖工业中的应用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆固定化蔗糖酶有蔗糖生产转化糖固定化α-半乳糖苷酶水解棉子糖固定化酶在乳制品中的应用固定化β-半乳糖苷酶（乳糖酶）水解乳糖固定化过氧化氢酶用于牛乳的灭菌固定化酶在饮料和果汁生产中的应用固定化酶在啤酒生产中的应用固定化酶在果汁生产中的应用在速溶茶生产中的应用固定化酶在油脂改性中的应用固定化1,3-特异性脂肪酶催化酯互换，将棕榈油改性为代可可脂。固定化酶在食品添加剂和调味剂中的应用固定化富马酸酶生产L-苹果酸等酸味剂。固定化酶生产L-谷氨酸、赖氨酸等。固定化酶生产阿斯巴甜等甜味剂。固定化酶直接作为食品的防腐剂使用。固定化酶在食品分析与检测中的应用葡萄糖酶传感器：葡萄糖氧化酶+氧电极脲酶电极法测定食品赖氨酸的含量固定化蔗糖转化酶,葡萄糖变旋酶及葡萄糖氧化酶的复合酶膜构成的过氧化氢双电极系统,可同步测定样品中蔗糖和葡萄糖的含量在酿酒过程中,将乙醇酶和葡萄糖氧化酶固定成酶膜,与电极连接,制成的生物传感器可监控葡萄糖和乙醇的浓度;运用嘌呤氧化酶电极,检测酶催化反应中过氧化氢的产生量,可对鱼新鲜度进行测定;淀粉双酶传感器可以测定食品中淀粉的含量。第五节酶反应器(Reactorsforenzymaticcatalysis)什么是酶反应器？用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。酶反应器是用于完毕酶促反应的关键装置。它为酶催化反应提供合适的场所和最佳的反应条件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大程度地转化成产物。它处在酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。酶反应器类型(1)批量式酶反应器又称为间歇式反应器（BatchStirredTankReactor，BSTR）、间歇式搅拌罐、搅拌式反应罐。其特点是：底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完毕之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。长处是：装置较简朴，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅速到达稳态。缺陷是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。(2)持续式酶反应器又称为持续搅拌釜式反应器（ContinuousStirredTankReactor,CSTR）、持续式搅拌罐。向反应器投入固定化酶和底物溶液，不停搅拌，反应到达平衡之后，再以恒定的流速持续流入底物溶液，同步，以相似流速输出反应液（含产物）。长处是：在理想状况下，混合良好，各部分构成相似，并与输出成分一致。缺陷是：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒(3)填充床反应器填充床反应器（PackedBedReactor,PBR）,又称固定床反应器。将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，搜集输出的转化液（含产物）。长处是：高效率、易操作、构造简朴等，因而，PBR是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。它合用于多种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物克制的转化反应。缺陷是：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶液含固体颗粒或黏度很大时，不适宜采用PBR。(4)流化床反应器流化床反应器（FluidizedBedReactor,FBR）。特点是：底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒一直处在流化状态。其流动方式使反应液的混合程度介于CSTR的全混型和PBR的平推流型之间。FBR可用于处理黏度较大和具有固体颗粒的底物溶度，同步，亦可用于需要供气体或排放气体的酶反应（即固、液、气三相反应）。但因FBR混合均匀，故不合用于有产物克制的酶反应。(5)持续搅拌桶-超滤反应器(CSTR/UF)CSTR/UF构造是CSTR与UF超滤装置联用的酶膜反应器。在CSTR的出口处设置一种超滤装置，通过超滤装置，酶可以循环使用。其构造如下图所示。该超滤装置的半透膜只容许小分子产物通过，不容许大分子酶和底物通过。该反应器合用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。(6)循环反应器(RecycleReactor,RCR)循环反应器是将部分流出物与加料流混合，然后再将其送入反应器。循环反应器可分为：外循环反应器和内循环反应器。(7)膜反应器膜反应器（membranereactor,MR）是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应器。膜反应器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纤维型、转盘型等多种形状。常用的是中空纤维反应器。第五章酶修饰与模拟第一节、酶的修饰什么是酶分子修饰？通过多种措施使酶分子的构造发生某些变化，从而变化酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的措施与某些化学基团（物质），尤其是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而变化酶的构造和性质。酶分子修饰的措施：(1)酶的金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生变化的修饰措施称为金属离子置换修饰。若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。假如重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶展现出不一样的特性。有的可以使酶的活性减少甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增长酶的稳定性。(2)酶的大分子结合修饰运用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间构造发生某些细微的变化，从而变化酶的特性和功能的措施，称为酶的大分子结合修饰法。通过大分子结合修饰的酶可明显提高酶活力、增强稳定性和减少抗原性。常用的水溶性大分子修饰剂有右旋糖苷、聚乙二醇、聚蔗糖、淀粉、白蛋白、明胶等。酶活力减少到本来活力的二分之一所通过的时间，称为酶的半衰期。例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶(SOD),不仅可以减少或消除酶的抗原性，并且提高了抗蛋白酶的活力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。(3)酶分子的侧链基团修饰采用一定的措施（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生变化，从而变化酶分子的特性和功能的修饰措施。用于研究多种基团在酶分子中的作用及其对酶的构造、特性和功能的影响。在研究酶的活性中心中的必需基团时常常采用。酶蛋白的侧链基团是指构成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。重要包括氨基、羧基、巯基、酚基等。这些基团可以形成多种副键，对酶蛋白空间构造的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦变化将引起酶蛋白空间构象的变化，从而变化酶的特性和功能(4)酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰)运用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学构造及其空间构造发生某些变化，从而变化酶的特性和功能的措施。酶蛋白主链修饰重要是靠酶切/酶原激活法。5)氨基酸置换修饰将酶分子肽链上某个氨基酸换成另一种氨基酸的修饰措施，称为氨基酸置换修饰。氨基酸的置换修饰可以采用化学修饰措施。目前常用的氨基酸置换修饰的措施是定点突变技术。(6)酶分子的亲和标识修饰亲和标识是一种特殊的化学修饰措施。它运用酶和底物的亲和性,使用与酶底物类似的修饰剂,对酶活性部位上的氨基酸残疾进行共价标识。此类专一性的化学修饰也称为亲和标识或专一性的不可逆克制修饰。即试剂作用于被作用部位的某一基团。可用来作为治疗某些疾病的有效药物。(7)酶分子的物理修饰通过物理修饰，可以理解不一样物理条件下，尤其是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的变化而引起酶的特性和功能的变化状况。特点在于不变化酶的构成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生变化，只是在物理原因的作用下，副键发生某些变化和重排。酶修饰后的性质变化热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。各类失活因子的抵御力：修饰酶对蛋白酶、克制剂均有一定的抵御能力，从而提高其稳定性。半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、克制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更靠近于生理环境，在临床应用上有较大意义。Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。第二