浅谈大一统与纳米粒子的相互作用

浅谈大一统与纳米粒子的相互作用

为了维持细胞的正常功能，细胞必须从环境中吸收各种物质。几乎所有的真核细胞都通过内吞作用摄取细胞外基质中的大分子,因此细胞内吞是细胞生理代谢中一个极为重要的现象。目前,已有大量研究涉及大分子以及纳米颗粒如何被细胞识别、结合、内化、分选及在细胞内的分布等相关内容。这些研究证实,细胞能有选择地从周围环境中摄入物质,并在一种极精细的调节下将不同的物质分别以不同的途径送到胞内不同的区域。许多药物只有在细胞内才能有效地发挥作用,因而利用载体将药物分子传输至细胞内可以大大提高药物的疗效。目前,可以通过多种方法如电穿孔、显微注射、脂质体转染、病毒载体、细胞穿膜肽等提高药物分子的细胞吸收。另外,细胞对纳米粒子的吸收主要通过胞吞途径进行,这些通过胞吞作用进入细胞的纳米粒子将被运输至溶酶体,并在此被消化降解,从而大大减弱了纳米粒子所携带药物的药效。因此本文作者旨在总结纳米粒子进入细胞的最新研究进展,并着重介绍纳米粒子的表面特性对细胞吸收纳米粒子的影响,同时还简要介绍物质从内涵体中逃逸的策略。1胞吞或其他功能在细胞的新陈代谢过程中,大分子物质及颗粒性物质一般不能直接穿过细胞膜,它们在进出细胞的转运过程中都是通过膜包裹、形成囊泡、与膜融合或断裂来完成的,故又称囊泡转运。由于囊泡转运涉及膜的融合与断裂,因此需要消耗能量,属于主动运输。细胞摄入大分子或颗粒物质的囊泡转运过程称为胞吞作用;细胞排出大分子或颗粒物质的囊泡转运过程称为胞吐作用。胞吞作用称内吞作用或入胞作用,根据胞吞物质形态,可分为胞饮作用和吞噬作用。其中细胞对液体及溶解在液体中的溶质的摄入过程称为胞饮作用,而对固体颗粒的摄入过程称为吞噬作用。1.1细胞锁合物胞饮作用根据入胞机制的不同又分为网格蛋白介导的胞饮作用、小窝蛋白介导的胞饮作用和巨胞饮。1.1.1网格蛋白包被囊泡的分离网格蛋白介导的胞饮作用的具体机制为细胞外溶质(配体)同细胞表面特异性受体相结合,形成配体-受体复合物,并向有被小窝集中,衔接蛋白识别跨膜受体胞质面肽链尾部的内吞作用信号,将其连接到网格蛋白包被上;网格蛋白在质膜胞质侧组装产生的力牵拉质膜向内凹陷;在动力蛋白作用下,深陷的有被小窝自颈部与质膜断离形成网格蛋白包被囊泡;脱去网格蛋白后形成的裸露转运小泡与早期内体融合,最后配体在细胞内被消化。1.1.2内吞形成膜小窝是细胞膜上特定的直径50～100nm的细颈瓶状的膜功能筏,富含胆固醇、鞘磷脂和鞘糖脂,形成一个去垢剂不溶性的膜区域,并且以存在小窝蛋白为特征。当发生内吞作用时,细胞外溶质(配体)与小窝的脂锚定蛋白(受体)特异性结合,并启动下游复杂的信号转导而发生内吞作用。小泡形成后,小窝蛋白呈同心圆状线条覆盖在小泡胞质面成为小窝蛋白包被小泡。包含配体的窝室因不与溶酶体融合,从而避免配体的降解,最后配体以功能活性状态被运输到细胞内各个位点,或回到细胞外。1.1.3巨胞饮作养血药浓对代谢的影响巨胞饮是内吞的一种形式,指在某些因素刺激下,细胞膜皱褶形成大且不规则的原始内吞小泡,它们被称为巨胞饮体。通常巨胞饮作用能显著地被细胞松弛素D和秋水仙碱抑制,提示微管和微丝在这个过程中扮演重要角色。研究结果表明,巨胞饮受到PI3激酶、Rac1、P21-活化的激酶、肌球蛋白、WASP相互作用蛋白、胆固醇和Rab家族的调节。巨胞饮具有清除凋亡细胞、参与免疫反应、介导某些病原菌侵袭细胞、更新细胞膜等功能。1.2颗粒表面促进血药浓度的变化吞噬细胞表面有多种与吞噬机制相关的表面受体,如免疫球蛋白的Fc受体、补体受体及模式识别受体(PRRs)等。吞噬作用是一个触发过程,外源性颗粒表面病原相关基序与巨噬细胞表面特异受体相互作用,使颗粒与细胞表面结合,引起摄入部位肌动蛋白聚合及伪足包裹颗粒,然后伪足融合形成囊泡。在胞质内,动力蛋白在囊泡颈部装配成环,并水解与其结合的GTP,动力蛋白收缩使囊泡自颈部与细胞膜断离形成吞噬体,吞噬体最后与溶酶体融合,结果病原体被溶酶体内的酸性水解酶消化降解。2细胞穿透肽cpp在分子生物学研究、基因治疗和制药工业中,需要将蛋白、多肽、核苷酸、药物等大分子导入细胞内发挥作用。现有的通过细胞膜向细胞内转运的技术有电穿孔、显微注射、脂质体转染和病毒载体等。因为这些技术对细胞具有较强的损伤作用,并且不能避免细胞内溶酶体引起的降解,使得它们的应用受到很大的限制。近十多年来,陆续发现了一些具有穿透细胞膜和(或)核膜的氨基酸序列,内化后能定位于细胞质或细胞核,长度多数为小于30个氨基酸的多肽分子,被命名为细胞穿透肽(cellpenetratingpeptides,CPP)。它们可以携带亲水性蛋白、多肽、DNA甚至颗粒性物质等进行细胞的跨膜转运或细胞内传输,并且不受细胞类型的限制,在细胞生物学、基因治疗学以及药学等领域具有很大的应用价值(图1)。其中发现最早、研究最多的细胞穿透肽来源于人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus-1,HIV-1)的转录活化因子(transactivatingtranscriptionalactivator,Tat)。后续还发现了Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpessimlexvirusType1,HSV-1)蛋白的VP22和果蝇同源触角蛋白(drosophilahemeoproteinantennapediatranscriptionprotein,Antp)等。2.1子带的皇帝膜吸收机制2.1.1cpp的细胞内化机制细胞对CPP的跨膜吸收机制以及如何将CPP运用于体内现在仍然是一个谜团。起初有研究者认为,CPP的内化机制是不受胞吞和受体控制的。2003年Richard等修正了原有的CPP细胞内化机制,并提出CPP进入细胞的过程主要与内涵体途径有关。至此,很多种类CPP的细胞吸收机制被重新审视,并且报道认为CPP主要通过胞吞途径进入细胞[21,22,23,24,25,26]。尽管现在仍然很难对CPP的细胞内化机制建立一些基本的框架,但研究者们在某些方面已达成一致,比如CPP通过与细胞膜上的蛋白多糖发生静电作用从而与细胞膜首先发生接触,并且CPP的细胞内化途径主要由以下几个参数调控:(1)CPP的本性和二级结构;(2)CPP与细胞表面和膜磷脂组分发生相互作用的能力;(3)CPP所携带“货物”的本性、类型和活度;(4)细胞类型和膜的组成。2.1.2细胞骨架的重新调整和细胞的内化机制蛋白多糖在细胞表面微区域的调控方面发挥主要作用,同时有证据表明细胞骨架构造与一部分GTP酶的活化直接相关。肝素硫酸酯蛋白多糖与黏结蛋白聚糖是细胞外基质的主要组成部分,伴随蛋白激酶C和Rho/RacGTP酶的活化,这些蛋白多糖成簇聚集导致细胞骨架重新调整,从而调控胆固醇富集“筏”微区域的动力学行为并最终调控配体的吸附和细胞的内化机制。首先CPP通过与细胞膜上的葡糖胺聚糖发生静电吸附从而与细胞膜发生接触,接着肌动蛋白网络结构重新调整,并且选择性活化少部分GTP酶RhoA或Rac1。GTP酶的活化和肌动蛋白的重新调整预示着细胞内化机制的开始并对细胞膜的流动性产生重要影响,结果促进Arg8、penetratin和Tat通过大胞饮作用或网格蛋白介导的胞吞作用进入细胞,而MPG或Pep-1粒子通过膜的微扰机制进入细胞。2.1.3膜脂质及细胞外基质与cpp的相互作用由于CPP吸附在葡糖胺聚糖上,这种吸附有利于CPP以及CPP与所载“货物”形成的复合物在细胞表面聚集,同时随着CPP种类的不同,他们进入细胞有不同的门控。将CPP所携带“货物”的生物学反应与CPP进入细胞的机制联系起来是我们有效利用CPP的首要条件。CPP之间的主要区别之一在于不同种类的CPP与细胞表面组分的相互作用模式不同。多肽如Tat、多精氨酸和penetratin与细胞外基质的相互作用首先是静电作用,并且这种相互作用引发CPP通过一种能量依赖的胞吞过程进入细胞。尽管大胞饮已经被报道为带正电荷的CPP进入细胞的主要途径,CPP还可以通过其它的胞吞途径如网格蛋白或小窝蛋白介导的胞吞作用和反式高尔基体网络介导的内化进入细胞。而且,绝大多数CPP内化时,膜转移和胞吞的几种不同机制可能同时存在。这对两亲性的多肽而言可能尤其准确,两亲性的多肽首先与膜磷脂发生作用并在膜中调整它的二级结构,从而改变细胞膜的完整性。CPP的二级结构以及它们的动力学行为是CPP内化机制的主要决定因素。在细胞表面增加CPP的局部浓度将有利于CPP通过非胞吞的方式进入细胞,并使CPP更多地分散在细胞质中。事实上,以CPP为基础的纳米粒子(如Pep-1和MPG)进入细胞的主要途径与内涵体通道无关。MPG和Pep-1的细胞内化跟它们与膜磷脂的相互作用能力有关。MPG或Pep-1主要通过疏水部分和膜磷脂发生相互作用并形成瞬间的跨膜的螺旋或β结构,这些结构可以暂时地影响细胞膜的结构,从而有利于MPG或Pep-1插入细胞膜中并引发与膜电位有关的穿膜过程。有生物活性的Pep-1或MPG与所载“货物”形成的复合物的细胞内化与导致多肽在细胞表面局部高浓度的纳米粒子的结构直接相关。2.2传输大量“货物”自从1988年发现CPP,CPP已经被用来传输一系列“货物”如小分子、核酸、抗体和纳米粒子等。下面我们将简要介绍CPP近期在生物和医学中的最新应用。2.2.1tat在血脑屏障标记的应用血脑屏障是机体参与固有免疫的内部屏障之一,由介于血循环与脑实质间的软脑膜、脉络丛的脑毛细血管壁和包于壁外的胶质膜组成,能阻挡病原微生物和其他大分子物质通过血循环进入脑组织和脑室。因此如何穿过血脑屏障成为标记脑组织的首要难题。利用Tat共价标记量子点,通过微导管将Tat标记的量子点导入最靠近鼠颈动脉的动脉血管里,Tat可以成功地将量子点非常迅速地传递至鼠脑,而且鼠脑中量子点的装载量很大,以致鼠脑的荧光可见度可以和一盏低功率的手持紫外灯相媲美。自十年前Tat被成功用来传输抗体至细胞内以来,Tat传输单克隆抗体并用于放射免疫治疗与检测直到最近才有报道。将细胞内周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21WAF-1/Cip-1的直接抗体用Tat标记后能够穿越细胞膜,而且其效率是未标记抗体的两倍之多。2.2.2通过cpp来表达某些生物活性分子如蛋白质、核酸等能够调节细胞的功能并产生治疗效果。然而由于这些分子不能穿透细胞膜,在体内的药效可能被削弱,利用CPP携带这些分子通过细胞膜可以大大提高它们的最终效果。对于很多的小分子药物如紫杉醇、环孢素A、甲氨蝶呤也是如此。有些药物与CPP共价结合后会减弱药物本身的活性,然而这种不足可以通过CPP将药物高效率地导入细胞得到弥补。据报道CPP与甲氨蝶呤的共轭物的活性比单纯的甲氨蝶呤减少20倍,然而这种共轭物却显示高效率的细胞毒性。这些研究表明,CPP能够有效率地提高生物活性分子在细胞内的浓度,并且这种浓度的提高能够弥补因共轭标记导致的药物活性的减弱。CPP也可用来传递用于调整基因表达的siRNA。以前的报道已经阐述了利用Tat有效传递基因沉默的siRNA到细胞中,最近Tan等报道了一种新颖的CPP,它可以将大分子或小分子药物传输到眼部组织,并将它简称为POD。POD成功地将siRNA导入到胚胎来源视网膜干细胞中,并观察到大于50%的基因沉默。POD仍然可以将质粒DNA传输到细胞中并完成大于50%的基因表达。而且,在鼠角膜外用POD与染料的共轭物将会使染料有效地分布在附近的眼部组织并迅速地被细胞吸收。有必要进一步地探索在鼠角膜外用POD与核酸的共轭物是否将会使共轭物有效地分布在附近的眼部组织并迅速地被细胞吸收。然而,这份研究表明,利用CPP提高核酸在眼部组织的传递是可能的。2.2.3/nihnp的共纺模拟物在探索更加有效地治疗肿瘤的方法时,CPP是一个非常有价值的工具。CPP已经得到多方面的创新性应用,如用CPP来运输化疗药物,同时也可以传递凋亡前体蛋白。尽管CPP能够高效地将化疗药物传输到细胞中,然而对于传统的CPP如Tat而言,它们对细胞无特异性,使得肿瘤和正常细胞都接受化疗药物,从而造成正常细胞的死亡,这是肿瘤治疗中必须解决的问题。为了纠正CPP这种固有的对细胞的非特异性,有研究将Tat与一种anti-Her-2/neu肽模拟物(AHNP)共轭连接(Tat-AHNP)。AHNP可以选择性地吸附ErbB2。ErbB2是一种表皮生长因子受体,在乳腺癌细胞中过量表达30%。这种设计新颖的对癌细胞有特异性的运输多肽Tat-AHNP将可以用于治疗。一种STAT3的抑制多肽STAT3BP能够阻止STAT3转录因子的活性,因此将STAT3BP共轭连接到Tat-AHNP上,利用Tat-AHNP的靶向作用能够将STAT3BP特异性地运输到癌细胞中,而且这种特异性在体外和体内都可以实现。另外,将STAT3BP共轭连接到Tat-AHNP上后并没有改变STAT3BP的活性,连接在Tat-AHNP上的STAT3BP仍然能够破坏STAT3的活性,从而引起肿瘤细胞凋亡并阻止体内肿瘤的增长。p14ARF蛋白是一种有效的肿瘤抑制剂,在肿瘤部位它常被解除管制。以前认为这个蛋白是一种从p14ARF蛋白的N端衍生得到的含有22个氨基酸残基的多肽,而这种多肽就能够模仿结构完整的p14ARF蛋白的功能。对这种多肽的进一步考察发现,其精氨酸的含量占总氨基酸含量的20%,由于CPP也常是富含精氨酸的序列,因此这种多肽被用来测试它的跨膜能力。研究发现,这种多肽对细胞膜有高度的渗透性,并且发现该多肽能够传递功能剪接正确的PNA到细胞中。当p14ARF与细胞共孵育时,p14ARF多肽保持了生物活性的细胞毒性,并能够使细胞的增殖减少了45%。这是第一次报道发现从一种较大蛋白质中衍生出来的多肽同时具有抗繁殖性和细胞穿膜功能。3纳米颗粒的膜吸收3.1纳米粒子与细胞的相互作用纳米粒子可以运载多种药物和生物活性大分子如多肽、蛋白质和基因等,因此在药物靶向和控制释放、免疫检测和诊断学中得到了广泛的应用。在这些应用中,不可避免地涉及到纳米粒子与细胞间的相互作用。因此理解细胞内吞(endocytosis)的机制和粒子进入细胞的途径等问题有助于预测粒子在细胞中的位置和分布(图2),为设计出更有效的载体提供实验依据。纳米粒子与细胞及其磷脂双层结构之间的相互作用对纳米粒子在光疗、影像、药物/基因传输等方面的应用产生非常重要的影响。这些方面的应用要求非常稳定地控制纳米材料与细胞之间的相互作用,而这种相互作用主要由纳米粒子的表面性质所决定。3.2纳米棒的优点研究纳米材料的尺寸和形状对纳米材料与细胞之间的相互作用的影响是非常重要的,因为这种研究可能给毒理学带来启发。研究发现纳米粒子的尺寸和形状会对纳米粒子的细胞吸收产生重要影响。Chithrani等研究了HeLa细胞分别对14、50、74nm3种金纳米粒子的细胞吸收。结果显示,随着金纳米粒子尺寸的不同,金纳米粒子的细胞吸收动力学以及饱和浓度也随之改变,并且发现直径为50nm的金纳米颗粒能够最有效地被细胞吸收,这表明纳米材料可能有一个最适合细胞高效吸收的尺寸。同时,有些研究表明,纳米粒子的尺寸强烈地影响细胞膜受体的吸附和活化进而影响蛋白质的表达。此外,在研究纳米材料对细胞的作用时,必须对纳米材料固有的多分散性进行控制,否则用同种材料的不同批次进行细胞研究时可能得到不同的研究结果。另外一个必须考虑的问题是,即使纳米材料在合成后具有一定的尺寸,然而在细胞的体外和体内研究中,这些纳米材料可能聚集,聚集体的形貌和尺寸可能与原纳米材料完全不同,从而影响实验结果和我们对实验结果的理解。与此同时,纳米材料的形貌对细胞吸收也有影响。细胞对球形粒子的吸收数量比它对棒状粒子的吸收数量多5倍,这是因为细胞膜对纳米棒的包裹需要更多的时间。Kostarelos等在碳纳米管上共价修饰不同类型的小分子,这些功能化的碳纳米管显示出很强的被细胞内化的能力,而且这种功能化的碳纳米管能够以非能量依赖的方式进入哺乳类细胞和原核细胞,并能通过细胞内的各种障碍在细胞内转运。单根的碳纳米管或碳纳米管束一旦与细胞接触,即使在胞吞被抑制的条件下,仍能够向细胞内转运并且观察到碳纳米管能够向核周边转移。功能化碳纳米管的圆柱形结构和它大的长径比,使它好比一个纳米注射器,能够允许它们穿透细胞膜。根据细胞类型、碳纳米管尺寸和碳纳米管束含量的不同,其它的细胞吸收机制(如吞噬作用)可能也对碳纳米管的内化吸收有贡献,或者这些内化机制被碳纳米管的这种穿膜能力所激发,因此这些机制直接与功能化的碳纳米管的细胞内转运有关。3.3纳米粒子表面覆盖物对复合材料细胞内全覆盖的影响纳米粒子表面电荷会对纳米粒子与细胞之间的相互作用产生重要影响。前面我们提到纳米粒子的尺寸和形状对纳米粒子与细胞之间的相互作用有重要影响,然而,纳米粒子表面的多功能基团对纳米粒子的许多重要性质如溶解性、大分子和细胞表面之间的相互作用产生主要影响。例如,纳米粒子在培养液中与细胞共孵育时,血清蛋白将吸附在纳米粒子的表面,这将导致纳米粒子通过受体介导的方式进入细胞。然而,在很多的应用中,又要尽量避免纳米粒子与细胞膜或其他的生物分子发生相互作用。例如,在体内的应用中,蛋白质在纳米粒子表面的非特异性吸附将导致纳米粒子凝聚并被网状内皮系统清除,这将阻碍纳米粒子运送药物/基因到靶向位置。非特异性还可以导致纳米粒子吸附在细胞膜和细胞外基质上,从而导致无效率的标记和检测。为了避免这种情况,可以在纳米粒子表面包覆电中性的配体如聚乙二醇(PEG),其中PEG因能抵抗蛋白质的吸附而著称。Xie等研究得出在单分散的Fe3O4纳米粒子表面包覆PEG后,纳米粒子在培养条件下的团聚将可以忽略,同时巨噬细胞对纳米粒子的非特异性吸收也减少。另外,还有研究通过改变纳米粒子表面PEG的量和聚合物构型来考察它们对纳米粒子细胞内化的影响。研究显示,单一地提高PEG在纳米粒子表面的浓度并不能减少纳米粒子的细胞吸收,相反,PEG在粒子表面的空间构型自由度将产生决定性的作用。纳米粒子表面PEG化的聚合物的不同分子结构中,PEG组分在纳米粒子表面暴露越多,将会更多地减小纳米粒子对蛋白质的吸附,同时纳米粒子与细胞的相互作用也更小,尽管此时PEG的总体含量相对较少。另外有研究表明,与被PEG包覆的量子点相比,被羟基包覆的量子点更能明显地减少对细胞的非特异性吸附。这些研究表明,如果电中性配体在纳米粒子表面合理分布,这些配体将能够明显地减少纳米粒子与它们所处的生理环境的非特异性相互作用。3.4通过压力产生的纳米颗粒与细胞之间的相互作用3.4.1氧化铁纳米颗粒的细胞内化纳米粒子表面的带电官能团也能够影响纳米粒子与细胞之间的相互作用。当纳米粒子表面电中性的官能团能够很好地阻止不必要的纳米材料与生物分子的相互作用,绝大多数的带电官能团是纳米粒子与细胞发生相互作用的诱因。有证据表明,带负电的粒子可被细胞吸收,尽管带负电的粒子与带负电的细胞膜存在排斥作用。Villanueva等研究了表面被带不同价电的碳水化合物功能化的氧化铁纳米粒子被HeLa细胞的吸收情况。结果显示,表面不带电的氧化铁纳米粒子没有显示出任何的细胞内化,然而,随着纳米粒子表面涂层的不同,表面带负电的纳米粒子能够被细胞吸收,并显示一定的毒性。通过辅助的磁性实验、磁泳、电子自旋共振谱发现,由于对细胞膜的强烈相互作用和非特异性,带负电的没有表面分子涂层的氧化铁纳米颗粒显示高水平的细胞内化能力。带负电的纳米粒子的细胞内化,首先是细胞膜上带正电的位置对纳米粒子的非特异性吸附且纳米粒子在此位置成簇聚集,接着细胞通过胞吞作用将纳米粒子内化。值得注意的是,与细胞膜上带负电的区域相比,细胞上带正电的区域相对稀少。被羧基功能化的第三代的PAMAM树枝状聚合物稳定的氧化铁纳米粒子,也能够被HeLa细胞内化,内化途径可能是通过胞吞或者直接扩散通过细胞膜。Patil等研究了随pH改变的Zeta电位对氧化铈纳米粒子的细胞吸收的影响。研究结果表明,与带正电的粒子相比,带负电的粒子对牛血清白蛋白的吸附较少,并且肺癌株细胞对带负电的纳米粒子有更高效的吸收。另外,带负电的直径大约在30nm的量子点不仅能够被细胞内化,而且能够穿透小鼠的皮肤,且这种穿透随着紫外辐射而加剧。最近,我们课题组用过硫酸钾引发丙烯酸在酪蛋白水溶液中聚合得到酪蛋白-聚丙烯酸纳米空心球,然后将酪蛋白-聚丙烯酸纳米空心球经pH7.4左右的水透析处理,得到纯酪蛋白的纳米空心球。在pH7.4左右时,通过Zeta电位测试表明该酪蛋白纳米空心球的表面带负电。酪蛋白纳米空心球用罗丹明B异氰酸酯共价标记,然后将该纳米微球在37℃、4℃或各种胞吞阻断试剂(即叠氮钠、制霉菌素、非律平、细胞松弛素D、诺考达唑)存在下与细胞共孵育。用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测发现,4℃或各种胞吞的阻断试剂都不能有效地阻止酪蛋白纳米粒子进入细胞,同时我们还用激光共聚焦显微镜和透射电镜发现纳米粒子进入细胞后主要分布在细胞质中。这些表明酪蛋白纳米空心球有很强的进入细胞的能力,并且这种能力不受温度、能量的影响。3.4.2细胞穿膜能力与电中性或带负电的粒子和细胞之间的弱相互作用以及低水平的细胞内化相比,带正电的粒子能够非常显著地与细胞膜上带负电的基团(如唾液酸)发生吸附并跨过细胞膜。例如,Cho等最近检测金纳米粒子的表面电荷对其被细胞吸收的影响,发现通过使用碘/碘化钾刻蚀剂(刻蚀金核),能够选择性地溶解附着在细胞上的纳米粒子的金核。研究发现,与表面带正电的纳米粒子相比,表面不带电或带负电的纳米粒子在带负电的细胞膜上吸附的少得多,从而导致进入细胞的纳米粒子个数也相对较少。由于带正电的粒子具有很高的穿膜和细胞内化效率,它们成为药物和基因传输的首选人工合成载体。为了利用带正电粒子的细胞内化,Martin等用树枝形的胍修饰超顺磁性的氧化铁纳米粒子,结果显示,表面经胍修饰的纳米粒子像CPP一样具有细胞穿膜能力;与表面氨基化的粒子相比,这些纳米粒子具有更强的细胞穿膜能力,尽管它们也显示相对较高的细胞毒性。Harush-Frenkel等研究了带电粒子的胞吞机制,结果表明带负电的纳米粒子胞吞速度较低,带正电的纳米粒子通过网格蛋白介导的胞吞机制迅速被细胞内化;另外,当阻断网格蛋白介导的胞吞途径时,其它的胞吞途径也能够使带正电的纳米粒子高度内化。PEG化的氨基包覆的量子点也已经被用来作为强劲的细胞内标记试剂。研究发现,纳米粒子带正电荷的多少和纳米粒子被细胞内化的数目具有很强的关联。尽管当纳米粒子的表面电荷密度较低时,硅纳米粒子主要通过网格蛋白和肌动蛋白依赖的胞吞方式进入细胞,在某些细胞中硅纳米粒子表面很强的价电涂层将使纳米粒子绕过这些细胞内化机制。带正电的硅纳米粒子还能够逃脱内涵体并进入细胞质和细胞核。另外一个研究比较了不同表面涂层的椭圆体量子点的细胞内化,并观察到纳米粒子进入皮肤细胞的数量遵循如下顺序:QD-COOH>QD-NH2>QD-PEG。尽管纳米粒子表面带有荷正电的官能团,然而可以观察到表面官能团(如疏水含量或结构)的细微变化都可以导致纳米粒子细胞内化数量的改变,这表明纳米粒子的表面性质对它与细胞之间的相互作用的影响是非常复杂的,而且这种复杂程度远远超出我们现在的理解水平。此外,Leroueil等研究了带正电的PAMAM树枝形聚合物对细胞膜磷脂双分子层的影响。他们发现带正电的第七代的PAMAM不仅可以打破细胞膜的稳定性,而且通过AFM观察发现它还可以在细胞膜上形成15～40nm的孔,或者加大已经在缺陷位置存在的孔。进一步的研究表明,带正电的粒子在磷脂双分子层形成孔的这一性质是普遍存在的,不管粒子是球形还是不规则形状、化学组成是有机物还是金或硅纳米粒子等无机物、粒子是柔性还是刚性、价电密度和粒子尺寸大小。另外,本课题组通过在70℃壳聚糖(CS)和丙烯酸(AA)的混合水溶液里加入氯金酸,利用CS的还原性得到Au纳米粒子,然后加入过硫酸钾引发AA聚合得到CS-PAA-Au杂化纳米微球。这种在pH7.4左右表面带正电的杂化纳米微球不仅可以作为药物向细胞内和细胞核传输的载体,而且可以作为癌细胞造影剂,因此这种纳米粒子可以同时起到细胞造影和抗癌药物运输两种功能。更重要的是,CS-PAA-Au在核内和核膜周围聚集表明,这种杂化纳米粒子具有进入细胞核的能力。3.5细胞内路径和细胞转运脂质体(liposomes)是由磷脂、胆固醇等为膜材包合而成。磷脂分散在水中时能形成多层微囊,且每层均为脂质双分子层,各层之间被水相隔开,这种微囊就是脂质体。由于脂质体可以包裹不透膜的亲水性分子或将膜溶性的疏水分子携带在磷脂双分子层中,现在很多的研究都致力于将脂质体作为药物传输的潜在载体。细胞内转运是基因载体转基因表达效率的决定因素。Iwasa等研究了由八精氨酸表面修饰的脂质体(R8-liposome)的细胞跨膜吸收机制。他们将NIH3T3细胞在37℃或4℃与R8-liposome共孵育,流式细胞仪检测发现细胞在4℃跨膜吸收的R8-liposome只比相应的37℃时略微减少。激光共聚焦显微镜对脂质体和细胞膜双成像发现,在37℃时R8-liposome通过囊泡转运进入细胞,而且部分R8-liposome从囊泡中逃逸进入细胞质并分散在细胞核的周边;在4℃时激光共聚焦显微镜观察发现R8-liposome分布在细胞内靠近细胞膜的某一特殊区域,并且没有观察到细胞膜的内化。因此,R8-liposome在4℃的细胞吸收看起来不是通过能量依赖的囊泡转运方式,而是通过其它的特殊途径。同时,在4℃时R8-liposome将包裹的pDNA传输到细胞核的效率不及它在37℃的细胞核转运效率。此研究结果表明,R8-liposome可以通过非胞吞的方式进入细胞,而且R8-liposome的细胞内化途径与接下来的向细胞核转运过程密切相关。RNA干预在医学中应用的关键挑战是如何将合成的小干扰RNA(siRNA)有效地传输到靶细胞,从而诱导目标基因的沉寂。为了推动非病毒载体的合理发展,Lu等研究了阳离子脂质体传输siRNA到哺乳类细胞的机制。他们发现95%的siRNA脂质体复合物是通过胞吞途径进入细胞的,并延长了复合物在内涵体和溶酶体中的停留时间。然而,将网格蛋白、小窝蛋白或脂筏介导的胞吞作用和大胞饮作用抑制后,并不能阻止目标基因的沉寂。相反,将胆固醇从细胞膜中移除后,对siRNA脂质体复合物的跨膜吸收影响很小,但却解除了对目标基因的沉寂。同时发现功能性siRNA的传输在几小时内发生,并且随着温度的降低,这种传输逐渐被阻止。此研究表明,尽管大部分siRNA脂质体复合物是通过胞吞作用进入细胞的,然而一种次要的通过siRNA脂质体复合物与细胞膜的融合的内化途径却承担功能性siRNA的传输。此研究为我们提高阳离子脂质体传输功能性siRNA的效率指示了可能的方向。Kunisawa等建立了一种将脂质体包裹纳米粒子的方法,并将包裹有纳米粒子的脂质体与用紫外线灭活的仙台病毒融合得到基因融合脂质体。当纳米粒子包裹进传统的脂质体时,纳米粒子通过胞吞的方式进入细胞。相反,当将纳米粒子包裹入基因融合脂质体时,很多的纳米粒子将被传输到细胞质中且没有细胞毒性。此外,基因融合脂质体显示出很强的将包裹在其中的携带有DNA的纳米粒子传输到细胞质的能力。此研究结果表明利用基因融合脂质体与纳米粒子的组合纳米技术是一个有价值的系统,它能够调控细胞内以基因为主体的药物的药代动力学。3.6金纳米粒子与细胞的作用在很多的研究中,用天然的生物组分如寡核苷酸、多肽或蛋白质取代合成有机分子来对纳米粒子进行包覆,同时考察这些纳米粒子与细胞之间的相互作用。最近,Rosi等对寡核苷酸修饰的金纳米粒子的细胞内化进行了研究。研究发现,即使纳米粒子表面带负电,纳米粒子仍然能够被鼠内皮细胞吸收并能有效地用于基因调控。起初,这种现象看起来是吃惊的,因为带负电的纳米粒子典型地难以被细胞内化。然而,通过以荧光为基础的蛋白质定量实验进一步分析得出,寡核苷酸修饰的金纳米粒子通过静电和疏水作用在其表面吸附血清蛋白,吸附了血清蛋白的纳米粒子能够与细胞膜相互接触。同时研究发现,纳米粒子的细胞内化依赖于装载在粒子表面的寡核苷酸的密度,粒子表面寡核苷酸的密度越高,纳米粒子进入细胞的数量越大。这些研究表明,在经典的细胞培养孵育实验中,纳米粒子最外层的血清吸附蛋白对纳米粒子与细胞膜之间的相互作用是一个重要的决定因素。3.7金纳米粒子的排列虽然有很多纳米粒子表面官能团/配体/穿膜单元对其细胞吸收的影响的研究报道,而纳米粒子表面配体的排列对其细胞内化的影响却很少有研究。Verma等合成了用有机物包裹的两亲性的金纳米粒子,所有的粒子都具有相同的尺寸、电位、配体堆积密度和疏水组分含量,唯一的不同在于包裹金核的配体的排列。研究表明,包裹在金核上的两亲性分子如果以有序的带状交替排列,则该纳米粒子在4℃和胞吞阻断试剂存在的情况下仍然能穿透细胞膜;如果无序排列,该纳米粒子将不能穿越细胞屏障而只能被胞吞进入细胞的内涵体中。这些表面两亲性分子以有序地带状交替排列的纳米粒子在穿越细胞膜时并没有在膜上呈现明显的孔洞结构,这非常类似于细胞穿膜肽。3.8egf靶向治疗乳腺癌的活性任何药物及其传输载体在体内应用时都存在不同程度的副作用。通过对癌细胞表面的特异性受体或配体的识别,则能将化疗药物或其它医药试剂靶向到癌细胞,这将极大地减少药物对其它正常细胞的毒性,并提高癌症治疗的效率。许多细胞表面受体如叶酸受体、转铁蛋白受体、上皮生长因子受体等都被用来选择性靶向载药纳米粒子到肿瘤细胞。Kocbek等制备了用血管内皮生长因子修饰的聚电解质复合胶束,并可特异性靶向到结肠癌细胞。在负载紫杉醇的PLGA纳米粒子表面修饰HER2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2)的抗体(trastuzumab),使粒子具有靶向到乳腺癌细胞并在癌细胞中释放药物的多功能性。上皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体,在许多实体肿瘤中高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。EGF共价连接到载有抗癌药物或显像剂的传输载体上后,将能使药物特异性传输到EGFR过量表达的细胞(如胰腺癌细胞)中。最近,Bhirde等将顺铂和EGF连接到单壁碳纳米管(SWNT)上,并发现EGF能将该碳纳米管靶向到EGFR过量表达的鳞片状的癌细胞HNSCC中。通过利用量子点(Qdot)荧光和激光共聚焦显微镜观察发现,SWNT-Qdot-EGF生物轭合物能够迅速地被癌细胞内化,并且HNSCC能够在体外被选择性地杀死,同时抑制体内肿瘤生长。Fujita等将两种不同的单克隆抗体共价连接到同一种基于聚苹果酸的纳米粒子上,其中的一种单克隆抗体anti-TfR指导纳米粒子通过血瘤屏障,而另外一种单克隆抗体2C5靶向瘤细胞表面连接的核小体。同一纳米粒子表面连接有两种抗体以及它们的生物活性通过酶联免疫吸附实验确证。同时,体内实验表明,表面连接有两种抗体的纳米粒子在人神经胶质瘤部位高度富集。4被胞吞物质的生物活性大部分大分子和纳米粒子的细胞内化是通过内吞方式进行的,内吞后大分子和纳米粒子局限于内涵体内,并最终被溶酶体消化降解,这会大大消弱被胞吞物质的生物学活性。因此,探索促进被胞吞物质从内涵体中逃逸的方法,将有助于提高被输送生物活性物质的效率。下面简要介绍CPP介导的物质从内涵体中逃逸的方法。4.1tat-10h编码荧光光素酶的转染Wattiaux等在细胞培养液中加入氯喹,几个小时后发现,荧光标记的TAT多肽可使细胞核和细胞质均呈明显着色,证明氯喹可促进TAT多肽从内涵体中逃逸至细胞质并进入细胞核。Tat与聚组氨酸共价连接得到Tat-10H,结果组氨酸的咪唑基团(PKa6.0)在酸性的内涵体(pH5～6.5)中充当质子海绵。当Tat-10H被细胞吸收并进入内涵体后,组氨酸残基的质子化将导致渗透性肿胀,结果内涵体膜破裂,从