共焦显微镜与组织病理检查对真菌性角膜炎的诊断价值

共焦显微镜与组织病理检查对真菌性角膜炎的诊断价值

0fk其他致病性感染的临床研究真菌性角膜炎（fk）是一种高度盲的疾病。近年来，由于广泛使用抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂以及膜接触显微镜的增加，发病率显著增加。fk有许多常见的病毒，如刀菌、沙丁鱼、细菌等。在中国，大多数病毒都可以用刀菌和沙丁鱼感染。比较了膜豆菌和革兰氏菌在不同膜豆菌感染中的生长特征。1材料和方法1.1材料表面健康成年有色兔24只,质量2.0~2.5kg,雌雄兼用(西安交通大学动物中心).使用前裂隙灯显微镜检查,证实无眼前节病.1.2曲霉菌模型的制作实验前3d,给与妥布霉素眼液点眼4次/d.将24只兔随机分成A,B两组,每组12只.处死A组兔,无菌条件下摘取眼球,用φ8mm环钻制备全厚角膜植片备用.B组兔右眼为模型眼,左眼为对照眼.皮下注射速眠新Ⅱ0.2mL/kg进行全身麻醉,右眼10g/L地卡因液表面麻醉,5mL/L庆大霉素溶液冲洗结膜囊,用φ5mm环钻在角膜中央划痕,刮除划痕中的角膜上皮.取制备好的角膜植片从内皮面作“#”形划痕后,用10-0尼龙线放射状缝合8针将其固定于刮除上皮的角膜上.用注射器抽取0.1mL曲霉菌混悬液将其注入植片与植床角膜层间的中央,结膜囊涂红霉素眼膏,3-0丝线缝合上下眼睑.左眼与右眼制作方法相同,植片与植床角膜层间注入0.1mL生理盐水作为对照.3d后拆除眼睑缝线,去除角膜植片,观察B组兔角膜情况.分别在造模后的第3,7,10,15日行裂隙灯显微镜、角膜刮片、角膜共焦显微镜(日本NIDEK公司confoscan3)、角膜病理切片检查及真菌培养且分别处死3只兔,沿角膜缘切取角膜、虹膜,按子午线方向剖成两等份,一份常规行40g/L甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片、HE(苏木素-伊红)染色和PAS(高碘酸-希夫)染色,光学显微镜下观察其形态学改变并拍照,一份送培养.2结果2.1兔视网膜组织病理学检测接种真菌的12只兔眼均一次接种成功,在接种的第3日可观察到浅层角膜真菌病变,病变角膜与健康角膜边界清晰,角膜表面粗糙,轻度隆起,基质混浊水肿,前房无积脓.第7日,可见明显溃疡灶并有苔垢样坏死组织附着,溃疡边缘稍隆起毛糙不齐,部分兔角膜周边可见卫星灶,内皮面有内皮斑,角膜弥漫性雾状水肿,前房可见积脓.第10日,溃疡灶缩小炎症反应减轻.第15日,上皮基本完整,可见瘢痕形成.对照组3d时,角膜上皮基本愈合.2.2曲霉菌的分布3.9moL/L氢氧化钾湿片法检查,第3,7日均可查见较粗、长、有分隔的曲霉菌菌丝,及成串的分生孢子,聚集似菊花样.第10,15日未见到菌丝、孢子.2.3炎症细胞加前房形貌早期(接种3d)见较直、短、分支比较少的高反光的菌丝及孢子,菌丝在角膜病灶边缘生长明显,以垂直、斜行生长方式为主,角膜基质细胞肿胀其间伴有少量的炎症细胞浸润(图1A).中期(接种7,10d)在角膜中深基质层可见高反光的菌丝明显变长,数量增多,周围见大量的炎症细胞(如中性粒细胞等)浸润,及局灶性团状无细胞区,病变角膜内皮面附着大量团、片状渗出物,突于前房内,内皮细胞肿胀边界欠清晰(图1B).后期(接种15d)可在基质深层见到少量稀疏分布、短小的真菌菌丝,未见孢子,病变角膜局部可见强反光无细胞结构的瘢痕形成(图1C).2.4he染色表现PAS染色早期(接种3d)见少量菌丝平行生长于胶原纤维之间(图2A).中期(接种7,10d)见大量菌丝斜行、垂直或平行生长于基质层,菌丝周围可见圆形高反光孢子,呈串珠样排列(图2B).虹膜组织肿胀,血管高度扩张充血,可见大量新生血管.后期(接种15d)未见明显菌丝生长.HE染色早期(接种3d)见基质细胞肿胀,炎性细胞浸润不明显.中期(接种7,10d)见基质细胞肿胀明显,局部组织溶解,大量炎性细胞浸润,以中性粒细胞为多,病灶局部也可见淋巴细胞、巨噬细胞.后期(接种15d)见基质细胞肿胀减轻,角膜小面形成,胶原纤维排列紊乱,基质层炎性细胞浸润减少(图2C).2.5培训角膜标本接种于Sabouraud培养皿上,将其置于25℃下培养可见有曲霉菌菌落生长.3临床病理切片检查目前,临床诊断真菌性角膜炎的方法有刮片染色,培养,病理切片,角膜共焦显微镜和多聚酶链反应(PCR),然而这些方法在临床早期诊断中都存在一定的不足.因此真菌性角膜炎的临床早期快速诊断方法仍是目前的研究热点之一.角膜共焦显微镜能在活体上从四维(三维空间和时间)水平对角膜组织进行快速的、无损伤的光学断层扫描成像.本实验通过建立与真菌性角膜炎发病相似的动物模型,应用角膜共焦显微镜可直观的看到菌丝、孢子的形态,菌丝在角膜基质内的生长方式(如垂直、斜性、平行生长),侵入角膜组织的层面及角膜内皮面的反应情况,显示菌丝的立体生长状态.共焦显微镜检查时,物镜镜头并不与角膜直接接触,而是通过一种对角膜有保护作用的眼用凝胶接触受检查的角膜,不会对角膜造成损伤,在病情发展过程中可以反复多次的进行检查,为及时判断病情,评价疗效,制定治疗方案提供客观依据,亦可指导临床角膜刮片的再次取材部位,为提高其检测阳性率提供可靠的依据.通过兔模型组织病理切片的常规染色和特异性染色,可观察到某一时间点病变角膜中真菌菌丝形态、数量的变化,侵入角膜的范围,区分中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞的浸润情况.但临床病理切片只能通过活检或手术后获得,部位局限,容易漏诊,且无法在活体角膜上观察病变角膜的病情演变;而共焦显微镜具有无创性、可重复性,它可在活体对真菌性角膜炎发病过程中菌丝的形态、数量变化,生长方式,侵入角膜组织的范围、深度以及炎症细胞浸润的部位进行详细的观察,这也为真菌性角膜炎的临床治疗用药,手术方式的选择提供了重要的依据.病理切片的标本制作需经组织切片、固定和特殊染色(如PAS染色)等处理,在此过程中不可避免的带入了人为干扰因素,尤其在角膜只有少量菌丝生长时.因此在兔真菌性角膜炎造模的后期,在角膜只有少量菌丝生长时,很可能因人为干扰因素或切片部位的差异而病理切片未能检到菌丝.共焦显微镜检查对角膜组织进行的是快速的光学断层扫描成像无需特殊处理,既缩短了检查所需的时间,也减少了标本处理过程中可能带入的人为干扰因素和所造成的假象.故造模后期除共焦显微镜仍可在角膜深基质层见到少量菌丝外其余检查均未检见菌丝,也体现了共焦显微镜在真菌检测中具有更高的灵敏性,这对真菌性角膜炎溃疡愈合后仍需继续用药以防复发提供了客观依据.真菌性角膜炎的致病菌种类较多,形态各异,共焦显微镜对不同菌种的影像学特点目前尚无统一的诊断标准,只能根据形态区分丝状类真菌和孢子类真菌,而不像病理切片可确定具体菌种.它可进行与组织病理切片同样的关于菌丝及孢子的形态、数量变化,菌丝生长方式,侵入角膜组织的范围、深度以及炎症细胞浸润的部位等详细的观察,但由于不能进行活体组织染色,目前对炎症细胞的种类上不能区分,在病变区周围仅从形态上可辨认出有分叶的中性粒细胞和小园形细胞可能为淋巴细胞.共焦显微镜虽具有无创性、可重复性及早期快速诊断的优点,但其在检查过程中需要患者的密切配