蛇毒的毒理学研究

蛇毒的毒理学研究

蛇毒是蛇毒科解毒腺分泌的一种毒素，属于生物毒素。一般蛇毒的新鲜毒液呈蛋清样粘稠液体,振摇时易起泡沫,呈弱酸性,有特殊腥味,含水量约为65%~80%,比重为1.03~1.06,常温下易失活,置冰箱中1周后有部分失去活力。蛇毒中的蛋白类物质是蛇毒主要毒性成分,包括蛇毒素和酶两大类,所以遇重金属离子、乙醇、酚类物质时,立即产生沉淀;高温环境产生絮状沉淀;遇氧化剂(MnSO4、H2O2)、还原剂(亚硫酸钠)、强酸、强碱等易被破坏,亦易被蛋白水解酶所分解;紫外线照射也能使蛇毒失活。经甲醛处理后失去毒性,但仍保持其抗原性,或变成类毒素。我国的毒蛇种类多,分布广,但其中具有剧毒而危害较大的不过10余种,即金环蛇、银环蛇、眼镜蛇、眼镜王蛇(Ophiophagushannah)、圆斑蝰蛇、草原蝰蛇、蝮蛇、五步蛇、竹叶青蛇、烙铁头蛇(Trimeresuresmucrosquamatus)等。1蛇种多毒种,其道德规划、组织和酶组分见表1蛇毒的生物学功能主要是帮助蛇本身捕食和消化食物,其有毒成分主要是神经毒素、心脏毒素、细胞毒素、出血毒素、促凝、抗凝组份和一些酶等,各含多少或有无,随蛇种而异。其毒性成分也可按不同的方式分类。1.1根据中毒分类蛇毒按毒理学分类可分为神经毒素、血循毒素以及各种毒素、酶等。1.1.1神经毒素的结构神经毒素主要存在于银环蛇(BungarusmulitcinctusBlyth)、金环蛇(Bungarusfascitus)和海蛇的毒液中,眼镜蛇(Najanajaatra)、蝮蛇(Agkistrodonhalys)亦含有此毒素。其主要化学成分是一种由15~18种氨基酸,由60~74个氨基酸链所结合而成的肽链。其中最主要的氨基酸是赖氨酸、精氨酸、天门冬氨酸,但亦含有半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸和色氨酸等成分。眼镜蛇咬伤致中毒的主要毒性成分是突触后神经毒素或α-神经毒素,根据其氨基酸序列可将其分为两大类:长链神经毒素由65~72个氨基酸残基构成,含有5对二硫键;短链神经毒素由60~62个氨基酸残基构成,含有4对二硫键。尽管它们的一级结构不同,但均有共同的三指形结构。神经毒素按作用部位、作用方式分为两种类型:一种是作用于运动神经与骨骼肌接头处的突触后膜,与后膜的胆碱能受体相结合,使运动神经末梢释放的乙酰胆碱对该受体不起作用,从而导致骨骼肌松弛,称突触后神经毒素,其作用特点似箭毒,又称似箭毒样神经毒素。与箭毒相比,突触后神经毒素与AchR的结合强度较大,对骨骼肌松弛作用亦较强。例如眼镜蛇的神经毒素、银环蛇毒的α-神经毒素、海蛇的神经毒素等都属于这种类型,作用于突触后膜,对终板乙酰胆碱受体亲和力很大,可阻断神经终板受体,使乙酰胆碱不起作用,且不易洗脱,其阻断作用属于竞争性抑制。在蝰蛇科和响尾蛇科蛇毒中有极个别种蛇毒也含有突触后毒素。如我国江浙产的蝮蛇毒中就含有突触后神经毒素。另一种是作用于神经-肌肉接头的突触前膜,抑制突触前膜Ach的释放过程,例如银环蛇毒的β-神经毒素、从江浙蝮蛇中分离出来的具有PLA2活性的突触前神经毒素。在这两种神经毒素的共同作用下,双重地阻断了神经-肌肉接头的传递,引起骨骼肌呈弛缓性麻痹。由于呼吸肌的麻痹,导致外周性呼吸衰竭,若能及时合理地抢救,这种呼吸衰竭是有可能被恢复的。海蛇毒引起的呼吸麻痹,主要是该蛇毒中的神经毒素与突触后膜的胆碱能受体结合,阻断神经-肌肉接头所致。并且海蛇毒能选择性地损坏骨骼,使肌纤维变性、坏死,临床上常见肌红蛋白尿和急性肾功能衰竭,故有人把海蛇毒中的神经毒素称之为肌毒素。神经毒素引起的骨骼肌弛缓性麻痹,以头颈部为先,到胸部,最后到膈肌,反方向恢复。神经毒素的这些症状,相当于中医风邪侵袭所致的临床表现,故称为“风毒”。1.1.2蛇毒中的血循毒素血循毒素主要存在于五步蛇(Ancistrodonacutus)、蝰蛇(Viperarussellisiamensis)、竹叶青蛇(Trimeresuresstejnegeri)等蛇毒中,眼镜蛇、蝮蛇亦含有此毒素。血循毒素的种类很多,成分亦十分复杂,主要包括影响心脏、血管及血液系统的成分,能产生多方面的毒性作用。其临床表现相当于中医的火热毒症状,故称“火毒”。(1)蛇毒毒素的分离和净化CTX对机体的毒性作用最广泛,危害性也最大。心脏毒素是眼镜蛇科多数蛇毒中的一种碱性多肽,其成分是由15~17种氨基酸、60个氨基酸链所组成,分子量为6000~7000D,具有广泛毒性作用。眼镜蛇毒、金环蛇毒、眼镜王蛇毒均含有此类毒素。LINSR(2002)采用SP-SephadexC-25柱层析法从台湾眼镜蛇的毒液中分离出了6种心脏毒素和一种心脏毒素类似物,并对它们的结构和功能进行了研究。毒蛇咬伤后主要引起人的心血管功能障碍,中毒早期常有短暂的兴奋过程,如心率略高、血压上升、频发期前收缩。随着血循环中蛇毒浓度的升高,可由短暂兴奋后转入抑制,心搏障碍,心室纤颤,甚至心肌坏死,导致心力衰竭。严重中毒时血压降至休克水平,若有PLA2存在,该毒素可大量溶血,这将加速休克动物的死亡。CTX对心肌损害明显,可出现单心音、奔马律,直到心室纤颤而停止跳动。心电图检查有:S-T段下移,T波平坦或倒置,Q-T间期延长,R波低电压等。(2)细胞溶解法细胞毒素可作用在细胞膜上,导致膜结构改变而释放细胞内容物,也能直接溶解某些动物的红细胞。因此,被蝰蛇或眼镜蛇咬伤,可引起肢体组织溶解,血尿,严重者可致肾小管损坏。(3)蛇毒毒素,局部渗毒出血毒素能引起动物水肿、出血和组织坏死,这种毒素广泛存在于蝰蛇、五步蛇、蝮蛇和竹叶青蛇毒中,这种毒素的局部效应迅速,可使局部通透性增加,产生广泛的血液外渗,导致多个脏器出血。1.1.3蛇毒的主要成分二者常同时存在,见于蝰亚科,蝮亚科,眼镜蛇科中的某些蛇毒,如蝰蛇、五步蛇及眼镜王蛇蛇毒中均有这些组份。(1)抗凝组份。包括抗凝血活酶作用和纤维蛋白溶解作用。蝮蛇毒、五步蛇毒具有这两种作用,眼镜王蛇毒中也含有抗凝血活酶作用的物质,因而出现抗凝性。(2)促凝组份。亦有两种作用的物质。凝血酶样作用:主要存在于蝮亚科(包括五步蛇)蛇毒中,主要成分是含有一种叫类凝血酶(TLE)的酶类。与凝血酶有所不同,它的促凝活性不被肝素抑制,且对纤维蛋白原的作用方式也与凝血酶不尽相同,由凝血酶样物质所形成的纤维蛋白凝胶很不稳定,易被血液中的纤溶酶所溶解,以致在人体内可引起低纤维蛋白原血症,出现血液失凝。TLE是蛇伤引起严重出血的重要因素。由于该酶使凝血机制紊乱,常称为蛇毒“抗凝因子”。体外试验表明,该酶促进凝血,是由于该酶能水解纤维蛋白原,使之凝聚。而在体内则表现为抗凝作用,是由于该酶具有水解纤维蛋白和抑制血小板粘附聚集作用。激活第Ⅹ因子作用:这种促凝活性物质是一种精氨酸酯酶,从圆斑蝰蛇毒中提纯而得,其作用最强。它通过激活第Ⅹ因子,在有磷脂、因子Ⅴ和钙离子的参与下,形成凝血酶原激酶,使凝血酶原转变为凝血酶。纤维蛋白原在凝血酶的作用下,形成纤维蛋白。这样可引起弥漫性血管内凝血,继而引发纤维蛋白溶解,导致全身广泛性出血,由于肝素可抑制凝血酶的这种作用,也就是说蛇毒激活第Ⅹ因子的作用可被肝素所阻断,所以含有激活第Ⅹ因子的蛇毒引起的中毒,造成弥漫性血管内凝血,在早期,使用肝素治疗是有效的。1.1.4其它普通酶基因现已知道蛇毒中含有的毒性酶不下25种,其中主要的有卵磷脂酶A、蛋白水解酶、胆碱酯酶、透明质酸酶、三磷酸腺苷酶、磷酸二酯酶、抗胆碱酯酶、核糖核酸酶、去氧核糖核酸酶、肽链内断酶和5-核苷酸酶等。与蛇毒毒性关系较密切的几种酶是:蛋白水解酶、卵磷脂酶A2、透明质酸酶等。1.2根据化学成分分类蛇毒的化学成分主要含有4类物质:酶、神经毒性多肽、神经生长因子和膜活性多肽。1.2.1水解酶系统蛇毒中的酶约占蛇毒蛋白组份50%,目前已分离纯化的蛇毒蛋白酶约150多种,约有三分之一的蛋白酶的结构特征已经弄清。有些酶已应用于临床。蛇伤造成的出血、水肿、肿胀以及肌肉坏死、血凝失调与蛇毒酶有密切关系。蛇毒中的酶类少数属于LDH同功酶、氨基酸氧化酶等,这些酶在各类蛇毒中都存在,其生理意义和应用等方面研究较少。大多数的酶属水解酶类,按其主要毒理作用,水解酶常分3类:(1)引起局部毛细血管和组织损伤与坏死作用的酶类(如蛋白酶、磷脂酶、透明质酸酶和胶原蛋白酶等);(2)引起血凝障碍或纤溶作用的酶类(如TLE、蛋白酶、PLA2等);(3)引起降压、水肿、疼痛等作用的激肽释放酶。已发现的10多种蛇毒突触前神经毒素都具有蛇毒PLA2活性,如β-银环蛇毒素、泰攀蛇毒素、虎蛇毒素、响尾蛇毒素和蝮蛇毒素等。PLA2非常稳定,经高温、低pH值条件处理仍保留酶的活性。还发现有蛇毒中的心脏毒素、肌肉毒素等组份中含有不同程度的PLA2。PLA2能水解各种磷脂类,增加红细胞膜的通透性。在临床上,蝮蛇伤引起严重的神经中毒症状以及溶血和出血的并发症与PLA2同功酶都有密切关系。1.2.2神经毒性多肽目前分离到的神经毒性多肽至少50多种,是分子量较小的蛋白质或多肽。一种蛇毒中可以有多种神经毒素,极大多数为碱性。神经毒性多肽对热稳定,可以通过透析袋。按药理学作用可分为作用于神经突触前膜和后膜两类神经毒性多肽。前者有β-银环蛇毒素和虎蛇毒素等,具有PLA2活性;其余的神经毒素均属后者,不具有酶活性。1.2.3基于分布的化学成分在生理中的功能神经生长因子(NerveGrowthFactor,NGF)并非神经毒素,是神经系统最为重要的生长活性分子之一,是50年代末期美国S.cohen(1959)首先发现的,蛇毒中富含的一种能对中枢及外周神经的正常神经细胞有营养因子作用,对损伤神经有调节修复机能,而且对伤口愈合、生殖、早期造血都有作用独特的蛋白质。NGF广泛存在脊椎动物的组织中,但含量最丰富的是在成年小鼠的颌下腺及蛇毒中。AngelettiPU等(1968)对其化学特性和新陈代谢途径进行了报道。所有蛇毒中均含有一定量的NGF,也许是蛇类通过循环而将体内过剩的这种物质排泄到蛇毒中的结果。AngelettiRH(1970)从眼镜蛇的毒液中分离到了NGF,并测定了其化学生物学特性。结果表明,其活性与从小鼠的颌下腺分离到的NGF生物学特性极为相似。Hogue-Angelliti和Bradshaw将蛇毒NGF分为两大类,一类是从食鱼蝮蛇、衲脊响尾蛇、巴西具窍蝮蛇、眼镜蛇、黑柯林斯眼镜蛇、黑白斑眼镜蛇和鲁塞尔氏蝰蛇毒中分离,相对分子量为25000,不含碳水化合物;另一类是从阿托斯具窍蝮蛇、红口蝮蛇和鲁塞尔氏蝰蛇毒中分离,相对分子量为35000,含有10%~20%的碳水化合物。两类NGF的蛋白组份大小相同,其差别也许仅仅是有或无碳水化合物的存在,这一点尚须证明。由于NGF对神经细胞的生长具有关键的作用,有可能对某些疾病有益。因此,BanksBE等(1968)对其制备方法进行了研究,LippsBV(1998)采用HPLC对蛇毒中的NGF进行了分离和纯化,并对其生物学和免疫学特性进行了分析。1.2.4a种酶膜活性多肽多为碱性多肽,主要作用于细胞膜,可引起极复杂的生物学效应,因此,又被称为膜毒素。它能直接溶解红细胞,可改变细胞膜通透性而形成细胞的渗漏,并使膜上的酶易于溶出,对心脏、骨骼肌、周围神经等均可产生有害作用,它的许多作用还可被磷脂酶A所加强。这一类的肽分子中完整的二硫键对维持膜活性多肽的活性是必不可少的。2蛇毒中毒的死亡原因2.1呼吸肌麻醉常见于银环蛇、金环蛇、海蛇蛇伤,也可见于眼镜蛇、眼镜王蛇毒中毒,若抢救不及时,发展为缺氧性脑病,窒息死亡。2.2循环衰减常见于蝰蛇、五步蛇、烙铁头等毒蛇伤,因出凝血障碍所致,也可见于眼镜蛇、眼镜王蛇等蛇毒的心脏毒引起心力衰竭而造成。2.3急性肾功能衰常见于蝰蛇毒溶血产生的大量血红蛋白,其次是五步蛇、蝮蛇和海蛇毒损害骨骼肌所产生的大量肌红蛋白,在酸性尿中,沉积于肾小管,产生肾小管阻塞,引起急性肾功能衰竭。2.4出血和出血常见于蝰蛇伤、五步蛇伤引起的广泛性内、外出血、溶血,特别是心肌、肺及脑出血导致死亡。2.5感染创面坏死感染、气性坏疽、败血症及创口合并破伤风,呼吸麻痹后引起积聚性肺炎、吸入性肺炎、真菌感染等而致死。2.6其他严重中毒者,引起肾上腺皮质功能衰竭是蛇伤中毒死亡的辅因。3蛇毒应用研究3.1蛇毒的活性成分蛇毒在动物毒素中是毒性比较强烈的一种。1mg的银环蛇毒的干毒进入人体,就能致人死亡。但当我们掌握了各种蛇毒的作用特性之后,又可大胆地应用到临床医疗上。据研究报道,蛇毒是所有毒素中结构最复杂的一类物质,含有二十种以上的活性成分,其中主要成分为毒蛋白、多肽和酶类等生物活性物质。因而具有多种生物学效应,尤其是在神经系统和心血管系统方面,在凝血和抗凝血上的应用也十分广泛,常用于各种出血性疾病的止血。此外在抗肿瘤、抗菌、抗病毒方面也具有重要的生理活性。蛇毒在临床医疗方面的广泛应用,为其药用机理的深入研究增强了信心,从而推动了医学和药理学以及其它相关学科的纵深发展。3.1.1mt和mt的互联互通蛇毒的抗肿瘤作用主要在于:(1)对癌细胞有直接杀伤作用;(2)抑制肿瘤组织内的血管再生,从而抑制肿瘤生长;(3)具有L-氨基酸氧化酶作用,诱导细胞内局部H2O2浓度的升高,从而引起肿瘤细胞的凋亡。目前研究的蛇毒抗肿瘤成分主要有膜毒素(MT),诱导细胞凋亡的组份如出血毒素、血管凋亡诱导蛋白(VAP)、apoxin-I,抑制血管再生的二聚体去整和素等等。MT是一类存在于眼镜蛇科多数蛇中的单链小分子毒蛋白。它们在粗毒中含量极为丰富,占全毒干重的25%~50%。迄今为止,已从眼镜蛇科的粗毒中分离出20多种膜毒素,它们是一类分子结构和作用机制都非常相似的同族毒蛋白,相对分子量为6000~7000,由60~62个氨基酸组成,对热稳定,对水解酶有抗性。MT在免疫毒素的研究中是个热点,目前用于构建抗肿瘤免疫毒素弹头的主要是细菌毒素和植物毒素,而膜毒素无论在生化特点还是作用方式上均优于二者,用膜毒素构建免疫毒素治疗肿瘤大有希望。Araki等发现蛇出血毒素可以诱导血管内皮细胞发生凋亡,而神经毒素却不能诱导凋亡,只能引起坏死;但蛇出血毒素只能对培养的血管内皮细胞起凋亡作用,对其它的培养细胞没有凋亡作用。apoxin-I可以诱导人早幼粒细胞白血病HL-60细胞的凋亡。二聚体去整和素是有二硫键连接的同型二聚体多肽,相对分子量13500,具有Arg-Gly-Asp序列,抑制血管再生是其抗肿瘤活性的一个重要方面。林振桃等报道了国产8种蛇毒对白血病细胞杀伤作用研究,结果表明,眼镜蛇毒对白血病细胞杀伤作用最强,蝮蛇毒次之,其余蛇毒的作用则很弱。3.1.2断痛药的使用方法蛇毒神经毒分为突触前神经毒和突触后神经毒两类,它们都具有阻断神经传导的作用,它们通过对抑制nAch的释放或与nAchR结合,从而使nAch与nAchR的结合不能正常进行,神经传导被阻断而达到镇痛的目的。经过对蛇毒中神经毒的一系列研究,发现其有较为理想的镇痛作用。但它对神经传导的阻断是可逆的,因此,阻断作用是有时间限制的。30年代国外报道用眼镜蛇毒在癌症治疗中作为镇痛药效果很好,以后的研究证明起镇痛作用的是眼镜蛇毒中的神经毒素。眼镜蛇、金环蛇等蛇毒,对热及电刺激所引起的疼痛均具比吗啡更为持久、更为强大的镇痛作用,其镇痛强度依次为眼镜王蛇毒>眼镜蛇毒>金环蛇毒>吗啡。70年代初,广州中山医学院研制成眼镜蛇毒注射液,用于临床,对三叉神经痛、坐骨神经痛、恶性肿瘤痛、风湿与类风湿性关节痛、偏头痛、带状疱疹等以疼痛为主要症状的疾病均有良好效果。关于用蛇毒作为镇痛剂方面,具有如下优点:作用显著而且持久、安全范围宽、连续用药无耐药性,也不会象吗啡那样有成瘾的危险。1976年2月,云南省动物研究所等单位将眼镜蛇毒进行分离,并在羧甲基纤维素层析的第五峰提纯神经毒,其制剂定名为“克痛灵”,临床上用于治疗各种慢性神经痛效果较佳,实验室报告也有抗癌效果(覃公平等,1989)。但终因起效慢和肌肉注射部位有硬结等缺点,未能大面积推广。3.1.3治疗其他方面的并发症由于蛇毒具有类凝血酶的作用、溶栓效应、调节微循环、清除体内自由基等多种功能,蛇毒制剂具有抗凝、去纤、溶栓、扩血管、激活脑细胞和改善微循环等多种效应,故是目前治疗心脑血管疾病的理想药物(陈斌冠,1997)。如蝰蛇毒可使血中纤维蛋白原变成纤维蛋白而形成血凝块,故近年来已作为外用止血剂的研究,用0.1%蝰蛇毒的灭菌溶液治疗血友病等的出血。此外,还可作为临床检验方法之一,用于血液病的鉴别诊断,可作为VII因子缺乏的诊断根据。1984年沈阳药学院和解放军238医院发掘了长白山地区的蝮蛇资源,发现长白山地区的白眉蝮蛇毒是生产蝮蛇抗栓酶的优质原料,经高精度的纯化而得到的精氨酸酯酶属TLE,不含任何毒性成分,使用安全可靠,疗效更好,故又取名为“清栓酶”。它具有改善微循环、调节血栓素A2(TXA2)和前列环素(PGI2)、抗自由基(FR)、调节免疫机能等作用。“清栓酶”的临床应用是动物毒素在临床应用中研究最深入、推广最普及的成功范例。清栓酶的研制成功为蛇TLE在医疗上的应用提供了新的途径,开辟了新的药源。它主要用于治疗闭塞性血管病,其治疗脑血栓起效快,副作用小,是目前临床上比较理想的药物。另外用于治疗原发性肾脏疾患、糖尿病、妇产科疾患、红斑狼疮、硬皮病、痤疮等也有较好疗效。清栓酶的研究,使蛇毒从研究试验阶段,提升到生产和医疗实用阶段,具有国内先进水平。3.1.4预防和治疗并发症彭松峰等(1994)报道眼镜蛇毒溶液对大鼠佐剂性关节炎所致的足肿胀有明显的预防和治疗作用;对治疗鸡蛋清、甲醛所致的大鼠关节炎疗效显著。眼镜蛇毒可降低毛细血管的通透性,这可能是其抑制多种炎症的一个重要原因。但蛇毒抗风湿性关节炎的研究还不够深入,有待于继续研究。3.1.5不同种毒种的抗菌活性研究结果李云龙等以能抑制细菌生长的最低浓度,对眼镜蛇、金环蛇、五步蛇、蝮蛇、竹叶青蛇6种蛇毒进行4种细菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、福氏痢疾杆菌)的抗菌试验。结果表明,以蝮蛇毒、眼镜蛇毒的抑菌作用比较强,而抗菌谱也较宽,其抗菌浓度一般都在50μg/ml范围或更低。对金黄色葡萄球菌抑制作用最强的是蝮蛇毒(抑菌浓度为12.5μg/ml)、竹叶青蛇毒(抑菌浓度为25μg/ml)和眼镜蛇毒(抑菌浓度为50μg/ml)。对大肠杆菌有明显抑制作用的是眼镜蛇毒和蝮蛇毒(抑菌浓度为50μg/ml)。而福氏痢疾杆菌对所有试验的蛇毒都较敏感,最强的抑菌浓度可达到几个μg/ml。3.1.6免疫抑制剂及免疫方法70年代末应用126I标记的银环蛇毒作配体来探测乙酰胆碱烟碱样受体的数量是对MGD的发病机理的重大突破。MGD是nAchR自身免疫性多克隆性的免疫应答疾病,用α-BGT提纯的nAchR可作为抗原,免疫接种于动物,可制成实验性自身免疫性MGD的模型,为免疫调节诊疗开辟了新的前景(涂来慧,1988)。莫雪安等(1992)利用α-BGT能特异性地不可逆地与(主要分布在突触后膜的)乙酰胆碱受体结合、β-BGT能特异性地不可逆地与突触前膜的相应蛋白质(受体)结合的特性,发明了抗突触抗体的检测指标和检测方法,其阳性率明显高于单独检测抗乙酰胆碱受体抗体或/和抗突触前膜抗体。该研究还证明了其检测方法的特异性和重复性好,创建了MGD诊断的一个阳性率较高的较好的实验室指标。3.1.7学习记忆缺损模型由于nAchRs的亚型α3β2在人类AD患者大脑皮层中下降过半,提示这类受体可能与学习记忆功能有关,因此,利用银环蛇毒素中的κ-BGT作为工具,有可能建立病理学分子结构基础明确的学习记忆缺损模型。开展AD有关病理机制的研究,也为相关保健食品和药物的研制提供了一种新的模型(刘洁生等,1998)。3.2神经毒素的结构由于蛇毒在医学药理学中具有强大的功能,加快了科学家们对蛇毒的研究。又由于蛇毒蛋白分子量小,理化性质稳定,结构较为简单等优点,推动了分子生物学技术的发展。70年代,科学家们对蛇毒神经毒素进行了广泛而深入的化学修饰研究,加之日益增多的神经毒素的氨基酸序列被测定,弄清了序列中一些特定的氨基酸残基对神经毒性的作用。80年代后,对各种神经毒素的空间结构进行了广泛研究,包括核磁共振(NMR),圆二色谱(CD),激光拉曼光谱等。例如,MoiseL等报道了一个新的高清晰度的α-银环蛇毒素(α-BGT)的NMR结构,它定义了决定二硫化物的核心和β-sheet图的区域范围。此外,X-射线晶体衍射对蛇毒的晶体结构的研究,加速了在分子水平了解神经毒素的免疫学特征的步伐。蛇毒具有相当丰富的立体空间结构,其分子中几乎每一个氨基酸残基对其空间结构的形成都发挥着重要的作用。比如,蛇毒α-神经毒素为一小分子的58~74个氨基酸残基单肽链碱性蛋白,主体空间构象呈三指环状,是探讨蛋白质一级结构与高级结构以及结构与功能很好的材料。α-BGT与nAchR结合的专一性很好,亲和力极高,因此,是研究乙酰胆碱受体结构的理想探针,可用于显示完整细胞膜表面乙酰胆碱受体的分布和密度;观察各种药物、毒物和其他致病因子对乙酰胆碱受体动力学变化的影响;也是从组织中分离和纯化乙酰胆碱受体的重要工具(LesterHA,1977)。4蛇毒开发4.1新药物开发4.1.1pla2治疗pgi3的降压作用中国蛇协毒素研究所最近几年正在开发蛇毒成分中的两种新药:一种是降压药,另一种是止血药。国外报道从巴西矛头蝮蛇毒中分离得到的一种活性肽,能阻断血管紧张素I向血管紧张素II转化,从而降低了人体血管紧张素的增压活性,可用于防治肾性高血压及由于长时间压迫肾动脉所致的血压升高。现已发现国产五步蛇毒中有降压活性非常明显的组份,很有希望开发成为一种新的降压药。另外研究发现PLA2组份中的II-5、II-7、III-3、III-6体内注射时可降低血压,其降压作用不受受体阻滞剂影响。PLA2降压作用通过以下三种途径:(1)通过PLA2释放PGI2影响的结果;(2)抑制血管紧张肽原酶活性的结果;(3)使肺血管收缩,间接起到降压作用。PLA2的降压作用为降压新药的开发提供了依据。目前国际市场上畅销的降血压药卡托普利(巯甲丙脯酸)即为人们模拟喹蛇蛇毒中一种小分子多肽物质的结构而开发成功的一类新型降压药。随后上市的依那普利、赖诺普利等均为模拟蛇毒分子结构而合成的降血压良药。国外同时报道巴西矛头蝮蛇毒中分离出一种蛇毒凝血酶,能缩短出血和凝血时间,注射1u后,经20min即可使健康人正常凝血时间缩短1/2~1/3。该药注射后10min即产生止血作用,24h后作用消失。这种蛇毒凝血酶在没有钙离子存在时也能使血液凝固,不会诱发任何血管内凝血现象,故不会引起血栓,临床用于预防和治疗各种出血。中国蛇协毒素研究所已在国产蛇毒中找到止血活性成分,如能开发新的止血药,将为蛇毒的临床应用开辟新领域。4.1.2新一代抗凝血药国外在开发蛇毒的抗凝血素方面已取得重大进展。美国默克制药公司的研究人员从栖息在美国南方的小响尾蛇的毒液中分离出一种抗凝血素,它能与人的血小板表面受体结合,从而防止血小板与血液中的血纤维蛋白原结合而形成致命的血栓。科学家分析表明,小响尾蛇的蛇毒中含有两种不同的抗凝素,它们的分子结构均为“精氨酸+甘氨酸+天冬氨酸”(A+G+A)。默克公司的科研人员根据小响尾蛇蛇毒的这一分子结构,开发出两种环型多肽类新型药物:Eptifi-tatide与tirofitan。这两种药物均为新一代抗凝血药,其抗凝血作用远远胜过阿司匹林的抗凝血效果。在美国所做的大规模临床试验(共有18000名有心肌梗死危险的病人参加)的结果证实:这两种新药无论单独使用或与其它抗凝血药物配伍使用,均可有效降低心肌梗塞等严重心血管病的发生率。4.1.3蛇毒胶囊治疗癌症天然眼镜王蛇神经毒素CM11的毒理学、药理学研究证实它具有较强的止痛、麻醉及戒毒功效。根据蛇毒α-神经毒素阻断神经传导过程的性质可以开发出不成瘾的新型镇痛药,用于镇痛、麻醉和戒毒。目前美国已批准生产两种蛇神经毒素作为药物,一种是Cobroxin,主治顽固性神经痛及恶性肿瘤痛;一种是Ngloxin,主治关节痛。近年来应用蛇毒胶囊治疗各种癌症,据报道有使肿块缩小、延长癌症病人生存期等功效。蛇毒胶囊中含有眼镜蛇毒和蝮蛇毒,但对治疗癌症的作用机理还不清楚,有待今后的研究和临床继续观察。台湾学者在五步蛇分泌的蛇毒中分离出一种分子结构类似于凝血酶类蛋白酶的新多肽物质(学名为A-cutin),它能阻滞血管内上皮细胞的αVβ3与生长素结合,从而防止形成新的血管,这在肿瘤治疗中极为重要。现代医学研究证实,所有实体肿瘤无一例外均需要不断刺激瘤体附近生长密集的血管网,以此为肿瘤组织源源不断地提供养料。试验结果表明:来自五步蛇毒的A-cutin能阻止肿瘤周围的新血管网形成,这表明切断了肿瘤赖以生长的“供给线”,故A-cutin有望成为一种新型抗肿瘤药物。4.1.4蛇鳖胶囊和蛇粉胶囊浙江龙图蛇业集团有限公司最新开发的蛇类第三代深加工“女蛇王”系列产品—功能性保健品精力源纯蝮蛇粉、蛇王酒、龙凤长乐酒、蛇鳖胶囊等通过国家专利局检索及专家鉴定,产品填补了国内空白,并被列入国家、省级新产品项目,企业已通过ISO9002国际标准认证,蛇鳖胶囊和“女蛇王”牌纯蛇粉胶囊通过美国食品药物管理局FDA认证