肠溶胰岛素plga纳米粒的制备及降血糖作用研究

肠溶胰岛素plga纳米粒的制备及降血糖作用研究

胰岛素是治疗糖尿病的主要药物之一，但其主要剂量是注射。对于患有糖尿病的患者来说，每天注射几次肯定是痛苦和不舒服的。因此药学工作者一直在致力于胰岛素非注射给药途径的研究,在众多的研究中口服给药的途径是最方便、最为患者所希望的。目前研究的胰岛素口服给药的主要载体有乳剂、脂质体、微球、纳米粒、油性制剂、胶囊等。其中纳米粒给药系统成为胰岛素口服给药的热门载体。研究证明,纳米粒在消化道内能够被派氏淋巴结上的M细胞吞噬,或者通过细胞间通道吸收。因此如果使用纳米粒作为蛋白多肽类药物的载体口服给药,不仅减少消化道强酸、碱以及消化酶的降解破坏,而且还有助于以整体形式通过肠黏膜上的淋巴系统吸收。乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是合成的高分子材料,它可以在体内分解,最终生成二氧化碳和水,对机体无不良影响,因此被视为理想的载体材料且广泛应用于各种药物的纳米粒制剂中。由于PLGA纳米粒大部分在人工胃液中都存在着使药物突释的现象,这大大降低了药物的生物利用度,因此作者在PLGA纳米粒的制备过程中,通过引进肠溶高分子材料羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HP55)制备了具有肠溶性质的纳米粒,不但降低了纳米粒在人工胃液中的突释,还提高了纳米粒的载药量。并对纳米粒的理化性质及口服后在正常大鼠体内的降血糖作用进行了考察。1高效液相色谱法测定聚乙烯醇-甲基纤维素FD-1冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司),LS320激光粒度仪(Beckman-CoulterCo.,Ltd.,USA),超速离心机(CS120GXL,HitachiCo.,Japan),KromasilODS-1色谱柱(C18,200mm×4.6mm,5μm,大连化物所),高效液相色谱仪(HitachiCo.,Japan)。胰岛素(27.5IU·mg-1,江苏万邦生化医药股份有限公司),聚乙烯醇(PVA,聚合度约500,Shin-EtsuChemicalCo.Ltd.,Japan),乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA,摩尔比50∶50,相对重均分子质量16500,四川有机化学研究所),羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HP55,黏度40cSt;HP50,黏度55cSt,Shin-EtsuChemicalCo.Ltd.,Japan),其他试剂(分析纯)。Wistar大鼠,雄性,体质量(200±20)g,沈阳药科大学试验动物中心提供,合格证号:辽实动字2000-042。2方法和结果2.1plaga-hp65纳米粒的制备采用改良的乳化溶剂扩散法制备纳米粒(NP,nanoparticles)。将一定比例的PLGA、HP55和胰岛素溶解于丙酮和10mmol·L-1盐酸(体积比为1.2∶0.18)组成的混合溶剂中,在搅拌下将此溶液快速注入到10g·L-1的聚乙烯醇溶液中,搅拌1h,30000r·min-1超速离心30min,蒸馏水洗涤2次,冷冻干燥,得PLGA-HP55纳米粒。如在处方中只加入PLGA,同法制备,得PLGA纳米粒。2.2粒度测量将制备好的纳米粒用蒸馏水重新分散为纳米粒混悬液,使用激光粒度测定仪测定粒径分布。2.3moll-1na2so4用HPLC法测定药物含量,其色谱条件如下:流动相为0.1mol·L-1NaH2PO4水溶液(磷酸调节pH值3.0)-乙腈(体积比为73∶27,含0.1mol·L-1Na2SO4),波长为214nm,流速为1.0mL·min-1,柱温为35℃,进样量20μL。精密称取干燥后的纳米粒,用丙酮溶解,然后加入0.1mol·L-1盐酸沉淀,在30000r·min-1条件下离心30min,收集上清液,测定上清液中胰岛素含量,根据下式计算纳米粒中药物的含量。药物的含量(%)=纳米粒中药物的量/纳米粒的总量×100%。2.4摇床中振摇取干燥后的纳米粒5mg,分别置于5mL的人工胃液和人工肠液中,然后放入摇床中振摇(37℃,50r·min-1)。分别于0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、16和24h取样,以30000r·min-1低温超速离心30min,取上清液进行测定,计算药物的累积释放量。2.5plga-hp65纳米粒的释放行为为了考察HP55对纳米粒性质的影响,固定PLGA和HP55的总量,改变其比例(质量比为1∶1、1∶0.5、1∶0.25、1∶0.2),制备纳米粒。测定粒径、载药量和体外释放。同时考察了与HP55相近的高分子HP50[m(PLGA)∶m(HP50)=1∶0.5]对纳米粒性质的影响。表1表示高分子的不同比例对纳米粒粒径和载药量的影响。由表1中数据可知,随着处方中HP55的比例的增加,纳米粒的粒径和载药量均增加。但当质量比达到1∶0.5以后再增加HP55的量,载药量增加的幅度并不大。说明此时再增加HP55的量已经不能提高载药量。如以HP50为肠溶材料,PLGA和HP50的质量比为1∶0.5时,PLGA-HP50纳米粒的粒径和载药量均比PLGA-HP55纳米粒的大,这可能是由于HP50的黏度比HP55的黏度大,因此在制备过程中形成的纳米粒的粒径大,所包裹的胰岛素的量也多。图1和图2分别表示不同比例高分子的纳米粒在人工胃液(SGF)和人工肠液(SIF)中的释放行为。◆—m(PLGA)∶m(HP55)=1∶1;■—m(PLGA)∶m(HP55)=1∶0.5;▲—m(PLGA)∶m(HP55)=1∶0.25;○—m(PLGA)∶m(HP55)=1∶0.2;ue0e0—m(PLGA)∶m(HP55)=1∶0;●—m(PLGA)∶m(HP50)=1∶0.5Fig.1ReleaseprofilesofinsulinfromnanoparticlescomposedofdifferentratiosofPLGAtoHP55inSGF(n=6,ˉx±s)◆—m(PLGA)∶m(HP55)=1∶1;■—m(PLGA)∶m(HP55)=1∶0.5;▲—m(PLGA)∶m(HP55)=1∶0.25;○—m(PLGA)∶m(HP55)=1∶0.2;ue0e0—m(PLGA)∶m(HP55)=1∶0;●—m(PLGA)∶m(HP50)=1∶0.5Fig.2ReleaseprofilesofinsulinfromnanoparticlescomposedofdifferentratiosofPLGAtoHP55inSIF(n=6,ˉx±s)由图1可见,在人工胃液中,HP55和HP50均可以有效地降低药物的释放速度,这种降低的幅度随着肠溶材料质量比的增加而增大,但肠溶材料与PLGA的质量比达到0.5∶1时就不再明显。与此相反,在肠液中的释放行为(图2)是随着肠溶材料的质量比的增加,药物的释放量增加,虽然增加的幅度不大,但反映了镶嵌在PLGA骨架中的肠溶材料在肠液中溶解后对药物释放的影响。对药物释放的影响不大,主要是因为虽然不同量的肠溶材料溶解后产生不同大小的孔道,但胰岛素易溶于水,因此PLGA骨架对药物的阻止作用不强。根据表1和图1、2中的数据,作者将PLGA和肠溶材料的质量比例固定在1∶0.5制备纳米粒,并进行药效学的考察。2.6不同给药组大鼠血糖质量分数的变化将大鼠分成5组,给药前禁食12h,一组为空白对照组,口服给予胰岛素生理盐水溶液(剂量20IU·kg-1);一组为阳性对照组,即皮下注射胰岛素生理盐水溶液(剂量1IU·kg-1);其他组为给药组,分别灌胃PLGA、PLGA-HP55和PLGA-HP50纳米粒的混悬液(剂量20IU·kg-1)。分别于给药后0、1、2、4、6、8、12、16、24h于眼角静脉丛取血0.2mL,按血糖试剂盒方法测定血糖质量分数,并计算其相对于零时血糖质量分数的变化率,绘制血糖变化百分率和时间的关系曲线。根据给药组血糖时间曲线下面积计算相对于皮下注射胰岛素的生物利用度。计算方法如下式:F=Aoral×(dose)scAsc×(dose)oral。其中,F为口服制剂相对于皮下注射胰岛素溶液的相对生物利用度;Aoral和Asc分别为口服胰岛素纳米粒和皮下注射胰岛素溶液的血糖-时间曲线下面积;(dose)oral,(dose)sc分别为口服和皮下注射的胰岛素剂量。不同给药组动物的血糖质量分数-时间变化曲线见图3。由图3可知,空白对照组大鼠在24h内的血糖质量分数无显著变化,仅有小幅度的波动。大鼠皮下注射胰岛素生理盐水溶液之后,血糖质量分数在2h时降到最低,然后开始恢复,在6h左右恢复达到初始水平,之后无显著变化。口服给予PLGA纳米粒的混悬液后,动物血糖质量分数显著降低,其降血糖作用可持续长达20h以上,而给予PLGA-HP55纳米粒之后,降糖作用明显增强,而且其降血糖作用同样可持续20h以上。PLGA-HP50纳米粒虽然也能降低大鼠的血糖质量分数,并且降糖效果比单独的PLGA纳米粒好,但其效果并不如PLGA-HP55纳米粒好。经计算PLGA、PLGA-HP55和PLGA-HP5024h相对于皮下注射给药的相对生物利用度分别为(5.46±0.70)%、(8.72±0.50)%和(6.31±0.64)%。3对大鼠血糖的影响PLGA是合成的高分子材料,具有良好的组织相容性和生物可降解性,是制备纳米粒的理想材料。制备的方法有乳化溶剂扩散法、乳化-相分离法、冷冻干燥法、相转化法及纳米沉淀法等,作者选择了改良的乳化溶剂扩散法来制备肠溶纳米粒,制备过程简单。HP55是常用的肠溶包衣材料,广泛的用于片剂、微球的肠溶包衣,但在制备肠溶纳米粒方面的报道却非常少,作者通过改良的乳化溶剂扩散法,将HP55直接溶解于油相中,制备得到具有肠溶性质的PLGA纳米粒。所得肠溶纳米粒在人工胃液中的药物释放明显低于PLGA纳米粒的释放,从而保护胰岛素不受胃中酸和酶的破坏,提高了药物的生物利用度。HP55不但可以减少胰岛素在人工胃液中的突释,还可以提高药物在纳米粒中的含量。这可能是由于HP55的分子中含有大量的羧基,与胰岛素中的氨基通过静电相结合,同时HP55的分子质量非常大,可能会在制备过程中与胰岛素分子相互缠绕,从而提高药物的载药含量。作者所制备的胰岛素PLGA纳米粒能够有效地降低大鼠的血糖质量分数,降糖效果比较持久;而具有肠溶性质的PLGA纳米粒则使其降糖作用更为显著,尤其是在6h以后,该给药组动物的血糖质量分数明显低于PLGA纳米粒给药组,生物利用度显著提高。以PLGA-HP50(质量比1∶0.5)制备的纳米粒虽然粒径、载药量和体