抗体制备的研究进展

抗体制备的研究进展

作为一种研究工具，抗生素在现有的科学研究和医学工作中发挥着重要作用。因此，对抗生素准备的要求水平有所增加。近年来,针对抗体制备过程中抗体的分类、抗原制备、免疫动物及免疫方法选择的研究越来越多,本文旨在对以上几个方面的科研进展进行综述。1细胞增殖能力的移植抗体分为天然抗体、单克隆抗体、多克隆抗体及基因工程抗体4类。1975年英国剑桥大学米尔修塔博士把淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞,杂交瘤细胞克服淋巴细胞克隆的困难,可以使淋巴细胞在体外无限增殖,这种无限增殖能力是骨髓瘤细胞增殖能力的移植。当具有无限增殖能力的淋巴细胞受到以癌细胞作为抗原的刺激后,淋巴细胞就会源源不断地合成免疫功能单一的抗体。这种由一种抗原决定簇刺激机体,由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体,具有高度的特异性、选择性和专一性。1888年,Emile和Yersin发现白喉杆菌可以产生外毒素。随后,1890年Behring和Kitasato用白喉外毒素免疫动物后,在该动物血清中发现了可以中和白喉外毒素的物质,称之为抗毒素,然后用同样方法通过免疫血清成功治愈了1例患白喉病的女孩。像这种由多种抗原决定簇刺激机体,一系列抗体生成细胞会不同程度地与抗原结合,在血液中相应地产生不同类型的单克隆抗体,这种由一种抗原刺激产生的混杂在一起的单克隆抗体称为多克隆抗体。1.1抗体沉淀和凝集反应单克隆抗体和多克隆抗体各有其优缺点。总体来讲,单克隆抗体特异性高,制备成功后就可以继续生产完全一致的抗体,但单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应,所以很多检测方法不能使用单克隆抗体完成,而且反应强度不如多克隆抗体,且制备技术复杂,费时费工,实验周期长,价格也高。因此,在科研领域中使用较多的是多克隆抗体。1.2抗体扩大的观察当抗原注射入实验动物体内时,刺激网状内皮细胞系统,使淋巴结和脾脏的淋巴细胞大量增殖。首次注射后大约7d,在血清中可以观察到抗体,但抗体的浓度维持在一个较低的水平,大约10d抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同,和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。进而通过Elisa方法检测抗体的效价,通过Western-blot方法检测抗体的特异性。2多肽原原核的制备原核表达与多肽合成目的蛋白各有优缺点。原核表达可以在较短的时间内获得基因表达产物,所需成本较低,但是也有些外源基因无法进行原核表达。多肽合成是将分析好的多肽抗原进行固相或液相合成,抗原性高,但成本也高。因此在实际实验过程中应该把原核表达和多肽合成有效结合起来完成多克隆抗体的制备。2.1基因片段原核表达载体的纯化在不同类型的表达系统中,最早采用的是原核表达系统。此项技术主要是将克隆有目的基因片段的原核表达载体转化至原核表达菌株(一般是大肠杆菌),在IPTG诱导、纯化下获得所需目的蛋白,所需时间较为短暂,成本低。而且大肠杆菌遗传背景清楚,具有周期短、使用安全、易操作等特点,因此成为外源基因的首选表达系统。2.1.1确定原核载体的分类基因工程中使用的载体分为克隆载体和表达载体。克隆载体可以使外源基因在受体细胞中复制扩增;而表达载体适合在受体细胞中表达外源基因。原核表达载体通常以质粒形式存在,一个典型的表达载体应该具有启动子、复制子、筛选标记、多克隆位点、融合标签(如果有的话)、终止密码子。构建原核表达载体时要学会看质粒图谱,首先看启动子(Ori)的位置;其次要看筛选标记;再次要看多克隆位点;最后确定质粒上是否有启动子和终止子。原核表达载体的分类原核细胞表达外源基因时,根据表达类型不同,可以分为融合型表达和非融合型表达。通过非融合型表达出的外源蛋白不与细菌的蛋白或者多肽融合在一起,通常以包涵体的形式存在。常见的原核表达载体有非融合性表达载体pKK223-3,它具有一个强的tac(trp-lac)启动子;融合表达载体pGEX;分泌性克隆表达载体pINⅢ系统、融合蛋白载体PET系统等。pET系统是目前应用最广泛的表达载体,目的基因被克隆至pET质粒载体,当细胞中有T7RNA聚合酶和T7噬菌体启动子时,宿主本身基因的转录比不上T7噬菌体启动子的转录系统,诱导表达后仅几个小时,外源目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。但是大肠杆菌自身是不表达T7RNA聚合酶的,因此必须给宿主菌引入外源T7RNA聚合酶,在没有加入诱导剂的情况下,外源基因处于沉默状态,不发生转录;通过加入诱导剂控制T7RNA聚合酶的产量,从而控制外源蛋白产物的表达量。2.1.2蛋白酶缺陷型菌株表达宿主菌株的选择也是在原核蛋白表达过程中必须要考虑的因素。菌株内源蛋白酶的增多会造成外源表达产物不稳定,所以在原核表达过程中多采用蛋白酶缺陷型菌株,例如表达菌株BL21。BL21(DE3)溶源菌添加了T7RNA聚合酶基因,它含有lacUV5启动子下游的T7RNA聚合酶基因和lacⅠ抑制基因,通过溶源菌在宿主内引入T7RNA聚合酶,当构建好的表达载体转化到表达菌株中后,在lac诱导调控下通过异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。2.1.3tki的纯化影响外源基因在大肠杆菌系统中表达的因素有:①表达载体的选择:在表达载体上插入辅助基因序列构成融合蛋白表达,融合信号肽(PelB、OmpA,MalE,PhoA等)表达可以通过Sec途径分泌到胞质或胞外,有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解和N端甲硫氨酸的延伸。研究表明双晶氨酸转运体系(Tat)可以有效分泌正确折叠的重组蛋白。常见的纯化标签有6-His、GST、CAT等,链球菌亲和素结合肽(SBP)、Ca2+依赖的钙调蛋白结合肽(CBP)作为纯化标签时,在洗脱液中移去标签依赖性的小分子就可以实现温和的特异性洗脱;②外源基因中密码子的使用,如果外源基因中含有相当多的稀有密码子,在原核中表达效率会偏低;③mRNA稳定性影响;④培养条件控制。2.2液相分段合成法多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成,合成途径主要有化学合成和生物合成。多肽的化学合成法有液相合成和固相合成之分。多肽化学合成法分类液相分段合成是在溶液中根据多肽片段的化学选择性或者专一性,自发合成多肽的合成方法。常用的连接技术主要有:天然化学连接、光敏感辅助基连接、化学区域选择连接、施陶丁格连接、可去除辅助基连接和正交化学连接。固相合成的基本原理是:将所要合成肽链羟基末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连,然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应,接长肽链,固相合成法简化并加速了多步骤的合成,可避免因手工操作和物料重复转移产生的损失。3免疫动物的制备获得多克隆抗体的最终步骤是动物免疫。其中选择合适的免疫动物尤为重要。一般来讲,所选择的蛋白抗原供体与免疫动物种系不可太接近,亲缘太近不易产生良好抗体,甚至不产生抗体(如兔和大鼠、鸡和鸭)。免疫动物包括家兔、啮齿类、鸡等小型实验动物以及绵羊、马、山羊等大型家畜。其中家兔是最适合制备抗体的动物;小鼠一般用于单克隆抗体制备,在需要大量抗血清时,主要用大型家畜。在动物性别、年龄以及数量上的选择一般选用雌性、青壮年期1只以上的个体。患病或处于感染、饥饿状态均会影响免疫效果,因此应选用健康壮实的动物。在实际免疫过程中还需要根据不同性质的免疫原选择使用动物进行免疫。对于蛋白质抗原来讲,大部分动物均适合,最常用的是家兔和山羊。当某些动物体内有类似物质存在时,蛋白质抗原免疫原型变差,例如胰岛素对家兔、IgE对绵羊免疫后不容易产生抗体。4免疫方法4.1弗氏完全佐剂的制备免疫过程中需要弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。弗氏不完全佐剂一般用液体石蜡与羊毛脂混合而成,在不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌,即成为弗氏完全佐剂。由于佐剂是油状物质,因此必须将弗氏佐剂和抗原充分混匀成乳剂,鉴定混匀的方法是将一滴乳剂滴入水中,如呈一滴不散,漂浮于液面上,则表示完全乳化。4.2免疫剂量的选择免疫动物时应考虑动物个体状态、抗原性的强弱、抗原分子大小选择合适的免疫剂量。一般来讲,首次注射后,每次注射间隔1周左右,注射4次,在采集免疫血清前,必须先对抗体的效价进行测定,达到要求时再进行采血。4.3肌肉注射和牛奶注射免疫途径包括皮下、静脉注射或皮内注射、肌肉注射、腹腔注射、淋巴结注射等。在鸡上的研究显示在腿部肌肉注射会取得更高的抗体效价;在奶牛上研究后海穴的注射也会取得较高的效价;兔子和小鼠一般在腹部皮肤注射会取得比较好的效果。4.4采血常用方法在测定抗体效价后,开始采集免疫血清,采集前让动物禁食24h以防血脂过高。目前采血主要包括静脉采血法、颈动脉放血法和心脏采血法。静脉采血法可使动物保持活体状态,并可多次采血,缺点是每次获得血量较少。颈动脉放血法和心脏采血法获得血量较多,但需要熟练的手术技术。4.5免疫血液清的保存冻存血清前将血清分装