胶原多肽的开发

胶原多肽的开发

类固醇是一种结构相关的蛋白质家族。它广泛存在于动物皮肤、骨骼、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中。它是连接极其重要的结构蛋白，并起着支持结构器官和身体组织的作用。胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结构,三条链相互平行而且由链间氢键相连,具有十分稳定的性质,一般的加工温度及短时间加热都难使其分解,因此难被人体吸收,食用利用率较低。将胶原蛋白水解为胶原多肽后,其营养及生理功能可显著提高:蛋白质消化吸收率几乎达100%,能保护胃黏膜以及抗溃疡,促进皮肤胶原代谢,抑制血压上升,对关节炎等胶原病具有很好的预防及治疗作用,能促进钙吸收和降低血清中胆固醇含量等。因此,胶原蛋白的水解及胶原多肽的利用一直是科学工作者研究的一个热门课题。1关于决定胶囊中的蛋白质的亲水方法1.1不对称碳原子法蛋白质水解产物的生产方式通常有两种:化学降解法和酶降解法。化学法是用酸、碱等化学试剂在一定温度下促使蛋白质分子的肽链断裂形成小分子物质的方法。酸法多采用盐酸、硫酸等强酸在高温下反应,反应强烈,设备腐蚀严重,水解彻底,得到的多肽分子质量分布不均匀,色氨酸完全被破坏,该法目前已逐渐被淘汰;碱法水解会因为不对称碳原子经过中间状态的过度阶段,发生消旋现象,即产生D-型和L-型的等摩尔混合物,使氨基酸大多消旋,其中,D-型氨基酸不能作为有效的氨基酸源,有些还具有毒性甚至有致癌、致畸和致突变作用。20世纪80年代,随着酶制剂工业和食品工业的迅猛发展,人们发现酶法水解反应条件温和,反应时间短,无环境污染,产品营养价值高,产物以多肽和L型游离氨基酸为主,易于人体消化吸收,因而利用酶水解胶原蛋白逐渐受到了人们的重视。1.2其他酶的制备能使胶原蛋白酶解的酶类较多。按照作用位点可以分为内切酶和外切酶;从来源上可分为植物蛋白酶(如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等)、动物蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶等)、微生物蛋白酶(如枯草杆菌1.398、放线菌166等);此外,较常用于水解的蛋白酶还有风味复合酶等。在实际应用中,酶的选取通常要考虑三个方面:一是酶对胶原蛋白作用的强度;二是酶的价格;三是水解产物的要求。如果酶对胶原的作用太弱,则无法得到高的胶原水解率,而酶的纯度直接影响酶的价格,纯度较高的酶与工业用酶的价格往往相差甚远。因此开发的产品如没有特殊要求,一般可以考虑选择用已完全工业化的酶。除此之外,还必须考虑酶对胶原的作用位点,因为这直接影响最后水解产物分子量的分布,是决定能否得到目标产物的一个关键因素[3~4]。2对宋江表面的酶分解2.1复配蛋白水解产物的活性目前酶解胶原蛋白的工艺主要分为单酶水解法和多酶水解法。多酶水解法又分为混合酶水解法或分步酶水解法。酶解胶原蛋白的具体实验工艺及条件的选取通常应考虑要开发的产品对分子量的要求,要得到分子量较小的胶原多肽一般采用多酶水解法。从上个世纪80年代我国开始这方面的研究工作,目前已经取得了较多研究成果。例如曹健等在研究影响胶原蛋白水解物分子量和水解度的各种因素时发现复合蛋白酶用量在控制胶原蛋白水解产物分子量方面作用非常明显。李彦春等以牛皮边角废料为原料,用两步酶解法提取胶原蛋白多肽,并对影响酶水解过程的各个因素进行了分析。通过对水解产物分子量分布和等电点等指标的测定,发现分子量呈不连续分布,主要集中在某些分子量处,分子量的分布主要与所用酶的种类和酶解方式有关。通过酶解其配合物也可有效控制其分子量的分布。2.2生产鱼皮胶原蛋白寡肽的最优条件确定影响胶原蛋白酶解的因素主要包括酶的种类、酶的用量、酶解时间、pH、水解温度等。安广杰和徐清萍以牛骨素为原料,应用Neutrase蛋白酶制备水解明胶的工艺。确定最佳水解条件为:温度50℃、pH为5.5、加酶量2%、底物浓度4.0%、水解时间3h,得到产品的分子质量分布范围为5~20KDa。韩凤杰等利用单因素试验和响应面分析确定了2709碱性蛋白酶水解比目鱼皮的最佳工艺条件为:pH为l0;底物质量浓度70g/L;温度55℃;加酶量4%;水解2h;最大水解度为22.36%。然后对水解产物进行后处理,得到了一套完整的生产鱼皮胶原蛋白寡肽的工艺。用飞行时间质谱仪测定所得水解产物的分子质量分布范围,结果表明其分子质量主要集中在0.6~1.8kDa之间。对于复合蛋白酶而言,虽然较高的pH有利于水解,但差异不明显,反应温度在40~50℃之间水解效果较好。2.3鸭掌胶原蛋白酸法水解过程动力学刘海英等对斑点叉尾鮰鱼皮明胶水解制取抗氧化活性肽的方法进行了研究,比较了不同的水解方法、不同底物、不同的蛋白酶对水解产物抗氧化活性的影响。研究结果表明酶解法适合生产胶原蛋白活性肽,酶解产物具有不连续的分子量分布及较好的抗氧化活性。不同底物酶解制取的产物的抗氧化活力不同。郑巧东等通过全波长扫描和凝胶渗透色谱,对水解过程动态及其多肽分子质量的变化进行了研究,考察了水解温度、酸用量等因素对水解动态的影响,并对酸法水解的过程动力学进行了分析。结果说明:鸭掌胶原蛋白酸法水解得到的多肽分子质量分布不均匀,分子质量大小随反应时同的增大而减小;增大酸用量和提高浓度可使水解反应更彻底,水解过程可用一级反应动力学方程进行描述。曹健等以胶原蛋白粉为原料,采用木瓜蛋白酶、复合蛋白酶对其进行水解,对影响胶原蛋白水解物分子量和水解度的各种因素进行了研究。研究表明随着反应时间和加酶量的延长或增加,水解度增大,产物分子量变小。其中酶的用量,尤其是复合蛋白酶用量在控制胶原蛋白水解产物分子量方面作用更为明显。此外,对木瓜蛋白酶而言,反应pH为5.0时水解度最高,反应温度在40~60℃之间时可将胶原水解产物的分子量控制在6.5~20KDa之间。这些研究成果对控制产物分子量具有理论和实践上的指导意义。还有些文献对水解产物的研究进行了报道。BoLi等在进行水解猪皮胶原的实验时发现混合蛋白酶与单酶相比,所得的水解产物具有更强的抗氧化活性。水解的程度会影响水解产物的抗氧化剂的性质,缩氨酸的分子越小金属螯合的能力就越强。V.Šernrl-Kosmac等利用碱和酶水解铬革屑制备胶原水解产物,将其与长链的羧酸及它们的氯化物缩合。胶原水解产物和缩合物分别与乙烯和丙烯氧化物嫁接,用化学和分光镜分析其反应程度,认为缩合物的表面活性主要与所使用的酸有关。3本研究中亲水酶的水解性能与作用机制的研究3.1曲霉菌丝氨酸蛋白酶水解对于水解胶原蛋白方面的研究,国外的报道很多。例如RuudA.Bank等采用SDS决策法分别测定α-胰凝乳蛋白酶水解完整的胶原蛋白、热处理(70℃,30min)过的变性的胶原蛋白、以及用人体胶原酶解旋的胶原蛋白得到的碎片的尺寸,通过比较得出胰凝乳蛋白酶不能使完整的三股螺旋的胶原蛋白分子解链,但能使变性的胶原蛋白完全降解成小分子产物。S.R.L.Teruel研究发现美洲比目鱼胶原蛋白酶不能水解牛胶原蛋白,鱼胶原蛋白酶在pH为7时活性最高。天然的鱼胶原蛋白酶在37℃经过12h能够水解不能溶解的牛胶原蛋白。MasatoHiyama等人实验发现某种曲霉菌丝氨酸蛋白酶OK-22,在37℃,pH为7.5,经过48h,Ⅰ-型胶原蛋白的水解程度达到12%。曲霉菌丝氨酸蛋白酶水解Ⅰ-型胶原蛋白的上限大约是12%,与水解乳酪的程度一样,而真菌蛋白酶水解胶原蛋白的程度要比水解乳酪的程度弱的多。SiripornDamrongsakkul等在用木瓜蛋白酶和应用Neutrase蛋白酶水解生牛皮时,发现应用Neutrase蛋白酶水解的产物中,胶原蛋白的水解产物的粘度跟水一样低。Ⅰ-型的人类胶原蛋白是存在于哺乳动物体内最丰富的一种分子,天然的胶原对大多数的胶原蛋白酶都具有抵抗力。J.Friedrich等在研究角蛋白酶对天然胶原的水解能力时发现羽毛角蛋白和胶原不能被这种从菌类提取的角蛋白酶水解。曾名勇等采用正交试验确定了菠萝蛋白酶和alcalase2.4L碱性蛋白酶这两种酶单独水解鱼皮胶原蛋白的最佳酶解条件。在此基础上,进行复合酶水解实验,表明先采用菠萝蛋白酶水解,再用alcalase2.4L蛋白酶水解,效果更佳。薛勇等在研究岩藻聚糖硫酸酯寡糖-Ce(Ⅳ)配合物的制备及其对胶原蛋白的水解活性时发现小分子岩藻聚糖硫酸酯寡糖-Ce(Ⅳ)的配合效果最好,且水解胶原蛋白的活性高,并通过实验确定了配合条件以及配合物对胶原蛋白的最佳水解条件。孙爱梅等研究认为胰蛋白酶对天然胶原蛋白几乎没有作用,但可以降解变性的胶原蛋白。胰蛋白酶水解胶原的最适条件是pH为8.1~8.2、温度37℃。在此条件下,采用凝胶过滤色谱分析考察了酶用量时间对胶原蛋白降解过程的影响。通常情况下,在酶促反应中底物浓度比酶浓度高得多,增加酶用量对酶促反应初始速率影响较大,而且速率增加与酶用量成正比,随着底物浓度的降低,酶用量对反应速率的影响逐渐减小。陈秀金等研究了用碱性蛋白酶水解脱铬革屑制备胶原水解产物时,影响胶原蛋白水解产物收获率的各种因素,确定了最佳水解条件为,并对胶原水解产物的理化性质进行了测定。3.2出血蛇毒素对-型胶原的水解对于酶作用机理的研究也很多。MisookKim等利用从生姜的根茎中提取的半胱氨酸蛋白酶GP2水解从小牛皮中提取的Ⅰ-型胶原蛋白时,发现这种酶能作用于胶原分子三条螺旋链上的相同位点,是目前唯一被证明能够水解天然胶原的植物半胱氨酸蛋白酶。YoshioYamakawa等测定了纯出血蛇毒素水解几种白明胶和胶原蛋白的能力。但在天然胶原中只有Ⅳ-型胶原能够被水解。出血蛇毒素对Ⅳ-型胶原的水解具有时间依赖性,在开始的2h水解非常迅速;出血蛇毒素作用于Ⅳ-型胶原不同的位点来水解三股螺旋结构。MagdaGioia等检测了嗜中性粒细胞胶原蛋白酶,白明胶酶A降解胶原纤维的作用机制,通过研究Ⅰ-型胶原蛋白在37℃时水解,确定了在处理过程中两种α-链胶原蛋白的功能差异。运用热力学和动力学参数定量的比较,发现金属胶原蛋白酶对对胶原蛋白分子链的解旋和伸展至少有两种截然不同的机理。A.CristinaSarmento等认为存在三种溶胶机理,一种是用裂缝胶原蛋白酶,能够分裂稳定三股螺旋胶原蛋白,第二种是拓宽的精细蛋白酶,如半胱氨酸蛋白酶,能够作用于天然胶原蛋白分子的分裂的肽端,第三种是细菌蛋白酶及组织蛋白酶K。EricDufour等研究了胶原酶和组织蛋白酶B水解Ⅲ-型的胶原时流体静压力的作用。实验证明高压条件下胶原分子表面一些氨基酸侧链不宜暴露,也不宜被组织蛋白酶B识别。胶原水解的速率随着压力的增大而减小。高压会导致酶和底物的构象发生变化,压力还会改变酶的弹性。4关于亲水的研究4.1在医药化妆品领域的应用自1979年日本学者大岛等确认胶原多肽具有降血压作用以来,相继有许多研究表明胶原多肽具有很多生理功能,特别是最近的一些报道表明胶原多肽能最大程度地发挥出胶原的各种功能。随着研究的不断深入,胶原多肽在生物医学、食品保健、化妆品等领域得到了广泛的应用。由于胶原多肽具有促进人体新陈代谢,清除人体体内垃圾,健脾胃,改善睡眠,延缓衰老,预防骨质疏松的作用,特别适合儿童的生长发育和中老年人的营养补充,因此在医药保健品中深受青睐。同时酶解法制备的胶原多肽能很好的保持其生物活性,控制相对分子质量适合人体吸收,对人体皮肤具有保湿、防皱、营养作用,可作为高级面膜、高级润肤霜、洗面奶的优质原料,同时还可用于洗发护发品、沐浴液等,所以在日用化学品开发方面拥有一定的市场。除此之外将胶原多肽添加于面包、蛋糕及各种点心中,改善食品的营养结构,特别有利于儿童和老弱病残者的消化吸收,是理想的居家旅游食