乙型肝炎病毒免疫学研究进展

乙型肝炎病毒免疫学研究进展

中国是肝炎的高流行地区。感染肝炎病毒（hbv）可导致慢性肝炎、肝硬化和肝肿瘤。目前尚无特效药物治疗,而乙肝疫苗的广泛应用可对乙肝病毒的流行起到非常重要的遏制作用。本文着重从免疫学方面阐述乙肝疫苗的近年研究进展以及未来研究方向。1乙肝病毒的一般介绍1.1hbv基因组中病毒编码及鉴定乙肝基因组的结构是不等长的双链DNA,长链为负链,短链为正链。HBV基因组中已确定的开放读框有4个,分别编码病毒的核壳(C)和包膜(S)蛋白,病毒复制酶(polymerase)及一种似乎与病毒基因表达有关的蛋白质X。1.2核心样dna的合成当HBV的DNA进入宿主细胞后,首先成为完整的闭环双螺旋DNA,以负链为模板合成全长的“+”链RNA(称为前基因组RNA)。该“+”链RNA被包装在未成熟的核心样颗粒中,同时还有DNA聚合酶和一种蛋白质也被包装在颗粒中。在该颗粒中,“+”链RNA作为模板由反转录酶催化合成“-”链DNA。“+”链DNA的合成便以该“-”链DNA为模板和一段RNA为引物而聚合延伸,核心样病毒颗粒在这个过程中也成为成熟的病毒颗粒。这时,正链DNA仍没有合成完毕,因而造成病毒基因组两条DNA链长度不一样。1.3细胞免疫和细胞复制作用HBV并不直接引起肝细胞的损伤,反而是机体的免疫病理反应是导致肝细胞损伤的主要因素。而免疫又分为细胞免疫和体液免疫。其中细胞免疫在去除病毒方面起到了重要作用。细胞免疫主要有三个方面:第一,由Th细胞分泌多种细胞因子,如白介素2(IL-2),通过促进T淋巴细胞(CTL)、自然杀伤细胞(NK)和巨噬细胞的活化和增殖来清除病毒;第二,CTL细胞内结构改变,分泌穿孔素、颗粒酶和淋巴毒素等直接杀伤靶细胞,或者CTL分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)降低病毒RNA的稳定性,溶解病毒壳膜,抑制病毒复制;第三,CTL表面表达FasL蛋白,通过Fas途径诱导细胞凋亡。1.4并发症的预防乙肝病毒感染后有三种可能:(1)急性肝炎;(2)重症肝炎,表现为急性肝坏死;(3)慢性肝炎或无症状携带者。其中急性肝炎可以基本上清除所有病毒并获得对乙肝病毒的免疫力。重症肝炎可因抗原抗体复合物沉积在肝脏血管而造成肝脏急性衰竭,死亡率高达90%。至于困扰医学界多年的顽症———慢性肝炎,其感染的危险性以新生儿最高。国外数据表明,对于母亲HBsAg阳性的婴儿,在围产期有90%可感染HBV。婴儿期感染后,90%以上经历40年的时间可演变成肝硬化,50年发展成肝癌,25%~40%可因之死亡。在中国约有10%的孕妇是HBV携带者,所生的婴儿中有60%在两年内可感染上HBV。2乙肝疫苗和dna疫苗1982年美国首先投入使用血源疫苗,随后,第二代乙肝疫苗——DNA重组疫苗在1986年产生,这两种疫苗都被证明是安全且有效的。1991年,WHO推荐,乙肝疫苗应该被规划入HBsAg阳性率高于8%的各国的全民免疫计划中。截至2002年,154个国家已经将乙肝疫苗列入婴儿的常规免疫中。上述两种乙肝疫苗尽管非常安全有效,但是还有它们的一些弱点,所以DNA疫苗是现在乙肝疫苗发展的一个新方向。传统的乙肝疫苗为蛋白疫苗,具有较强的免疫原性,可刺激机体产生高滴度的保护性抗体,但诱生的细胞免疫应答有限。DNA疫苗因其能诱生较强的特异性CD8+细胞应答,被考虑作为乙肝治疗性疫苗。2.1小颗粒表面抗原1981美国研制出血源性疫苗,采用无症状带毒者(HBsAg阳性)的血浆制备。血源性疫苗由于提取方法的不同,所得成分也会有所差别,但是均含有直径22nm的乙肝小颗粒表面抗原。血源性疫苗曾对控制乙肝流行起到很大的作用,但仍存在以下不足:(1)随着高危人群被免疫接种且病人多数不愿意提供血液而导致血源困难。(2)疫苗需经黑猩猩安全试验,成本高,且实验周期长达65周。(3)倘若灭活不彻底,有引起HIV和甲乙丙丁戊等肝炎传播的危险。所以血源性疫苗只能是一个过渡阶段。2.2多酚基因多肽疫苗又可分为预防性的多肽疫苗和治疗性的多肽疫苗,现在应用较广泛、技术较成熟的是预防性的多肽疫苗。2.2.1hbsag在细胞治疗中的作用预防性多肽疫苗的主要成分是HBsAg。这种疫苗是很有效的预防疫苗,但还是有以下缺点:(1)抗-HBs并不是严格意义上的中和抗体,这就是说即使抗-HBs与HBsAg形成免疫复合物,还是不能阻止HBV通过其他的有效结合位点与肝细胞结合。(2)HBsAg的免疫原性并不是很强,也就是促成抗体生成的能力比较弱。近年研究发现,pre-S1、pre-S2(即为与S蛋白同时表达在毒粒表面的前S1、前S2表面蛋白)的免疫原性很强,所以出现了加入pre-S1、pre-S2的疫苗,这种疫苗也可以被用来做治疗性疫苗。(3)由于HBsAg可以结合在单核巨噬细胞表面,并通过抑制内毒素(LPS)与抗原呈递细胞表面的TLR(tolllikereceptor)的结合来抑制它们的活化,从而阻止炎症反应的发生。这样就不能促进机体产生强烈的免疫反应。2.2.1.免疫、免疫药物的作用(1)疫苗的免疫原性不足,酵母和动物细胞不同来源的重组乙肝疫苗抗原由于表达系统不同、生产工艺不同及表面蛋白结构和糖基化程度不同,它们的免疫原性和免疫效果也不同。而且现有的乙肝疫苗大部分只含HBsAg,不如pre-S1和pre-S2的免疫原性强。(2)疫苗佐剂的不同也可引起免疫反应的不同。使用不同的佐剂能使乙肝疫苗具有不同的免疫效果。目前使用的乙肝疫苗基本上以氢氧化铝作为佐剂。铝佐剂能提高Th2型免疫反应,但不是对所有的人均有效,仍有部分人反应低下;铝佐剂又可抑制Th1型免疫反应而不利于阻断母婴传播。寡聚核苷酸(CpGODN)可与多种免疫细胞相作用,显示出强大的佐剂效应,并能显著提高抗体水平且效果与剂量成正比,与铝佐剂也有协同作用,能同时诱导较强的Th1和Th2型免疫反应。另外以IL-2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为佐剂也能大大提高效率。(3)过高剂量与过低剂量的疫苗都可引起T、B淋巴细胞免疫耐受而导致无或弱应答,而且过高剂量还可能增加不良反应。(4)不同接种途径产生的效果有明显不同。皮肤和肌肉内含有丰富的树突状细胞、淋巴细胞等免疫细胞,疫苗在皮内可停留较长时间,所以皮内注射可诱导较好的免疫应答。但皮内注射剂量小,一次只能注射0.1~0.2ml。所以一般认为肌肉注射效果比皮内注射好,但最近的研究发现,肌肉注射无应答者改用皮内注射后都可产生应答。(5)接种时间间隔和接种次数。追加针次可能使弱无应答者产生保护性抗体。(6)年龄、体重、性别等与机体免疫功能状态有一定联系。一般随着年龄的增长,乙肝疫苗的应答率逐渐下降。另外有研究发现,重度肥胖者无或弱应答的危险是体重正常者的13.3倍。不同性别对乙肝疫苗的应答也有差异,一般认为女性抗体阳转率和抗体滴度高于男性,但目前还不清楚原因。(7)低水平HBV感染者由于对HBsAg处于免疫耐受状态,因而对乙肝疫苗不应答。(8)主要组织相容性复合体(MHC)的多态性使MHC分子识别抗原时锚着位与锚着残基结合的部位和结合力也可能不同,造成个体间对同一抗原的应答有所差别。国内外研究表明,乙肝疫苗无或弱应答与HLA-DR7、HLA-DRB1、D3、A1、B44、B8、SC01的高携带相关,与HLA-DR2、A10、CW4的低携带有关。(9)某些疾病如营养不良、HIV感染、肠道蠕虫感染、使用免疫抑制剂、放射线治疗及嗜烟酒等造成的免疫功能损害,或者早产儿免疫系统未发育成熟,使免疫细胞和免疫分子活性降低、数量减少或比例失调,引起对乙肝疫苗无或弱应答的发生。2.2.1.抗体结合性突变免疫逃逸是指抗-HBs无法与血液中的病毒粒结合,不能起到“中和”作用。主要原因是HB-sAg的结构发生了改变,使已接种疫苗者体内已有的保护性抗-HBs无法识别新侵入的病毒,无法执行中和作用。此外还可能发生“诊断逃逸”,即已感染HBV病毒,但是检测HBsAg阴性,这时就需要进行检测HBVDNA。其具体机制:由于HBV的逆转录酶缺乏校正读码的功能,所以HBV呈现出比其他DNA病毒高十倍的突变率。实验研究表明,使用乙肝病毒免疫球蛋白(HBIG)治疗时,这种HBsAg突变体就会出现并逐渐成为优势病毒。而撤去HBIG后,这种突变体又回复到了野生型。并且核酸分析也显示这种突变并不是随机发生的,而是特定发生在抗体结合决定簇的部位。以上证据证实了这种突变是在免疫选择压力下发生的。图1表示的是病毒表面HBsAg的a结合位点。我们知道尽管HBV有不同的亚型,但是它们都有共同的a抗原决定簇,所以疫苗才可以对不同的亚型都有效。从图上可见,121~149位氨基酸就是抗-HBs结合的部位,由一大一小两个“a”环组成,突变大部分发生在第二个“a”环,也就是139~149的位置。而在第二个”a”环的氨基酸中,144、145是突变最为频繁的。那么,为什么在疫苗免疫压力下,病毒产生突变的频率会升高?一些研究表明,由于HBsAg疫苗引起的免疫反应要比自然病毒感染引起的反应具有局限性,如果是急性感染就会发生强烈的多克隆特异性CTL,慢性病人的CTL反应则比较弱,以HBsAg为主成分的乙肝疫苗也不能引起多克隆的CTL,所以才会使病毒在有限的免疫步骤和狭窄的免疫范围中找到生存之道。这也解释了为什么在自然感染的HBV病人中很少发现有病毒突变体,而对母亲HBV阳性的婴儿接种时发现病毒变异体出现,尤其是在抗体结合位点发生突变的频率大大增加。免疫逃逸的后果是比较严重的,如何评估HBsAg突变体带来的影响呢?有没有可能由于疫苗的大规模使用,导致在免疫压力下病毒突变体成为了优势病毒株呢?这需要考虑流行病学、病毒的感染力、致病力以及疫苗交叉免疫的程度等因素。Wilson提出了一个理论模型来预测病毒突变株的未来。如果突变株具有很强的免疫交叉性,那么现有的疫苗就可以控制,突变株就不能成为威胁,但是如果出现了最悲观的情况,也就是出现了交叉性为零的突变株,那么,由于疫苗广泛应用导致感染野生株的人群比例下降,这样为突变株占据主导地位开辟了道路。大概需要五十年,突变株可以占据主导地位。接种疫苗后还会有一个问题,那就是当抗体滴度下降后,还需要再次注射疫苗来维持滴度吗?欧共体提出以下观点:免疫完全的个体不需要在初次接种后再进行重复接种;在某些高危人群中,比如同性恋人群(MSM),可能需要重复接种来确保安全;对于免疫力低下的病人,当抗体滴度低于10mIU/ml时,推荐重复接种;对于首次接种弱或无应答者可以重复接种。但是也有国内外的意见认为还是需要重复接种的。2.2.2ctl诱导的检测病毒特异性的CTL不但可以阻止慢性病毒感染的建立,而且可以在慢性感染建立之后驱除病毒。所以长时间来科学家们致力于研究如何在体内诱导出CTL反应。研究首先在动物体展开,比较常用的是小鼠。2.2.2.肽类疫苗的突破点:以mhc类分子为例由于MHCⅠ类分子的结合槽是需要特定的蛋白序列的,所以可以通过扫描肽段文库来鉴定整个蛋白里面的MHCⅠ类分子结合部位,再通过免疫动物来检查这些表位的免疫原性。最后得出有三种不同的肽段表位:(1)不与MHCⅠ类分子结合的表位。(2)隐蔽表位,就是当以整个蛋白为抗原时,不能与MHCⅠ类分子结合,但是如果单纯以肽段形式为抗原时,就能与MHCⅠ类分子结合的表位。前两种表位对于疫苗研究没有意义。(3)能够被呈递的表位。这是对研究有意义的。这种有意义的表位包括主导表位和次主导表位。主导表位就是在蛋白表面大量高表达的表位。而且在CTL诱导反应中起主要作用,而次主导表位就是在APC表面呈递量较少,CTL诱导作用较弱的表位。由于慢性乙肝的病因是由于T细胞的弱反应和耐受,又由于次主导表位在肝细胞表面的表达量较少,引起免疫耐受的可能性也较小,这样寻找次主导表位来诱导CTL、打破免疫耐受成为研究肽类疫苗的一个突破点。但是还有两个问题有待解决,一是肽类表位能否紧密有效地与MHC分子结合,因为与HLA-A2的亲和力低于一定程度是不可能激发有效的CTL反应的。另一个问题是能否与MHC分子形成稳定的复合物而不被泛素蛋白酶途径降解。2.2.2.模型2:il-2和th-2对健康人群的作用CD4细胞除了诱导激活CD8细胞外还有其他的功能,比如在高滴度病毒感染时,能维持CD8细胞的浓度并防止其被耗尽,促使产生T记忆细胞。还有实验表明,接受疫苗的无CD4的小鼠受到的免疫保护远不如正常小鼠。这样就可以得到结论:包含有Th细胞结合表位对于诱导CTL反应是有益的。但是需不需要把这两个表位连接起来呢?实验证明,连接的两个表位比分别加入两个表位要有效。进一步的实验证明,加入IL-2和添加Th结合表位的效果一样,也就是说Th发挥作用主要通过分泌IL-2来增强CTL反应。随着对MHC认识研究的深入,人们能够通过体外扩展技术来测定健康人群的CTL前体细胞数量。然后就不断有人通过加入各种免疫佐剂和细胞因子来激发CTL反应,如上文中提到的CpGODN等。另外一种思路是有人发明了CY-1899,这是一个脂多肽,是将HBV核心抗原18-27与破伤风类毒素TT830-843模拟的Th细胞位点结合起来的疫苗,如果接种到正常人群中,引发的反应与直接感染病毒并清除干净的CTL反应一样,但是用来治疗慢性乙肝病人的效果并不好,因为测得CTL反应强度只有急性乙肝病人消退期的十分之一。还有使用比TT830-843的抗原性强1000倍的PARDE作为诱导Th反应的位点,能大大提高应答率。另外还有人使用HBsAg-HBIG的抗原抗体复合物作为疫苗,也取得了较好的效果,但是制作过程非常复杂。所以多肽疫苗的研究还在持续进行着。2.2.2.il-15在疫苗方面的作用疫苗诱导细胞免疫的机制,CD4+细胞通过识别APC的MHCⅡ分子与T辅助细胞结合,同时CD40和CD40L结合能够上调APC表达共刺激分子,如CD80/CD86,同时释放细胞因子IL-12和IL-15,共刺激分子可与CD8+细胞的表面受体CD28结合,提供CTL活化的第二信号。IL-12也可促进活化CTL和极化T助细胞向Th1方向分化,并促进Th1分泌IFNγ等细胞因子。IL-15能够诱导和维持CTL记忆细胞。至于调节性T细胞,如CD+25CD4+T细胞,由于它们可调控免疫,防止自身免疫和过度免疫反应的发生,因此也降低了疫苗的效果。我们可以提出一些针对多肽表位的策略来提高疫苗的效应:加入细胞因子,如IL-15(可强化T细胞记忆)、IL-12(可引导Th0细胞向Th1细胞分化);加入GM-CSF募集更多的DC细胞,或者通过表达更多共刺激配体(如CD40L)活化DC细胞;还可以利用含C-p-G的寡聚核苷酸刺激toll样受体9(TLR9)以活化DC细胞。或者从另一个方向考虑,我们可以封闭调节性T细胞释放或诱导的细胞因子如IL-13和TGF-β,或者封闭抑制性受体,如CTLA-4,使CTL的作用达到最强。2.3hbcag在免疫疫苗中的应用DNA疫苗的原理就是将质粒直接注射,通过宿主体细胞所含的启动子和增强子系统进行质粒DNA的调节表