生物技术制药-(全套课件234P)-课件

第一章绪论第一节生物技术制药的概念和内容一、生物技术制药的概念1、生物技术制药：是指利用生物系统或通过生物反应过程生产药物的技术。1医学资源第一章绪论第一节生物技术制药的概念和内容1医学资源2、生物技术制药学：是一门阐明生物药物的研制原理、生产工艺及其分离纯化技术的应用学科。现代生物技术制药学是医学、药学、生物学、化学、工程学与现代生物技术等相结合而形成的综合学科。现代生物技术包括：基因工程，细胞工程，酶工程，发酵工程，生化分离工程。

2医学资源2、生物技术制药学：是一门阐明生物药物的研制原理、生产工艺及3、生物药物：是指以生物资源为原料或以生物技术为手段开发生产的用作疾病的预防、诊断和治疗的医药品。4、生物新技术药物：是指采用基因工程技术、细胞工程技术、抗体工程技术以及其他生物新技术开发生产的重组蛋白质类、抗体类和核酸类药物。3医学资源3、生物药物：是指以生物资源为原料或以生物技术为手段开发生产二、生物技术制药的研究内容和

涉及的技术领域1、发酵工程制药是指利用微生物的代谢过程生产药物的技术。利用发酵工程生产的药物有：抗生素、维生素、氨基酸、核酸、有机酸、蛋白质和肽类、酶类、激素类和免疫调节剂类等。主要研究微生物优良菌种的选育、发酵工艺优化和产品的分离纯化等问题。

4医学资源二、生物技术制药的研究内容和

涉及的技术领域1、发酵工程制2、基因工程制药是指利用重组DNA技术改造生物物种的遗传物质结构，借助重组生物细胞以生产药物或预防、治疗疾病的综合技术。主要研究相应目的基因的分离、鉴定和克隆，基因重组载体的构建与导入，目的产物的表达及其分离纯化等问题。5医学资源2、基因工程制药是指利用重组DNA技术改造生物物种的遗传3、细胞工程制药在细胞和细胞器水平上对生物的遗传物质改造的基础上，利用动、植物细胞的大规模培养来生产药物的技术。可生产天然动、植物药物，疫苗，人类生理活性因子等重组DNA产品。主要研究动、植物细胞高产株系的选育、培养条件的优化、新型生物反应器的设计和应用以及产物的分离纯化等问题。6医学资源3、细胞工程制药在细胞和细胞器水平上对生物的遗传物质改4、酶工程制药是指利用游离或固定化的酶为催化剂生产药物的技术。作用：除能全程合成药物分子外，还能用于药物分子的转化。特点：生产工艺结构紧凑、专一性强，目的产物产量高、容易回收，酶可重复利用等特点。任务：主要研究酶的来源，酶的分离制备，酶的固定化，酶反应器及相应操作条件的优化等。7医学资源4、酶工程制药是指利用游离或固定化的酶为催化剂生产药物的5、生化工程制药是指利用生化分离技术从生物反应液或天然生物资源中提取分离制备药物的技术。主要研究药用生物资源的选择，药用成分的种类、含量及其分布，药物的结构、性质及其提取纯化工艺的优化。8医学资源5、生化工程制药是指利用生化分离技术从生物反应液或天然生作业：1、名词解释生物技术制药，生物药物，生物新技术药物2、生物技术制药涉及的技术领域

9医学资源作业：9医学资源第二节生物药物的性质与分类一、生物药物的性质1、药理学特性（1）治疗的针对性强，疗效可靠。治疗的生理、生化机制合理，如胰岛素治疗糖尿病。（2）药理活性高。是从大量原料中精制出的高活性物质。10医学资源第二节生物药物的性质与分类一、生物药物的性质10医学资源（3）毒副作用小，营养价值高。主要有蛋白质、核酸、糖类和脂类等。（4）生理副作用常有发生。生物间存在种属和个体差异，不同生物中活性物质结构有很大差异，常出现免疫反应、过敏反应。11医学资源（3）毒副作用小，营养价值高。11医学资源2、在生产、制备中的特性（1）有效物质含量低，杂质种类多且含量高。如：胰腺中胰岛素的含量仅为0.002%，生长激素抑制素（Somatostatin）在十万只羊的下丘脑中仅含有1mg。（2）稳定性差，易变性、易失活。生物药物以其严格的空间构象来维持其生物活性功能，具有特定的活性部位，一旦遭到破坏，就失去其药理作用。

12医学资源2、在生产、制备中的特性12医学资源（3）易腐败。

均为营养价值高的物质，极易染菌、腐败，从而造成有效物质被破坏、失去活性。（4）对环境条件敏感，生产条件的变化对产品质量的影响较大。（5）相对分子量较大（几千至几百万），组成分复杂，常以多组分存在，大多是复杂蛋白质的混合物。13医学资源（3）易腐败。13医学资源（6）用量少，价值高。（7）注射用药有特殊要求。生物药物易被肠道中的酶所分解，给药途径主要是注射用药。对药品制剂的均一性、安全性、稳定性、有效性等都有严格要求。14医学资源（6）用量少，价值高。14医学资源3、检验上的特殊性由于生物药物具有特殊的生理功能，因此生物药物不仅要有理化检验指标，更要有生物活性检验指标，这是生物药物生产开发的关键。15医学资源3、检验上的特殊性15医学资源二、生物药物的质量保证许多生物药物（细胞因子药物）都参与人体机能的精细调节，任何性质或数量上的偏差，都可能贻误病情甚至造成严重危害，因此必须进行严格的质量控制。生物药物的质量控制包括以下几项要点：产品的结构和性质鉴别，纯度、活性、安全性、稳定性和抑制性检验或试验。16医学资源二、生物药物的质量保证许多生物药物（细胞因子药物）都参与人体任何单一的分析方法都无法满足对该类产品的检测要求，需综合化学、生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多门学科的相关理论和技术。17医学资源任何单一的分析方法都无法满足对该类产品的检测要求，需综合化学1、鉴定方法（1）化学方法：生物药物结构、性质和纯度的鉴别常采用化学方法，包括元素分析、红外、紫外、核磁共振和质谱等方法。（2）生化和生物学方法欲确定生物大分子的分子质量、特定的空间立体结构和特定的生理功能还需要结合生化和生物学方法加以确定。包括电泳方法、受体结合试验、免疫学分析方法等。

18医学资源1、鉴定方法18医学资源2、安全性评价通过动物试验来鉴定其安全性。（1）一般安全性要求：无菌、无病毒、无热原、无致敏原等。（2）药代动力学和毒理学研究。（3）致突变、致癌和致畸等遗传毒理性质的考察。19医学资源2、安全性评价19医学资源三、生物药物的分类可按其原料来源、或按其生理功能和临床用途、或按其生物化学性质来分类。通常按其生物化学性质来分类。20医学资源三、生物药物的分类可按其原料来源、或按其生理功能和临床用途、（一）按所采用的技术手段来分1、生物技术药物指采用DNA重组技术、蛋白质工程技术、单克隆抗体技术等现代生物技术研制的重组蛋白质类、抗体类和核酸类药物。21医学资源（一）按所采用的技术手段来分1、生物技术药物21医学资源（1）重组蛋白质类①细胞因子类：包括干扰素（INF）类、白细胞介素(IL)类、集落刺激因子(CSF)类、生长因子(GF)类、肿瘤坏死因子（TNF）类。②激素类：生长激素、胰岛素等。③治疗心脑血管病的活性蛋白质类：包括溶解血栓类、血凝因子类。22医学资源（1）重组蛋白质类22医学资源④治疗和营养神经的活性蛋白质类：包括神经生长因子、神经营养因子、神经营养素等。⑤可溶性细胞因子受体类：包括IL1受体、IL4受体、TNF受体等。⑥导向毒素类：包括IL2导向毒素、IL4导向毒素、单克隆抗体导向毒素等。23医学资源④治疗和营养神经的活性蛋白质类：包括神经生长因子、神经营养因（2）抗体药物由分化的B淋巴细胞产生的能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。（3）核酸药物（基因药物）分为反义核酸、核酶、脱氧核酶、抗基因寡核苷酸和基因疫苗与基因药物。多用于有害基因的诊断与治疗，阻断有害基因的表达。24医学资源（2）抗体药物24医学资源2、天然生化药物采用生化分离技术直接从动物、植物、微生物和海洋生物中分离提取制备的天然药物。25医学资源2、天然生化药物25医学资源3、微生物药物利用微生物发酵工程技术生产的药物。4、合成与部分合成的生物药物根据天然药物的结构，采用化学合成技术开发生产的药物。26医学资源3、微生物药物26医学资源（二）按功能和用途来分1、治疗药物用于疾病的治疗（疑难病、多发病），如糖尿病、免疫缺陷病、心脑血管病、肿瘤等。2、预防药物用于传染病的预防，包括各种疫苗、菌苗和类毒素等。27医学资源（二）按功能和用途来分1、治疗药物27医学资源3、诊断药物用于疾病的临床诊断。包括免疫诊断试剂、酶诊断试剂、抗体诊断试剂、基因诊断药物和放射性诊断药物等。28医学资源3、诊断药物28医学资源（三）按药物的化学本质和生物化学性质来分类1、氨基酸及其衍生物类谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、N-乙酰半胱氨酸、L-二羟基苯丙氨酸等20多种氨基酸及其衍生物，全世界总产量达数百万吨。2、有机酸类乙酸、乳酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸、葡萄糖酸、2-酮葡萄糖酸、D-异抗坏血酸、丙酮酸等。29医学资源（三）按药物的化学本质和生物化学性质来分类1、氨基酸及其衍生3、酮醇类乙醇、丙醇、丁醇、甘油等。4、维生素类维生素B2、维生素B12、β-胡萝卜素、维生素C和维生素D的前体麦角醇等。30医学资源3、酮醇类30医学资源5、酶及辅酶类（1）酶类药物①消化酶类：胰酶、胃蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。②消炎酶类：溶菌酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶等。③心血管疾病治疗酶：弹性蛋白酶、激肽释放酶（扩张血管、降血压）、尿激酶、纤溶酶、溶栓酶等。④抗肿瘤酶：L-天冬氨酸酶（治疗淋巴瘤和白血病）、谷氨酰胺酶、蛋氨酸酶、组氨酸酶等。

31医学资源5、酶及辅酶类31医学资源⑤其他酶类SOD：清除自由基、抗衰老，治疗类风湿关节炎和放射病。PEG-腺苷脱氨酶：治疗联合免疫缺陷症。RNA酶：用于抗RNA病毒。青霉素酶：治疗青霉素过敏。32医学资源⑤其他酶类32医学资源（2）辅酶类NAD，NADP（辅酶Ⅱ），FMN（黄素单核苷酸），FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸），辅酶Q10，辅酶A等。33医学资源（2）辅酶类33医学资源6、脂类（1）磷脂类：卵磷脂、脑磷脂，用于治疗肝病、冠心病和神经衰弱。（2）多价不饱和脂肪酸（PUFA）和前列腺素（PGI2）PUFA：有亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸，用于降血脂、降血压和抗脂肪肝。PGI2：抗血栓、抗动脉粥样硬化。34医学资源6、脂类34医学资源（3）胆酸类：去氧胆酸（治疗胆囊炎），鹅去氧胆酸（溶胆结石、降低血胆固醇）。（4）固醇类：胆固醇（用于生产人工牛黄），麦角固醇，β-谷固醇（降低血胆固醇）（5）卟啉类：血红素，胆红素等（用于治疗肝炎和肿瘤的诊断）35医学资源（3）胆酸类：去氧胆酸（治疗胆囊炎），鹅去氧胆酸（溶胆结石、7、多肽和蛋白质类该类药物多是人体内的生理活性因子，包括激素、免疫调节剂和细胞生长因子等。该类药物分子量不同、性质差异较大。目前已用于临床的有19种，即将上市的有20多种。36医学资源7、多肽和蛋白质类36医学资源（1）蛋白质类：有血清白蛋白、丙种球蛋白和胰岛素等。（2）多肽类：有激素和免疫调节剂等。37医学资源（1）蛋白质类：有血清白蛋白、丙种球蛋白和胰岛素等。37医学（3）细胞生长因子类：动物细胞分泌的具有多种生物活性的因子，对人类和动物细胞的生长与分化有重要调节作用。有干扰素（IFN）、白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）等四大类系列数十种细胞因子。如白细胞介素-2（IL-2）用于治疗肾细胞癌，即将上市的有IL-3、IL-6等。α-2a干扰素、α-2b干扰素用于治疗毛细胞性白血病，即将上市的有α-干扰素N3、β-1b干扰素、γ-干扰素和γ-1b干扰素等。38医学资源（3）细胞生长因子类：动物细胞分泌的具有多种生物活性的因子，8、核酸类及其降解物和衍生物类（1）核酸类：从牛、猪的肝脏中提取的RNA用于肝癌、肝硬化的治疗。免疫RNA（iRNA）用于肿瘤的免疫治疗。（2）多聚核苷酸：聚肌苷酸和巯基聚胞苷酸用于抗病毒、抗肿瘤。（3）核苷、核苷酸及其衍生物：ATP、CTP、cAMP、CDP-胆碱等，可将它们经化学修饰后用于治疗肿瘤和抗病毒。39医学资源8、核酸类及其降解物和衍生物类39医学资源9、糖类活性多糖有抗凝血、降血脂、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫功能、升高白细胞和抗炎等作用。有银耳多糖、灵芝多糖、茯苓多糖、香菇多糖、肝素、透明质酸、壳聚糖、刺参多糖等。40医学资源9、糖类40医学资源10、生物制品类指从微生物、原虫、动物或人体材料直接制备或用现代生物技术、化学方法制成的作为预防、治疗和诊断特定传染病或其他疾病的制剂。生物制品用于各种传染病的诊断、预防和治疗，包括各种疫苗、菌苗和类毒素。41医学资源10、生物制品类41医学资源作业：1、阐述生物药物的特性。2、阐述生物药物的质量保证措施。42医学资源作业：42医学资源第二章基因工程制药第一节基因工程制药概述一、基因工程的概念基因工程（Geneengineering）又称DNA重组技术（DNArecombinationtechnology）：是指按人的意志，将某一生物体（供体）的遗传信息（目的基因）在体外经人工与载体DNA重组，构成重组DNA，然后转入到另一生物体（受体）细胞中，使被引入的外源DNA片段（目的基因）在受体细胞内得以表达和遗传。基因工程是能人工定向改造生物遗传性状的育种新技术。

43医学资源第二章基因工程制药第一节基因工程制药概述43医学资源二、基因工程技术的优点1、它能从极其复杂的各种生物细胞内获得所需的目的基因，并将此目的基因在体外进行剪切、拼接、重组，并转入到受体细胞中，从而合成出人们所需的新产物。2、它能使带有各种各样遗传信息的DNA片段越过不同生物物种间特异的细胞壁而转入到完全不同的生物体内，定向地控制、修饰和改变受体的遗传和变异，从而创造出自然界所未有的具有新的遗传性状的生物新种，并增产出数百数千倍人们所需的生物新药。44医学资源二、基因工程技术的优点44医学资源三、在生物技术体系中的作用基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和生化工程是组成生物技术的主体，它们是相互依赖、相辅相成的。在这些技术体系中基因工程起着主导作用，因为只有用基因工程改造过的生物细胞，才能赋予其他技术以新的生命力。生物药物1997年在国际市场销售额有260亿美元，有50多种投放市场，正在临床试验的有200多种，其中有100多种很快上市。45医学资源三、在生物技术体系中的作用45医学资源第二节基因工程常用的工具酶和克隆载体一、基因工程制药中常用的工具酶基因工程的重要特点之一是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。例如：要获得所需药物的目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在一起，在很大程度上依赖于某些工具酶。因此，基因工程要得以实施，首先要为体外操作DNA分子提供一系列的工具酶。46医学资源第二节基因工程常用的工具酶和克隆载体一、基因工程制药中常其中最重要的是能接一定的核苷酸序列切断DNA分子的限制酶，并能把两种DNA片段连接起来的DNA连接酶。随着越来越多的酶分子被人们发现，这类工具酶的数量和用途不断增加，许多厂商已能生产并广泛供应各种优质工具酶，这不仅大大简化了分子克隆的操作，而且拓宽了基因工程的研究领域。47医学资源其中最重要的是能接一定的核苷酸序列切断DNA分子的限制酶，并（一）限制酶（Restrictionenzymes）限制性核酸内切酶，是一类专一性很强的核酸内切酶，专一地识别和作用于DNA分子上特定的核苷酸序列，切断DNA双链。对DNA分子上特定核苷酸序列和碱基作用的专一性，以及对磷酸二酯键断裂方式上的特殊性。48医学资源（一）限制酶（Restrictionenzymes）48医1、限制酶的种类（1）Ⅰ型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上应用价值不大。49医学资源1、限制酶的种类49医学资源（2）Ⅱ型酶：相对分子量较小，2万～10万，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2+。特点：能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。自20世纪70年代以来，从几乎所有细菌的属、种中都发现至少一种Ⅱ型限制酶，同一品系的菌株中也常有识别不同序列的两种酶。至今已发现和分离成功的Ⅱ型酶大约有500种，其中有些已商品化。50医学资源（2）Ⅱ型酶：相对分子量较小，2万～10万，是简单的单功能酶2、限制酶的命名是以寄主微生物属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）写成斜体字的3个字母的缩写，菌株名的第一个字母以非斜体加在这三个字母的后面。若同一菌株里有几种不同的限制酶时，则以罗马数字加以区分。例：HindⅢ限制酶是从流感嗜血杆菌菌株Haemophilus

influenzaed中分离出来的第三种限制酶。EcoRⅠ表示从大肠埃氏菌菌株RYB中分离出来的第一种限制酶。51医学资源2、限制酶的命名51医学资源属名种名菌株名Haemophilus

influenzae

嗜血流感杆菌株d

HindIII同一菌株中分离出的第三个限制性核酸内切酶52医学资源属名种名3、限制酶的特性（1）不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列（核苷酸序列不同，序列大小不同）EcoRⅠ：5‵-GAATTC-3‵HaeⅠ:5‵-(A/T)GGCC(A/T)-3‵AsuⅠ:5‵-GGNCC-3‵EcoRⅡ：5‵-CC(A/T)GG-3‵MboⅠ：5‵-GATC-3‵53医学资源3、限制酶的特性53医学资源（2）各种限制酶的识别序列都具有回文结构限制酶所识别序列的两条核苷酸链中的碱基排列次序是完全相同的，即正读与反读都相同，这种结构称回文结构（Palidromicstructure）。例：BamHⅠ的识别序列：5‵-GGATCC-3‵3‵-CCTAGG-5‵54医学资源（2）各种限制酶的识别序列都具有回文结构54医学资源EcoRⅠ的识别序列：(EcoRⅠ的切割位点)5‘-GCT

GAATTC

GAG-3’3‘-CGA

CTTAAG

CTC-5’(EcoRⅠ的切割位点)55医学资源EcoRⅠ的识别序列：(EcoRⅠ的切割位点)5‘（3）各种限制酶的切割类型是各式各样的，切后形成各种粘性或平整末端。①一种是限制酶错位切断DNA双链而形成彼此互补的单链末端，称粘性末端（Cohesiveends）如限制酶EcoRⅠ（大多限制酶都是这种切割方式）：5‵-G↓AATTC-3‵→5‵-GAATTC-3‵3‵-CTTAA↑G-5‵3‵-CTTAAG-5‵这种具有粘性末端的DNA片段很容易通过单链区的碱基配对而连接在一起，产生线状或环状DNA分子。56医学资源（3）各种限制酶的切割类型是各式各样的，切后形成各种粘性或平EcoRⅠ产生的5´粘性末端5’-G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G-3’3’-C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C-5’EcoRI37℃5‘-G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G-3’3‘-C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C

-5’

57医学资源EcoRⅠ产生的5´粘性末端5’-G-C-T-G-A-Pst

Ⅰ产生的3‘粘性末端5‘--G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C--5’Pst

Ⅰ37℃5‘--G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C--5’

58医学资源PstⅠ产生的3‘粘性末端5‘--G-C-T-C-T②另一种是限制酶在同一位点平齐切断DNA两条链而形成的双链末端，称为平整末端（Flushends）。如限制酶AluⅠ：5‵-AG↓CT-3‵→5‵-AGCT-3‵3‵-TC↑GA-5‵3‵-TCGA-5‵59医学资源②另一种是限制酶在同一位点平齐切断DNA两条链而形成的双链末PvuII产生的平整末端5‘--

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C--5’PvuII37℃5‘--G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C--5’

60医学资源PvuII产生的平整末端5‘--G-C-T-C-A-根据限制酶的识别序列和切点位置，还可以发现下面两种情况：①识别序列不同的限制酶，切割后有可能产生相同的粘性末端：BamHⅠ:5‵-G↓GATCC-3‵→5‵-G5‵-GATCC-3‵3‵-CCTAG↑G-5‵3‵-CCTAG-5‵G-5‵BglⅡ：5‵-A↓GATCT-3‵→5‵-A5‵-GATCT-3‵3‵-TCTAG↑A-5‵3‵-TCTAG-5‵A-5‵MboⅠ：5‵-↓GATC-3‵→5‵-GATC-3‵3‵-CTAG↑-5‵3‵-CTAG-5‵61医学资源根据限制酶的识别序列和切点位置，还可以发现下面两种情况：61以上三种限制酶识别不同的核苷酸序列，但切割后产生相同的5‵-GATC粘性末端。像这样一类限制酶称同切口限制酶或同裂酶。这类酶的DNA酶解片段都可在体外互相重组，在DNA连接酶作用下，可以得到嵌合的重组DNA，称为异源二聚体。这种二聚体不再能被原来的两种限制酶所识别，有利于得到大量重组DNA分子。

62医学资源以上三种限制酶识别不同的核苷酸序列，但切割后产生相同的5‵-②来源不同的限制酶其识别序列相同，但由于其切点位置不同，因而产生的切割末端不同。例：XmzⅠ:5‵-C↓CCGGG-3‵→5‵-C5‵-CCGGG-3‵3‵-GGGCC↑C-5‵3‵-GGGCCC-5‵

SmaⅠ:5‵-CCC↓GGG-3‵→5‵-CCC-3‵5‵-GGG-3‵3‵-GGG↑CCC-5‵3‵-GGG-5‵3‵-CCC-5‵

63医学资源②来源不同的限制酶其识别序列相同，但由于其切点位置不同，因而（4）在标准条件下，每种限制酶都有严格的识别序列。某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识别序列特异性发生改变，会严重干扰限制酶在DNA重组中的正常应用。因此，所有限制酶反应都应在标准条件下进行。特别要控制pH值、离子强度、二价离子浓度等反应条件。64医学资源（4）在标准条件下，每种限制酶都有严格的识别序列。64医学资在甘油浓度、离子强度、pH值、有机溶剂、二价阳离子浓度、酶与DNA的比例等参数单独或同时发生改变的非标准条件下，会导致限制酶识别序列的特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称限制酶的第2活性或星活性。产生第2活性的酶常在酶名称的右上角加星号“*”。例：EcoRⅠ:5‵-GAATTC-3‵EcoRⅠ*:5‵-AATT-3‵65医学资源在甘油浓度、离子强度、pH值、有机溶剂、二价阳离子浓度、酶与（二）DNA连接酶能将两段DNA拼接起来的酶叫DNA连接酶。这类酶的发现和分离纯化，使两个DNA片段在体外连接形成重组DNA分子成为可能。66医学资源（二）DNA连接酶66医学资源DNA连接酶的作用催化DNA5‵磷酸和3‵羟基之间形成磷酸二脂键5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5‘…

G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPnickPOHnickDNA连接酶67医学资源DNA连接酶的作用催化DNA5‵磷酸和3‵羟基之间形成1、T4噬菌体DNA连接酶来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，分子量68000u，催化DNA5‵磷酸和3‵羟基之间形成磷酸二脂键。（1）连接带有匹配粘性末端的双链DNA分子，也可连接带切口的DNA。在PEG低浓度下可促进DNA分子间的连接。（2）连接平整末端的双链DNA分子，反应速率要比上述粘性末端连接慢得多。但在单价阳离子和低浓度PEG存在的条件下可大大提高平整末端连接的速率。68医学资源1、T4噬菌体DNA连接酶68医学资源T4-DNA连接酶催化粘性末端的连接5’-G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G-3’3’-C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C-5’T4-DNA连接酶5‘-G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G-3’3‘-C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C

-5’

69医学资源T4-DNA连接酶催化粘性末端的连接5’-G-C-T-GT4-DNA连接酶催化平整末端的连接5‘--

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C--5’T4-DNA连接酶5‘--G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C--5’

PEG70医学资源T4-DNA连接酶催化平整末端的连接5‘--G-C-T-2、大肠杆菌DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶可催化互相匹配的粘性末端的5‵突出端与3‵末端的双链DNA之间形成磷酸二酯键，但需NAD作辅助因子。该酶一般不能催化平整末端双链DNA间的连接，但在PEG或Ficoll(聚蔗糖)存在下也能催化平整末端连接。71医学资源2、大肠杆菌DNA连接酶71医学资源（三）DNA聚合酶（DNApolymerase）是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶。在基因工程操作中用于DNA的体外合成反应。这类酶作用时大多需要DNA模板并优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。另有一种聚合酶，即反转录酶，是依赖于RNA的DNA聚合酶，可优先拷贝RNA。72医学资源（三）DNA聚合酶（DNApolymerase）72医学资1、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ分子量109000u，由一条多肽链组成，约有1000个氨基酸，酶分子中含有一个双硫键和一个巯基，还含锌离子，基本是一个椭圆形的结构，是一种多功能酶。73医学资源1、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ73医学资源（1）该酶具有三种活力：①5‵→3‵聚合酶活力：底物为单链DNA模板及带3‵羟基的DNA引物，聚合脱氧核苷酸，使之逐个接到引物上。②5‵→3‵外切酶活力：底物是双链DNA或RNA﹕DNA的杂交体，从5‵端降解DNA或RNA。③3‵→5‵外切核酸酶活力：底物是带有3‵羟基端的双链DNA或单链DNA，从3‵羟基端逐个切除核苷酸降解DNA。5‵—GATTCGTAACGGTA-OH-3‵3‵—CTAAGCATTGCCAT—5‵74医学资源（1）该酶具有三种活力：74医学资源大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用5‘→3‘的DNA聚合酶活性3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OHDNA聚合酶Ⅰ5‘pppdNMg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH75医学资源大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用5‘→3‘的DNA聚合酶活性3（2）该酶主要用途是采用切口平移法，以放射性脱氧核苷酸置换原来的dNTP标记DNA，从而制作DNA探针。此外，用于修补DNA缺损部位的空隙。5‵-GATT-3‵5‵-CGTAACGCCA-3‵3‵-CTAAGCATTGAGCATTGCGGT-5‵5‵-GATTCGTAACTCG-3‵5‵-CA-3‵3‵-CTAAGCATTGAGCATTGCGGT-5‵76医学资源（2）该酶主要用途是采用切口平移法，以放射性脱氧核苷酸置换原2、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）Klenow酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶。Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。77医学资源2、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）KleKlenow酶的基本作用：补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列78医学资源Klenow酶的基本作用：补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端Klenow酶的作用一补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端

5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’

KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C

…5’

79医学资源Klenow酶的作用一补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端Klenow酶的作用二

DNA片段的同位素末端标记5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C

…5’

Klenowa-32P-pppdN5‘…

G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G

…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’

80医学资源Klenow酶的作用二5‘…G-C-T-G-OH3、TaqDNA聚合酶是从极度嗜热的水生栖热菌（Thermasaquaticus）中分离纯化而来的，是一种耐热的聚合酶，分子量6500u。目前生产并出售的是AmpliTaqTMDNA聚合酶。该酶具有5‵→3‵聚合酶活力和依赖于聚合作用的5‵→3‵外切酶活力。该酶最佳作用温度75~80℃，为避免引物在模板上解离，往往要在低于最适温度条件下起始聚合反应。该酶可用于对DNA进行测序，但主要用于PCR（聚合酶链式反应），对DNA分子的特定序列（目的基因）进行体外扩增。81医学资源3、TaqDNA聚合酶81医学资源4、T4噬菌体DNA聚合酶来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，具有5‵→3‵聚合酶活力和3‵→5‵外切酶活力。作用：①补平和标记限制酶消化DNA后产生的3‵凹端。5‵-G-3‵5‵-GGATC-3‵3‵-CCTAG-5‵3‵-CCTAG-5‵②对带有3‵突出端的DNA分子进行末端标记。③标记用作探针的DNA片段。④将双链DNA末端转化成平端。82医学资源4、T4噬菌体DNA聚合酶82医学资源T4-DNA聚合酶的作用一切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G

…3’3‘

…

C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’T4-DNA聚合酶5‘

…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘

…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C

…5’83医学资源T4-DNA聚合酶的作用一5‘…G-C-T-C-T-T4-DNA聚合酶的作用二

DNA片段的同位素末端标记5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApol5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OH

HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘

T4-DNApolMg2+

a-32P-dNTP5‘

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘

84医学资源T4-DNA聚合酶的作用二5‘G-C-T-C-A-G-C5、经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶）来源于T7噬菌体感染的大肠杆菌，具有较强的持续的5‵→3‵聚合酶活力和3‵→5‵外切酶活力。它所催化合成的DNA平均长度要比其他DNA聚合酶大得多，可用于长段模板上引物的延伸反应。经化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶商品名为测序酶，去除了3‵→5‵外切酶活力，保持了5‵→3‵聚合酶活力，它的持续合成能力很强。主要用于Sanger双脱氧末端终止法对长段DNA分子的测序。现又用基因工程手段生产出一种改进的测序酶2.0版，完全丧失了外切酶活力。

85医学资源5、经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶）85医学资源6、反转录酶该酶为依赖于RNA的DNA聚合酶，来源于鼠或禽反转录病毒。该酶主要以mRNA为模板转录合成互补双链cDNA，也可用于制备杂交用探针和标记带5‵突出端的DNA片段。86医学资源6、反转录酶86医学资源反转录酶的作用一以mRNA为模板反转录合成cDNA链3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-18反转录酶Mg2+dNTP3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTT3’cDNA87医学资源反转录酶的作用一以mRNA为模板反转录合成cDNA链反转录酶的作用二双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链3’RNA5’DNA3’5’反转录酶3’RNA5’DNA3’5’反转录酶5’DNA3’88医学资源反转录酶的作用二3’RNA5’DNA3’5’反转录酶（四）核酸酶1、单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）核酸外切酶VII双向外切DNA单链5’3’5’3’ExoVII5’5’3’3’89医学资源（四）核酸酶1、单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVI2、双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）核酸外切酶III特异性地从3‘端外切双链DNA5’3’3’5’ExoIIIMg2+5’5’3’3’90医学资源2、双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）核酸外3、双链核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo）l核酸外切酶特异性地从5‘端外切双链DNA5’3’3’5’lExoMg2+3’3’5’5’91医学资源3、双链核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo）l核酸外4、单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍反应必需有Zn2+最适pH范围为4.0-4.3需要NaCl10-300mMol降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍92医学资源4、单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性降解S1核酸酶的基本反应一内切单链DNA或RNA，产生带5‘磷酸的单核苷酸。5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或5‘NMPs93医学资源S1核酸酶的基本反应一5‘…G-C-T-C-A-G-C-S1核酸酶的基本反应二内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘

nick5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-CA-C-C-T-C-A…5‘

gapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘

94医学资源S1核酸酶的基本反应二5‘…G-C-T-C-A-G5、单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶主要是3‘核酸外切酶活力，同时也具有DNA内切酶活力。可从线状DNA两条链的3‘端迅速去除单核苷酸，随后在形成的互补单链上进行缓慢的内切酶降解。DNAorRNABal315‘dNMPs或5‘NMPsBal31Bal3195医学资源5、单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶主要是3（五）核酸修饰酶1、末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）TdT的基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs。作用底物：带3‘OH的单链DNA或双链DNA。5‘pOH3‘

3‘HOp5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOp5‘

AAAAAAAAAAAA

OH3‘

96医学资源（五）核酸修饰酶1、末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）TdTdT的基本作用：5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+,

dATP5‘pp5‘

AAAAAAAAAA

OH3‘

3‘HO

AAAAAAAAAAA5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+,

dATP5‘pp5‘

AAAAAAAAAA

OH3‘

3‘HO

AAAAAAAAAAA97医学资源TdT的基本作用：5‘p3‘HOOH3‘p5‘2、碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）,特异性强；来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP），耐热；作用：催化去除单链或双链DNA或RNA分子中的5‘p，即脱磷酸作用，防止DNA片段自身环化。DNAorRNA5‘pOH3‘

5‘HOOH3‘

5‘pppdN5‘pppNBAP

/CIP5‘HOdN5‘HON98医学资源2、碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP3、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本作用：在DNA、RNA的5‘-OH上加磷酸用于DNA探针的末端同位素标记。5‘HO3‘HOOH3‘

OH5‘

T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）OH3‘

3‘HO5‘

pp

5‘

99医学资源3、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的二、基因工程常用的克隆载体基因工程的一个重要环节是目的基因转运载体（Vector）之设计和运用。因为目的基因（外源DNA）一般难以进入不同种属的宿主细胞中，即使能单独进入也不能进行复制增殖和表达，它必须与具有自我复制能力的DNA载体共价结合后才能被复制和表达。100医学资源二、基因工程常用的克隆载体基因工程的一个重要环节是目的基因这种在细胞内具有能进行自我复制的独立DNA分子作为外源DNA片段的运载体，简称基因载体，又称分子克隆载体或无性繁殖载体。功能特点：①能自行自我复制。②容易导入宿主细胞。101医学资源这种在细胞内具有能进行自我复制的独立DNA分子作为外源DNA（一）基因载体的特性理想的基因载体应具备以下特性：①要有复制子（Replicom）功能，且复制起始区中没有限制酶的酶切位点。②要含有强启动子，要有能促进外源DNA高水平表达的调控区。③要有多种限制酶的单一切点，以适用于多种限制酶产生的DNA片段的插入。④具有两种以上易被检测的选择性遗传标记，作为对重组与非重组转化体的选择标记。102医学资源（一）基因载体的特性102医学资源⑤载体DNA的分子量要尽可能小，以利于容纳较长区段的外源DNA片段。⑥应属于松弛型复制，能在氯霉素存在下扩增其拷贝数。⑦从安全防治考虑，载体应为非传递性，有较小的宿主范围，不为传递性载体所诱导。103医学资源⑤载体DNA的分子量要尽可能小，以利于容纳较长区段的外源DN要达到上述要求，必须对天然存在的原始载体进行改造并构建成理想的载体：①引入强启动子。②引入选择性标记基因。③切除大部分多余序列段，以提高容纳外源DNA片段的能力。④引入由多种限制酶单一识别序列组成的多克隆位点。⑤引入多种用途的辅助序列。104医学资源要达到上述要求，必须对天然存在的原始载体进行改造并构建成理想（二）常用的基因载体1、质粒载体质粒（Plasnid）是一些存在于微生物细胞内染色体外的闭合环状双链的小型DNA分子，是能进行独立复制并保持恒定遗传的辅助性遗传单位，是基因工程一类主要的分子克隆载体。105医学资源（二）常用的基因载体105医学资源（1）pBR322

分子量2.6×106u，4.36kb。①由pMBI改造而成，引入了Tetr(抗四环素)和Ampr(抗氨苄青霉素)两个抗药标记基因，去除了大部分非必须的序列，大小仅4.36kb。该质粒有32个限制酶切位点，Tetr内有BamAⅠ等10个酶切位点，Ampr基因内有Pst

Ⅰ等6个限制酶切位点，十分有利于检出重组转化子。pBR322质粒上从复制起点到Tetr基因间还有一个较长的非必须区域，分子量相对较大。

106医学资源（1）pBR322106医学资源②pAT153载体：在1644~2349位点之间切除了HaeⅡ片段，去除了705bp，包含接合转移的有关序列。③pBR327载体：切除了1442~2502非必须区段而成，长仅3.27kb，拷贝数增加2~4倍107医学资源②pAT153载体：在1644~2349位点之间切除了Hae（2）、PUC系列载体①PUC18、PUC19质粒载体，是2.7kb的小型载体。含有Ampr(抗氨苄青霉素)基因，复制原点和LacZ基因。在LacZ基因内有多种限制酶识别位点组成的多克隆位点。在相应的宿主（LacZ–）中可出现α互补（合成β-半乳糖苷酶）。108医学资源（2）、PUC系列载体108医学资源pUC质粒载体

(1)来自pBR322质粒的复制起点(ori)；(2)氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点。(3)大肠杆菌β-半乳糖苷酶的启动子以及编码该酶氨基端α-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ基因。(4)多克隆位点(MCS)区段：位于lacZ基因中的靠近5’端，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入载体中。109医学资源pUC质粒载体(1)来自pBR322质粒的复制起点(or②PUC118、PUC119分别来自PUC18、PUC19，不同的是它们均带有M13丝状噬菌体DNA合成的起始、终止及DNA包装进入噬菌体颗粒所必需的序列。110医学资源②PUC118、PUC119110医学资源2、λ噬菌体载体人们对λ噬菌体已进行了长达几十年的研究，发现其DNA失去占总量20%的序列时仍不失活，这部分缺失的DNA空间正好可作为运载外源DNA之用。λ噬菌体基因组为双链线状DNA，分子量30.8×106u，具有4.85kb，含有50个基因，其中只有50%是必需的。经改造，消除基因组必需区域中多余的限制酶切位点，去除λDNA中一些非必需区段。111医学资源2、λ噬菌体载体111医学资源①插入型载体：λDNA中缺失部分为非必需区段，只有一个可供外源DNA插入的限制酶切位点（单切位点）。②替换型载体：在λDNA可替换片段的两端具有两个限制酶切位点，酶切后的替换片段，由外源DNA片段所取代。112医学资源①插入型载体：λDNA中缺失部分为非必需区段，只有一个可供外3、M13噬菌体载体该载体引入有LacZ基因，该基因内有13个不同酶切位点组成的多克隆位点，可供插入多种酶切的DNA片段。可与宿主（LacZ–）形成α互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶。但当在多克隆位点插入外源DNA时，α互补消失。113医学资源3、M13噬菌体载体113医学资源4、粘粒（Cosmid）是一种有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由λDNA的cos区段与质粒DNA重组构建而成。cos序列：将DNA包装到λ噬菌体颗粒的必需序列。粘粒是为克隆和增殖较大区段的基因组DNA而设计的，是组建真核生物基因文库和从多种生物中分离基因的有效手段。114医学资源4、粘粒（Cosmid）114医学资源粘粒大小为4~7kb，常用的为5kb。噬菌体颗粒容纳的最大DNA达52kb，所以粘粒可克隆大小为35~45kb的DNA片段。粘粒由质粒改造而来，通常带有1个拷贝的cosDNA序列，1个复制起点和1个抗药标记基因（Ampr）。115医学资源粘粒大小为4~7kb，常用的为5kb。噬菌体颗粒容纳的最大D5、动植物病毒用于克隆外源基因，导入动植物细胞为宿主细胞。116医学资源5、动植物病毒116医学资源作业：1、名词解释基因工程，限制酶，连接酶，同裂酶，限制酶星活性，基因载体，粘粒。2、基因工程技术的优点。3、限制酶有哪些特性？4、TaqDNA聚合酶有哪些特性和用途？5、基因载体有哪些特性？6、如何将天然的原始载体改造成理想的基因载体？117医学资源作业：117医学资源第三节基因工程药物生产的基本过程基因工程技术制药的基本过程：①目的基因的制取a、从供体生物分离纯化获得含目的基因的DNA。b、供体DNA分子的酶切、目的基因的鉴别和分离。118医学资源第三节基因工程药物生产的基本过程基因工程技术制药的基本过②目的基因与克隆载体的体外重组，构建重组克隆载体。用限制性内切酶和连接酶将目的基因拼接到适当的质粒载体或噬菌体载体中。③重组克隆载体导入宿主细胞的转化与转导，构建成基因工程细胞株。④含目的基因的工程细胞株的筛选、鉴定与分析。119医学资源②目的基因与克隆载体的体外重组，构建重组克隆载体。119医学⑤目的基因在宿主细胞中的高效表达。包括：工程细胞株大规模培养最佳参数的确定，新型生物反应器的研制与应用，生物传感器等一系列仪表的设计与应用，应用计算机对发酵过程进行优化控制等。⑥产物的分离纯化高效分离介质及装置的开发，分离纯化工艺的选择与优化控制以及高纯度产品的制备技术。⑦产品的检验及安全性评价120医学资源⑤目的基因在宿主细胞中的高效表达。120医学资源一、目的基因的制取一种细菌DNA上有数千个基因，高等动植物有几十万个基因，如何从成千上万个基因的海洋中获得某个特定的基因。分子生物学家确定了3种主要方法，构建基因文库法、反转录法和PCR法。121医学资源一、目的基因的制取121医学资源（一）构建基因文库法分离目的基因构建基因文库法又称鸟枪法或散弹射击法：用特定的限制性内切酶将供体DNA切成许多片段（20~24kb），即用能产生互补粘性末端的限制性内切酶切开，可能获得含有目的基因的DNA片段。122医学资源（一）构建基因文库法分离目的基因122医学资源1、基本概念基因文库：将供体生物的DNA用限制酶切成许多片段，在连接酶的作用下分别与克隆载体进行体外重组，这种含有供体生物全部不同基因的重组克隆载体的总体称供体生物的基因文库。123医学资源1、基本概念123医学资源2、基本步骤①首先从含有目的基因的供体生物的细胞或组织中提纯获得高质量的基因组DNA。②用特定的限制性内切酶将含有目的基因的供体基因组DNA切割成许多片段。③用能产生互补粘性末端的限制性内切酶将载体（噬菌体或质粒）DNA切开并去除其中的填充片段。124医学资源2、基本步骤124医学资源④用专一性强的DNA连接酶将供体DNA片段分别与载体DNA连接（供体DNA片段克隆到载体中）。⑤经包装繁殖而产生重组噬菌体克隆（DNA重组体），建成供体基因组DNA文库成员。⑥当制备的克隆数多到足以把某种供体生物的全部基因都包含在内时，这些克隆的总体就称为该生物的基因文库。125医学资源④用专一性强的DNA连接酶将供体DNA片段分别与载体DNA连⑦有了基因文库，在分离带有目的基因的DNA重组体时就可以从文库中筛选而不必重复地进行全部操作。可采用放射性核酸探针杂交筛选含目的基因的重组克隆载体。若已知目的基因的核苷酸序列，可用DNA序列分析法筛选含目的基因的重组体。将DNA重组体转入宿主细胞，通过工程细胞株的培养，检测有无目的产物来筛选出含有目的基因的重组体。126医学资源⑦有了基因文库，在分离带有目的基因的DNA重组体时就可以从文（二）反转录法（cDNA基因文库法）1、基本原理：由于真核生物的基因大多为断裂基因，含有非编码间隔区（内含子，Intron），在原核生物受体中无法正常表达，必须设法消去内含子。mRNA是在供体生物细胞内已经转录加工过的RNA，是无内含子的遗传密码携带者。在反转录酶作用下，以mRNA为模板反转录合成互补的DNA（cDNA），再加上接头，即可与载体DNA连接构建成重组克隆载体，从而建成供体生物的cDNA基因文库，再从中筛选带有目的基因的DNA重组体。127医学资源（二）反转录法（cDNA基因文库法）127医学资源cDNA基因文库：以供体生物的总mRNA为模板，在反转录酶作用下合成核苷酸序列互补的DNA（cDNA），将全部cDNA分别与克隆载体进行体外重组，这些含有供体生物全部不同基因的重组克隆载体的总体称供体生物的cDNA基因文库。128医学资源cDNA基因文库：以供体生物的总mRNA为模板，在反转录酶作2、基本步骤①从供体生物细胞或组织中提取纯化得总RNA，其中含mRNA1~5%，其核苷酸序列由几百到几千个核苷酸组成。129医学资源2、基本步骤129医学资源②从总RNA中分离纯化出mRNA原理：亲和层析法，由于真核细胞中mRNA的3‵端常含有一多聚腺苷酸[poly(A)]组成的末端（20~250个腺苷酸），易吸附于寡聚脱氧胸苷酸[Oligo(dT)]-纤维素上。方法：含有总RNA的高盐缓冲液流经[Oligo(dT)]-纤维素柱时，mRNA被特异地结合在柱上。当逐渐降低盐的浓度洗脱时，mRNA被洗脱下来，经过两次[Oligo(dT)]-纤维素柱后，可得到高纯度的mRNA。130医学资源②从总RNA中分离纯化出mRNA130医学资源③cDNA的合成Ⅰ、cDNA第一链的合成mRNA带有3‵-poly(A)末端，可用Oligo(dT)作为引物，在反转录酶的作用下以mRNA为模板合成cDNA第一链（一般带有发夹结构）。一般一次可拷贝5~30%的mRNA。

mRNA5‵-GCCTACGGATCCTACGAAAAAAA-3‵cDNAATGCTTTTTTT-5‵

131医学资源③cDNA的合成131医学资源Ⅱ、cDNA第二链的合成先用碱解或RNaseH酶解除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链。然后以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶Ⅰ作用下合成第二链（从第一链3‵末端发夹结构开始合成第二链）。再用专一性强的核酸酶S1切去发夹结构，得双链cDNA。双链cDNA可用凝胶电泳测定其大小。132医学资源Ⅱ、cDNA第二链的合成132医学资源④cDNA的克隆——构建DNA重组体即cDNA基因文库的建立。经前3步，从所获得的mRNA分子集群对应合成cDNA分子集群。将合成的各双链cDNA分别与载体DNA进行体外重组，构建成cDNA重组体，即cDNA基因文库。133医学资源④cDNA的克隆——构建DNA重组体133医学资源Ⅰ、从cDNA基因文库筛选带有目的基因的cDNA重组体。Ⅱ、或经包装后转染到宿主细胞，得到一群含cDNA重组体的工程细胞株，再从中筛选具有目的基因的工程菌。用于cDNA体外重组的载体有噬菌体和质粒两类，当cDNA片段小于10kb时用质粒载体，大于10kb时用噬菌体载体。最好用具有操纵子的表达型载体，有利于含有目的基因的cDNA重组体筛选。134医学资源Ⅰ、从cDNA基因文库筛选带有目的基因的cDNA重组体。13⑤cDNA文库的鉴定Ⅰ、根据表达型克隆（cDNA重组体）的表型筛选a、抗性基因失活法，抑菌圈法。b、菌落或噬菌斑颜色改变法。c、α-互补现象消失法。Ⅱ、进一步鉴定的方法有凝胶电泳、分子杂交或DNA序列测定法（在已知目的基因分子量大小和核苷酸序列条件下）。135医学资源⑤cDNA文库的鉴定135医学资源⑥含目的基因cDNA重组体的筛选a、核酸探针杂交法：人工合成与目的产物对应的单链寡聚核苷酸为探针，从cDNA文库中筛选含目的基因的cDNA克隆。b、DNA序列分析法。c、免疫反应鉴定法：用某目的产物的抗体寻找相应的特异cDNA克隆。d、cDNA克隆的同胞选择法：将cDNA基因文库分成含10~100克隆的亚库，再从各亚库中筛选。136医学资源⑥含目的基因cDNA重组体的筛选136医学资源137医学资源137医学资源cDNA基因重组转化核酸探针cDNA文库138医学资源cDNA基因重组转化核酸探针cDNA文库138医学资源（三）化学合成法用化学合成法合成目的基因的DNA片段。先决条件：必须知道目的基因的核苷酸序列，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再推导出DNA的碱基序列。139医学资源（三）化学合成法139医学资源①先合成不同部位的双链寡聚核苷酸短片段。②经退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段。③再按正确的次序连接成较长的完整的基因DNA片段。140医学资源①先合成不同部位的双链寡聚核苷酸短片段。140医学资源（四）RT-PCR法合成目的cDNA反转录-聚合酶链式反应合成目的基因cDNA，是近年来发展起来的一种获取真核生物目的基因cDNA的简便、快捷而高效的酶促合成法。该法是以目的基因的mRNA为模板，用反转录酶先合成与其互补DNA（cDNA）的第一链，再进而酶促合成双链DNA。141医学资源（四）RT-PCR法合成目的cDNA141医学资源该法的前提是首先获得目的基因对应的mRNA。在真核生物的总RNA中rRNA占80~85%，tRNA占10~15%，mRNA占1~5%，而且mRNA种类繁多（1~3万种），核苷酸序列各不相同，大小从数百至数千碱基不等。因此要从中分离纯化目的mRNA，其难度不亚于分离目的基因。142医学资源该法的前提是首先获得目的基因对应的mRNA。142医学资源但人们发现，从某些特定型分化细胞分离的细胞质中，编码某特种蛋白质的目的mRNA占总mRNA的50~90%。称为高丰度mRNA。如网织红细胞中的珠蛋白mRNA，鸡输卵管的卵清蛋白mRNA，淋巴细胞中的免疫球蛋白mRNA，眼球晶体蛋白等的mRNA均为高丰度mRNA。143医学资源但人们发现，从某些特定型分化细胞分离的细胞质中，编码某特种蛋1、RF-PCR技术合成目的基因cDNA的一般程序①从真核生物细胞或组织中提取纯化总RNA。②在Oligo(dT)为引物的引导下，以总RNA中的总mRNA为模板，在反转录酶的作用下，合成总cDNA的第一链。③以两个引物所结合的单链目的cDNA(靶序列)为模板，大量合成双链目的cDNA。144医学资源1、RF-PCR技术合成目的基因cDNA的一般程序144医学2、PCR技术体外扩增DNA聚合酶链式反应体外扩增DNA；聚合酶链式反应（Polymerosechainreaction）技术，简称PCR技术，是一种用于在体外扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的分子生物学技术。应用该技术可在很短的时间内得到数百万个特异DNA序列的拷贝。目前该技术已在医学诊断、分子克隆和DNA分析中得到广泛应用。145医学资源2、PCR技术体外扩增DNA145医学资源（1）PCR技术的基本程序①变性：首先使双链DNA在反应液中经热变性（94~95℃）而分开成单链（或使反转录合成的cDNA:RNA杂交链分开成单链）。②退火：然后降温至40~60℃，在低温下与两个引物进行退火，使引物与单链DNA配对结合。③延伸：再在中温72℃下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性和热稳定性进行聚合（延伸）反应。

146医学资源（1）PCR技术的基本程序146医学资源

变性94~95℃

退火40~60℃延伸72℃147医学资源147医学资源PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火148医学资源PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3