绵羊痘和山羊痘诊断技术 编制说明

1《绵羊痘和山羊痘诊断技术》编制说明绵羊痘和山羊痘（以下简称为羊痘）分别由绵羊痘病毒（Sheeppoxvirus，SPV）和山羊痘病毒（Goatpoxvirus，GPV）引起。绵羊痘病毒（Sheeppox（Poxviridae）、脊椎动物痘病毒亚科（Chordopoxvirdae）、山羊痘病毒属病毒（Capripoxvirus,CaPV）。我国《一、二、三类动物疫病病种名录》将其列为膜、器官表面广泛性丘疹或结节，皮肤水肿，淋巴结肿大，消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡，给养殖业带来较大的危害，造成严重的经济损失，在英国发现，发病率50%～80%，病死率20%～80%，其中羔羊致死率可达100%。世界各国均有羊痘发病和流行的相关报道，目前非洲北部、中东和亚洲的部分国家流行较为严重。羊痘是阻碍引进绵羊和山羊珍贵品种以及养羊业规模化生产的主要障碍。严重危害养羊业生产。该病对养殖业破坏巨大，可以通过节肢动物机械性接触传播。蚊子、苍蝇和蜱等均可能是疫情跨地域远距离扩国现有疫情提供技术参考。国内现行的只有行标NY/T576-2015绵羊痘和山羊长，敏感性不高，结果判定人为主观性因素太大。并且该标准缺少病毒实时荧2光PCR检测方法、病毒LAMP检测方分子生物学检测方法相较于病毒分离、中和试验等其它检测方法具有检测速度快，检测结果量化、准确的优点，该方法在在临床检测和大面积监测等方面具有重要价值，对当前疫情的处理及防控意义重大。血清学酶联免疫抗体检测方法具有试验材料易获取，对试验环境、设备及人员的要求较低、检测速度快，敏感性高于中和试验，结果判定更为简单的优点，在临床检测和疫苗免疫大面积抗体监测等方面具有重要价值，对疫情的处理及防控意义重大。目前没有该病诊断技术方面的国家标准，尤其在进出境动物及产品检验检疫中，迫切本标准规定了羊痘诊断技术的范围、规范性引用文件、术语和定义、缩略语、原理、试剂与耗材、仪器与设备、操作步骤、结果分析与表述。本标准适本标准实用、准确、敏感，具有十分重要的实际应用价值。将其在基层推2023年1月，全国动物卫生标准化委员会以国家标准计划项目形式，下达了制定《绵羊痘和山羊痘诊断技术》国家标准的任务，任务编号：本标准由农业部农产品质量安全监管局组织，归口单位为全国动物卫生标准化技术委员会，起草单位为中国动物疫病预防控制中心、青海省动物疫病预防控制中心、新疆生产建设兵团动物疫病预防控制中心、甘肃省动物疫病预防控制中心、黑龙江省动物疫病预防与控制中心、北京亿森宝生物科技有限公司，重庆市动物疫病预防控制中心、山东省动物疫病预防与控制中心、北京市动物疫病预防控制中心、陕西省动物疫病预防控制中心、广西壮族自治区动物疫病预防控制中心、成都海关技术中心、山西省动物疫病预防控制中心、河北3金山、阚威、郑思思、赵俭波、钟映梅、张旭、曹丽萍、孙航、刘颖昳、李晓霞、徐琦、毕一鸣、王新杰、孙晓明、高姗姗、白雪冬、陈昭旭、曾政、骆璐、兰邹然、张月、赵浩军、李栋梁、赵光明、施开创、莫胜兰、林华、雷宇孙雨：中国动物疫病预防控制中心，主持标准修订、编制及实验室研究的杨林：中国动物疫病预防控制中心，负责标准文本的科学性与规范性审蔡金山：青海省动物疫病预防控制中心，负责临床阳性样品的收集与鉴郑思思：青海省动物疫病预防控制中心，负责临床阳性样品的收集与鉴4孙航：中国动物疫病预防控制中心，负责ELISA方法、PCR方法以及张月：山东省动物疫病预防与控制中心，负责临床阳性样品的收集与鉴李栋梁：北京市动物疫病预防控制中心，负责临床阳性样品的收集与鉴莫胜兰：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，负责血清学试验的开5要按标准各阶段为单位分别编写。列出各阶段的关键内容。征求意见、审查阶段的主要内容要详细给出。征求意见要对征求对象的代表性、回复情况、讨论标准制定思路，制定标准制定方案，明确项目任务分工，全面计划标准制一是查阅文献资料：查阅了目前国内关于羊痘的相关法律规范要求、研究文献，部分发达国家做法、WOAH《陆生动物卫生法典》和《陆生动物诊断试验和疫苗手册》的要求等。参考我国NY/T576-2015绵羊痘和山羊痘诊断技术技术规范。结合我国动物疫病预防控制机构兽医实验室以及检验检疫部门检测实验室的实验室检测工作实际，确定了本技术标准的框架。标准起草工作组认6三是进行技术验证：标准起草工作组经过技术咨询、调研，收集、整理和分析有关资料，并结合羊痘诊断方法、技术路线、应用现状和发展趋势等。并些试验方法的准确性与可靠性,并在此基础上，形成“标准征求意见稿”，然后行病学中心、中国农业科学院兰州兽医研究所、江西省动物疫病预防与控制中心、新疆生产建设兵团动物疫病预防与控制中心、新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心、甘肃省动物疫病预防控制中心、新疆维吾尔自治区动物卫生监督所、西南大学、西藏自治区动物疫病预防控制中心、北京热景生物技术股份二、标准编制原则和确定标准主要内容的依据大量收集国内外资料的基础上，筛选建立检测技术，并通过对大量临床样品的检测，对标准所列方法进行验证，对数据进行科学的统计分析，同时征求国内调所有检测方法一定是最先进的技术和最先进的方法，以符合行业实情和要求为目标，并通过在动物疫控系统兽医实验室的应用，验证标准的可操作性；三7诊断试验和疫苗手册》和我国NY/T576-2015绵羊痘和山羊痘诊断技术规范的相关技术内容，在国际推荐技术在我国适用的前提下，优先选择国际推荐技术主要内容包括技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则由于目前国内现行的只有行标NY/T576-2015绵羊痘和山羊痘诊断技术，但是NY/T576-2015标准中只包含绵羊痘与山羊痘的病毒分离、电镜检查、包涵体判定人为主观性因素太大。并且该标准缺少分子生物学病毒PCR检测方法、病毒实时荧光PCR检测方法、病毒LAMP检测方法和血清学酶联免疫抗体检测方法的内容。中国动物疫病预防控制中心参考WOAH发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》和NY/T576-2015绵羊痘和山羊痘诊断技术，结合近年来从事羊痘监测工作本标准的临床诊断和病毒分离鉴定两部分技术内容主要依据《默克兽医手册》和WOAH《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals）3.8.12章绵羊痘和山羊痘章节中，病原鉴定从活体或剖检组织中分离病毒等内容，同时参考我国近些年发表的羊课题组从WOAH英国绵羊痘和山羊痘参考实验室购买了羊痘病毒的对照血清、细胞及疫苗毒株，用于病毒中和试验。同时利用大量的田间样品进行了所建立标准所列的分子生物学检测方法过程中，课题组分析比F103基因的遗传精确性较高，可以被用做病毒核酸检测的目标基因。最终本标8测方法和实时荧光PCR检测方法检测方法。选用O三、主要试验或验证的分析、综述报告，技术经济论证，预期本单位组织实施了相关重要的试验项目进行验证，实施的试验项目主要（一）主要试验或验证的分析目前，羊痘病毒的检测方法包括病原学检测和血清学检测。病原学检测方果直观等优点，尤其适合样品病毒含量低情况下的快速检测。血清学检测方法主要是中和试验和酶联免疫吸附试验检测方法，用于检测抗体，从而了解病毒等的优化，增强了该方法特异性、敏感性和检出率。根据这一思路，应用生物毒属的P32基因作为靶序列，设计常规PCR检测方法引物、荧光染料引物与LAMP引物，扩增目的基因序列，通过多种试验方案，优化了山羊痘病毒属中不同病料中病毒DNA的提取方法、引物浓度和反应最适温度。根据优化的条件，检测不同山羊痘病毒属的样品，提高了检测的特异性和敏感性。特异性方种方法与其它临床症状类似的口蹄疫等病原均无交叉，均未检测到目的条带或9种方法均具有良好的重复性。实时荧光PC方法特异性强、敏感性高、试验结果准确可靠。为了进行免疫效果评估与感染状况的监测，根据山羊痘病毒属的P32基因，表达了山羊痘病毒属病毒重组蛋以不同的引物浓度浓度进行预实验，筛选到最佳引物浓度。同时以不同退（PPRV）、山羊关节炎脑炎病毒（CAEV）以及山羊支原体（Mccp）核酸为模板进行扩增以验证本方法的特异性。特异性试验结果表明(图2)，对照组用收集保藏的23株羊痘临床分离灭活毒株以不同的引物浓度进行预实验，筛选到最佳引物浓度。同时以不同退火温度进行PCR检测方法反应最终确立最适反应条件。筛选最优反应体系详见下用分光光度计测定重组质粒的OD260值，根据公式换算成拷贝数。然后作制备标准品，以各个浓度的质粒作为模板进行扩增，试验结果显示，浓度在（PPRV）、山羊关节炎脑炎病毒（CAEV）以及山羊支原体（Mccp）核酸为模板进行扩增以验证本方法的特异性。特异性试验结果表明(图7)，对照组为0.77%、1.23%和1.31%，批间重复变异系数分别为1.25%、0.91%和变TheCTvaluesof3异TheCTvaluesof3标系标准差%行试验，CaPV荧光定量PCR检测方法对质粒标准品的的检测下限为101用收集保藏的23株羊痘临床分离灭活毒以不同的引物浓度进行预实验，筛选到最佳引物浓度。同时以不同反应温（PPRV）、山羊关节炎脑炎病毒（CAEV）以及山羊支原体（Mccp）核酸为模板进行扩增以验证本方法的特异性。特异性试验结果表明(图10)，对照组编编用收集保藏的23株羊痘临床分离灭活毒株抗体ELISA检测方法检测上述30份阴性血清，并重复清号价1 编编清号价2 3—4 5—6 7—8 9— — — — — — — —编编清号价 — — — NC//////////采用特异性质控血清5份，均为羊痘病毒抗体阴性血清，分别是羊口蹄疫A型病毒阳性血清、牛病毒性腹泻病毒阳性血清、山羊关节炎/脑炎病毒阳性血由中国动物疫病预防控制中心制备、提供。将这5份血清用酶联免疫分析检测方法重复三次检测，同时采用中和试验进行平行实验，比较2种检测方法的特验值值9—8 6—8——0清NC//////////2.2.敏感性指标验证2.2.1最小检出量试验1:512、1:1024、1:2048进行稀释，采用酶联免疫分析检测法对上述稀释后的血清进行检测，同时用中和试验进行检测。结果显示，三次重复试验数据一致，测山羊痘病毒属病毒抗体的灵敏度要高于中和试验，更适用于抗体含量较低的///NC///30号为绵羊阳性血清。由中国动物疫病预防控制中心制备、保存。采用酶联免率。结果显示：三次酶联免疫分析检测法和份山羊阳性血清、15份绵羊阳性血清），酶联免疫分析检测法和中和试验的检1+2+3+4+5+6+7+8+94++++++++++++++++++++++/////NC/////2、中和试验判定标准：中和效价≥1：5判为阳性，中和效价＜1：5判为阴性。目前，羊痘病毒的检测方法包括病原学检测和血清学检测。病原学检测方果直观等优点，尤其适合样品病毒含量低情况下的快速检测。血清学检测方法主要是中和试验和酶联免疫吸附试验检测方法，用于检测抗体，从而了解病毒测方法、血清中和试验、间接免疫荧光抗体等进行羊痘病毒诊断。我国在2015年颁布了行业标准《绵羊痘和山羊痘诊断技术》（NY/T576—2015），推荐使用的诊断方法包括电镜观察、病毒分离、血清中和试验诊断方法。这些方法对羊痘诊断起到了重要的作用，随着近年来分子生物学和免疫学技术的发展，病标准结合我国羊痘诊断技术究的新进展、新成果荐标准等，将相关诊断技术进一步标准化，使该标准进一步完整、系统、实羊痘在我国已经有发病的报道，并且有文献介绍了相关病原检测方法。分子生物学检测方法可以使检测速度更快，检测结果量化从而更加准确，可快速确定病原。血清学抗体检测方法可以快速检测疫苗免疫后动物体内的抗体水四、采用国际标准和国外先进标准的程度，以及与国际、国内同类标准水平的对比情况，或与测试的国外样品随着羊痘在世界范围的不断蔓延，建立检测标准尤为重要。目前，国际上针对绵羊痘和山羊痘（羊痘）仅有WOAH陆生动物手册2.7.14，W