dna分型技术在刑事案件中应用

DNA分型技术

在刑事案件中的应用周怀谷2005年12月第一讲

法医DNA技术的开展世纪大案—美国橄榄球运发动辛普森谋杀妻子嫌疑案世纪丑闻—美国总统克林顿与白宫实习生莱文斯基绯闻案美国前橄榄球明星

—辛普森

O.J.辛普森1947年7月9日生于旧金山一贫穷的黑人家庭，13岁参加黑帮“波斯战士〞，15岁为此而坐牢。1967-1969年，南加州大学就读，获大学橄榄球赛最高奖——海斯曼奖。之后参加职业联赛，1985年被选为年度风云人物，当时身价最高的球员之一。20年后进入影视界，成为广告明星、体育节目评论员、并在影片中担任要角。布兰伍血案时间：1994年6月12日〔星期日〕22时15分左右地点：南加州洛杉矶布兰伍地区达班迪街被害人：辛普森前妻妮可、妮可男友隆纳疑点：辛普森住宅后门停着的白色福特越野车驾驶位置的车门把手上有一点血迹，门下有多点血迹；屋后走道上有一只沾满血迹的皮手套，与隆纳尸体旁的另一只成对；辛普森左手有伤口；辛普森当晚22时至23时之间行踪不明。布兰伍血案辨方人员：波顿博士——纽约州法医，美国刑事界最具权威的法医专家之一；柯克伦律师——洛杉矶著名的黑人律师；贝利律师——美国最有名的刑事辩护律师；艾兰教授——美国宪法专家，哈佛大学法学院教授；杰拉德教授——上诉专家，加州大学法学院院长；李昌钰——被誉为神探的康州警政厅长。布兰伍血案检方人员：克拉克检察官——主检女检察官，过去十年没有输过一宗案件；达顿检察官——洛杉矶最强的黑人检察官；哈奇曼检察官——首席检察官，担任幕后筹划；其他——旧金山、圣地亚哥的物证、DNA专家。布兰伍血案辛普森之妻妮可的血痕妮可之男友隆纳的血痕辛普森的血痕现场滴血ABOAAEaD1111PGMSub－type1+2+1+2+2－2+2－布兰伍血案疑点人员——白人刑警福尔曼1、最先赶到现场的刑警；2、主动提议带队去辛普森家，并第一发现辛普森住宅后门停着的白色福特越野车驾驶位置的车门把手上有一点血迹；3、单独搜查辛普森家，并发现屋后走道上有一只沾满血迹的皮手套；4、讨厌黑人，在不同场合讲出许多仇恨黑人的话。布兰伍血案疑点物证1、辛普森屋后走道上发现的一只沾满血迹的皮手套，辛普森戴不上；2、现场有除被害人以外的两种血鞋印；3、辛普森卧室内发现的一双血袜子，袜子两侧血迹完全一样。布兰伍血案存在的问题1、现场一张有血鞋印的纸片不见了；2、隆纳呼机上的血迹没有进行检验；3、妮可尸体肩部的血滴没有收集、检验；4、两只不同地方收集的袜子放入同一物证袋。布兰伍血案检方：从现场采集的血样中获得的DNA指纹证据，除了与被害人相同外，其余的均与辛普森相同，其“配错〞对象的可能性小于一千万分之一。辩方：你能保证在采血样过程中，在DNA扩增实验中没有被辛普森的血或DNA污染过？你能拿出数据证明这一千万分之一的配错率是以黑人群体作对照的？布兰伍血案精采镜头1、1994年6月17日17时许，加州405高速公路演绎90分钟的追逐。2、世纪大审判：1995年1月24日开庭，1995年10月3日宣判，全程电视转播。布兰伍血案结果1、经过245天的陪审，1995年10月2日十二名正式陪审员达成裁决，10月3日宣布：辛普森无罪。2、七成美国人认为辛普森很可能有罪。3、检方的一些现场证据也说明辛普森有涉案嫌疑。布兰伍血案李昌钰的观点：刑事鉴定最重要的是物证，以及现场的重建工作。如果没有完整的证据，就只能做局部的重建。这个案件就是只能进行局部重建的案件。本案中洛杉矶警察局的刑事化验室在DNA方面有80％是做对的，但是在其余局部都有瑕疵。严谨的科学工作者就是要把所有的疑点报告出来，希望检方能合理地答复，而不是去证明被告到底有罪还是无罪。被告是否有罪，还是要有陪审团或法官决定，而不是刑事鉴定人员。布兰伍血案辛普森案件的意义1、司法部门认识到DNA检验对破案的重要性；2、人民群众认识了DNA，接受了DNA检验；3、办案人员认识到证据的科学性、技术性、严密性和完整性。克林顿绯闻案第一代法医DNA标记DNA指纹技术〔法医物证学第160页〕DNA指纹图(DNAfingerprint)阿莱克·杰弗里斯〔AlecJeffreys〕英国莱斯特大学的遗传学家。1984年在调查疾病的DNA遗传标记时，发现RFLP〔限制性片段长度多态性〕技术在法庭科学个体识别中的应用价值，并积极将这一技术引进法庭鉴定中。由于RFLP图谱就像人的指纹，独一无二，故被称为DNA指纹图。DNA指纹的法科学应用个体识别。亲子鉴定。首起亲子鉴定案的应用1985年，一名加纳共和国的男孩申请移民英国，因为其母亲已经是英国的公民。用常规的血型检测方法无法区分该女性真的是其母亲还是其姨妈，为此，杰弗里斯采用了RFLP分析方法，最终证实了他们的母子关系，并通过此案使内政部批准而且成认了这项技术。首起刑事案件的应用1985年，英国中东部的一个小镇连续发生了两起强奸杀害女学生案。1986年警察拘留了一医院勤杂工，供认杀害了其中一名女学生。经杰弗里斯检验，于1986年11月21日排除了其嫌疑。1987年，采集第4583人——一面包房厨师，经杰弗里斯检验，于1987年9月证实了其嫌疑。DNA指纹技术的局限性需要检材量大，灵敏度底。需要完整的大分子DNA存在。多位点探针无种属特异性。高突变率。不能解决混合检材的个体识别问题。〔法医物证学第171页〕第二代法医DNA标记短串联重复序列(STR)〔法医物证学第199页〕常染色体STR片段银染检测常染色体STR片段荧光检测常染色体STR片段荧光检测Y染色体STR片段荧光检测父系遗传STR高识别率信息量大能自动分型等位基因不连锁快速分型费用较贵微量DNA基于PCR方法降解DNAmtDNA测序结果〔法医物证学第194页〕母系遗传DNA测序线粒体DNA分析的缺乏mtDNA分析提供的识别率相对较低，不能进行个体识别。同一母系的所有后代个体拥有相同的线粒体DNA序列，线粒体DNA分析不能区分开来自同一母系的个体，这限制了其法医学中的应用。线粒体DNA分析的灵敏度高，但同时也增加了污染的危险性。高率突变使个体的线粒体DNA存在异质性。同一个体的不同组织，如同一人的血液与口腔拭子mtDNA序列不同，甚至即使同一个体的毛发，不同根毛发也存在一个碱基的差异差异。PCR技术PCR，聚合酶链反响(PolymeraseChainReaction)，1985年由美国的Mullis等人创造，是一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，即无细胞分子克隆技术，其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。目前已广泛应用于分子生物学、医学、法医学、考古学等许多领域，对基因克隆、DNA序列分析等现代分子生物学技术的开展起了巨大推动作用。〔法医物证学第185页〕第三代法医DNA标记单核苷酸多态性(SNPs)单碱基变异引起的DNA序列多态性。每400-1000碱基中就有一个SNP位点，整个人类基因组中共有300万个以上的SNP。ACCTGTACTCGGTAACCTGTCCTCGGTA第二讲

法医DNA技术的应用法医DNA技术的应用

确定凶杀现场有否罪犯遗留的生物性检材及推断犯罪过程串并案子确定死者身源认定罪犯，或排除犯罪嫌疑人人类的基因突变率大约为1

/1,000,000第三讲

法庭科学DNA数据库

法庭科学DNA数据库是将DNA技术、计算机自动识别技术及网络传输技术相结合，将DNA检验结果输入计算机，由计算机对可数码化的DNA信息自动比对分析，通过网络技术实现异地查询、跨地区协作的目标。法庭科学DNA数据库前科库现场库失踪人员库

……市级库市级库国家库省级库省级库市级库市级库数据上报信息反响……

系统根本用途为刑事案件的侦查和审理提供依据；对高危犯罪嫌疑人群与犯罪现场进行排查；为时间，空间跨度的系列犯罪提供串并线索；为查找失踪人员提供证据；为军人，从事高危工作的人群，易走失人群〔老年痴呆，精神病患者，儿童〕等提供DNA数据预存效劳；为DNA法庭科学物证实验室的标准化管理提供指导。法庭科学DNA数据库的组成

物证、血样

位点名称图示基因型CD315/15VWA14/16FGA23/23D813/13D2129/29D1816/16D511/13D138/10D712/12现场物证库前科人员库入库存储无名尸体库失踪人员亲属库自查确定同一个体判定尸体间亲缘比对DNA数据库的其他内容及功能：灾害比对库、被拐儿童及父母库、亲子鉴定库、根底数据库。互查判定尸体身缘最早：80年代末的英国〔FSS〕；现普及北美、欧洲、亚洲、非洲的数十个国家

英国：6000万人口，年发案约67.5万起FSS数据库：单级结构：伯明翰、韦斯比、伦敦年检验能力13.5万，现存前科库150万；现场库13万英国DNA数据库历年串并案件及认定罪犯数据

年度检材间匹配数上升倍数嫌疑人与检材匹配数上升倍数9634846979762.8253155.09833573.4166736.69952441.6232351.42000104001.98704003.02001150001.41600002.3

美国自1998年开始正式建库。应用CODIS系统，二级结构：NDIS国家库建在FBI；SDIS各州参加CODIS系统的国立或私立实验室，共160个实验室。另其他17个国家的27个实验室也参加了CODIS系统〔2002，11〕库存前科人员数据1，396，485现场物证数据51，789串案1，714认定罪犯4，196协助调查6，257发挥作用比例23.5%新西兰：1996年开始建库，是国际上第2个建设国家DNA数据库的国家；采用自行编制的数据库软件，效果良好，发挥作用近50%；中国香港特别行政区：2001年7月1日立法通过建立DNA数据库：目前库存数据现场物证1600，人员数据3500。国内DNA开展历史国外：DNA检开始建开始荧光数据库快速积累、验起步数据库STR检验显著效益858790952000〔年代〕国内：DNA检提出建开始荧光刚刚起步、验起步库建议STR检验初见成效提取扩增分析上海市公安局DNA实验室检索再见！5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2mRNA表达的影响5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2mRNA表达的影响杜雅冰，邵应举，樊青霞，孙桢，王琳，赵培荣作者单位：(郑州大学第一附属医院肿瘤内科，河南郑州450002)【摘要】目的探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干预对食管鳞癌细胞株Eca9706生长增殖及其组织因子途径抑制物2(tissuefactorpathwayinhibitor-2，TFPI-2)基因表达的影响。方法选取食管鳞癌细胞株Eca9706，并用不同浓度的5-Aza-CdR处理该细胞株。MTT法检测干预前后细胞增长率的变化，FCM法检测干预前后细胞凋亡率的变化，RT-PCR技术检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2基因mRNA的表达，免疫组化检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2蛋白的表达。结果食管鳞癌细胞株Eca9706存在TFPI-2基因超甲基化状态，经5-Aza-CdR处理后，超甲基化状态解除，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡率明显提高(P<0.05);细胞中TFPI-2蛋白表达明显增强，同时mRNA的表达水平也较处理前明显提高(P<0.05)。结论食管癌细胞系TFPI-2基因超甲基化可抑制其mRNA表达，当其超甲基化解除后，细胞增殖受到抑制，同时细胞凋亡率相应提高。【关键词】食管癌;组织因子途径抑制物-2;5-氮杂-2-脱氧胞苷;甲基化;免疫组化;逆转录聚合酶链反响;凋亡ABSTRACT：ObjectiveToexploretheeffectsof5-Aza-2-deoxycytidine(5-Aza-CdR)interventiononthegrowthandproliferationofEca9706celllineandproteinexpressionoftissuefactorpathwayinhibitor-2(TFPI-2).MethodsEca9706celllinewastreatedby5-azaCdRofdifferentconcentrations;MTT，flowcytometry，immunohistochemistryandRT-PCRwereusedtodeterminethecellgrowth，apoptosis，andtheexpressionofTFPI-2geneanditsprotein.ResultsEca9706celllinehadhypermethylationofTFPI-2.Afterdemethylationby5-Aza-CdRtreatment，theproliferationofEca9706wasinhibited，theapoptosisratewasalsoincreasedsignificantlyintheconcentration-dependentmanner.RT-PCRdetectedthatmRNAexpressionofTFPI-2geneinEca9706celllinerecoveredsignificantly(P<0.05).Conclusion5-Aza-CdRcanslowthegrowthofEca9706cell，increasetheapoptosisrate，reactivatetheTFPI-2genetranscriptionandproteinexpressionbydemethylation.KEYWORDS：esophagealcarcinoma;tissuefactorpathwayinhibitor-2;5-Aza-CdR;methylation;immunohistochemistry;RT-PCR;apoptosis组织因子途径移植物2(tissuefactorpathwayinhibitor，TFPI-2)是丝氨酸蛋白酶抑制物，在调控肿瘤细胞浸润转移方面起着重要作用。目前，关于TFPI-2在食管癌中的基因表达情况的分析研究尚少。本研究旨在探讨TFPI-2基因的失活机制，并寻找食管癌治疗的新靶点。1材料与方法1.1材料RPMI-1640培养基购自北京索莱宝生物科技;标准胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技;Trizol试剂购自MBI公司;RT-PCR试剂盒购自MBI公司;5-Aza-CdR购自Sigma公司;人食管癌细胞株Eca9706由郑州大学肿瘤生物学研究室惠赠。1.2细胞培养和药物处理人食管癌细胞Eca9706以含10mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基，37℃、50mL/LCO2培养箱培养，每2～3d消化传代1次。1.3MTT法检测干预前后细胞增长率的变化取对数生长期细胞，调整密度至5×104/mL接种于96孔板，按5-Aza-CdR浓度分为6组：0、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4μmol/L，每组复设5个孔。待细胞贴壁后，分别于24、48、72h后参加MTT液，4h后弃去上清液，每孔加DMSO150μL，在490nm波长测定各孔吸光度值(absorbance，A)。细胞增殖抑制率(cellularproliferationinhibitionrate，CPIR)按公式计算：CPIR=(1-实验组A均值/对照组A均值)×100%。1.4流式细胞仪(FCM)检测干预前后细胞凋亡率的变化取对数生长期细胞，按5×105/mL的密度接种于6孔板内，待细胞贴壁后加药，分组如下：对照组(0μmol/L),1.6μmol/L5-Aza-CdR组，25.6μmol/L5-Aza-CdR组，102.4μmol/L5-Aza-CdR组。每组均于5-Aza-CdR作用48h后消化收集细胞，700mL/L冰乙醇固定，流式细胞仪进行细胞凋亡测定。1.5RT-PCR技术检测TFPI-2基因mRNA的表达分组同FCM，每组细胞均5-Aza-CdR作用48h。TFPI-2的上、下游引物分别为5′-GTCGATTCTGCTGTTTTCC-3′和5′-ATGGAATTTTCTTTGGTGCG-3′，合成产物为440bp;β-actin作为内参照，上下游引物分别为5′-AGGCATTGTGATGGACTCCG-3′和5′-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3′，合成产物为301bp。按照试剂盒说明书，用Trizol试剂提取细胞总RNA，经紫外分光光度计分析后，按Sigma公司RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit说明书操作。先逆转录制备单链cDNA，再以逆转录产物为模板，用上、下游产物进行PCR反响扩增目的基因。反响条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性30s,51℃退火30s,72℃延伸30s，循环30次，最后72℃延伸5min,4℃保温。扩增片段经20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.6免疫组化方法检测TFPI-2蛋白的表达取对数生长期细胞，按5×104/mL的密度接种于经预处理的盖玻片上，待细胞贴壁后加药(分组同RT-PCR)。培养48h后参加40g/L多聚甲醛溶液固定30min,30mL/LH2O2封闭内源性过氧化物酶，室温下10min,100mL/L动物血清封闭，室温下10min，滴加1∶100的稀释的TFPI-2抗体4℃过夜，二抗室温下1h，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育30min，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封片。另取爬片滴加PBS液代替一抗作为阴性对照。结果判定：TFPI-2蛋白阳性信号均呈棕黄色颗粒样物质，位于细胞质内。光镜下随机选取10个视野(每个视野观察细胞数不少于100个)，按阳性细胞所占百分比进行结果判定。阳性率=(阳性细胞数/1000)×100%。1.7统计学处理应用SPSS16.0软件进行统计学处理。实验数据采用均数±标准差(x-±s)表示，采用单因素方差分析加LSD两两比较法进行分析。检验水准α=0.05。2结果2.1干预前后细胞增长率的变化经MTT检测，结果显示，实验组细胞抑制率明显高于未加药组，且随着作用时间的延长和浓度的增加而增加(表1)。表1不同浓度的5-aza-CdR对Eca9706细胞增殖的影响2.2干预前后细胞凋亡率的变化流式细胞仪分析可见，经不同浓度5-Aza-CdR诱导48h后，Eca9706细胞各处理组凋亡率分别为(13.76±0.47)%、(26.97±0.39)%、(41.03±0.19)%，与5-Aza-CdR诱导浓度成正比。与对照组[(1.39±0.27)%]比较差异有统计学意义(P<0.05)，且各浓度组间比较差异亦有统计学意义(P<0.05，图1)。以上实验重复5次。2.3干预前后Eca9706细胞mRNA的表达情况扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，Eca9706细胞中TFPI-2mRNA表达在各用药组和未用药组之间有明显差异，TFPI-2mRNA在未用药组细胞中未见表达。经1.6、25.6、102.4μmol/L5-Aza-CdR处理后可见TFPI-2mRNA表达，说明在一定范围内随5-Aza-CdR药物浓度的增加TFPI-2mRNA表达逐渐增强(图2)。图1各组流式细胞凋亡散点图A：对照组;B：1.6μmol/L5-Aza-CdR组;C：25.6μmol/L5-Aza-CdR组;D：102.4μmol/L5-Aza-CdR组。图25-Aza-CdR处理前后Eca9706细胞TFPI-2mRNA的表达M：DNAmarker;β-actin：301bp;TFPI-2：440bp;1：对照组;2：102.4μmol/L组;3：25.6μmol/L组;4：1.6μmol/L组;5：H2O对照组。,2.4干预前后TFPI-2蛋白的表达情况免疫组化结果显示，经5-Aza-CdR作用Eca9706细胞48h，TFPI-2蛋白的阳性表达率增加，对照组、1.6μmol/L组、25.6μmol/L组、102.4μmol/L组TFPI-2蛋白的阳性表达率分别为(2.10±1.42)%、(9.31±2.70)%、(14.72±3.50)%、(68.20±3.20)%，不同浓度组之间以及用药组与对照组之间的差异均有统计学意义(P<0.05，图3)。图3各组TFPI-2蛋白的表达情况3讨论人TFPI-2(hTFPI-2)基因定位于7q22区域，全长由8164个碱基组成，其cDNA全长为1222kb。其mRNA的启动子具有典型的管家基因特征，没有典型的TATA盒或CAAT盒，在推定的转录起始位点区域GC含量超过80%[1]。TFPI-2可在体内多种组织广泛表达，在这些组织内一旦出现肿瘤，TFPI-2的表达水平也会随之显著下降[2]。有研究证实，在绒毛膜癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质细胞瘤、纤维肉瘤和胸部恶性肿瘤组织中，与肿瘤产生相关的TFPI-2表达水平减少可能与其启动子的甲基化密切相关[1,3-5]。启动子区cpG岛高甲基化在肿瘤形成机制中确实切作用尚不清楚，然而众多证据说明，肿瘤抑癌基因CpG岛异常的甲基化导致基因失活和转录抑制是肿瘤发生的重要机制之一[6-8]。目前，有体外实验说明，DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR通过去甲基化作用可使多种含有CpG岛的高甲基化抑癌基因重新表达，从而恢复抑癌功能[9]。本实验RT-PCR结果显示，TFPI-2在Eca9706细胞中无表达，经过不同浓度的5-Aza-CdR处理Eca9706细胞后，TFPI-2亦重新出现表达，且在一定范围内随药物诱导浓度的增大表达逐渐增强。MIZUNO等[10]研究说明，肿瘤细胞中DNMT的表达较正常的高4～12倍，也证实DNMT上调参与肿瘤发生。这与我们的实验结果一致。根据MTT实验可知，经过5-Aza-CdR干预处理过的Eca9706细胞增殖明显受抑制，且随着药物浓度的增加，抑制作用越明显。从本实验结果分析，DNA启动子区去甲基化能较明显地抑制食管癌细胞增殖，并与其诱导剂量呈正相关，推测这种抑制作用与去甲基化后重新激活TFPI-2基因的转录和表达有着直接关系;此外可能与去甲基化后诱导细胞凋亡有关。进而通过流式细胞仪分析，结果显示，经不同浓度5-Aza-CdR干预的Eca9706的细胞中，用药组与对照组相比细胞凋亡率凋亡率有所增加，并且与5-Aza-CdR诱导剂量有依赖性关系。BENDER等[11]在同等条件下用5-Aza-CdR处理恶性肿瘤细胞系和正常纤维细胞系时，发现肿瘤细胞增殖均被抑制，而纤维细胞增殖不被抑制。因此，5-Aza-CdR对Eca9706细胞增殖的抑制及凋亡的增加不是药物的毒性影响，可能是因为使TFPI-2重新表达的结果。目前，国外以TFPI-2为药物研究靶点，就TFPI-2在肿瘤治疗、肿瘤临床诊断、促进伤口愈合和动脉粥样硬化治疗等领域中的应用，也正在进行广泛深入的研究。本研究用甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理人食管癌Eca9706细胞株，检测TFPI-2基因表达的变化及其对细胞增殖和凋亡的影响，以期寻找治疗肿瘤的新靶点。【参考文献】[1]HUBEF，REBERDIAUP，IOCHMANNS，etal.CharacterizationandfunctionalanalysisofTFPI-2genepromoterinahumanchoriocarcinomacellline[J].ThrombRes，203，109(4)：207-215.[2]MIYAGIiY，KOSHIKAWAN，YASUMITSUH，etal.cDNAcloningandmRNAexpressionofaserineprotein5andtissuefactorpathwayinhibitor-2[J].JBiochem，1994，116(5)：939-942.[3]RAOCN，SEGAWAT，NAVARIJR，etal.MethylationofTFPI-2geneisnotthesolecauseofitssilencing[J].IntJOncol，2003，22(4)：843-848.[4]KONDURISD，SRIVENUGOPALKS，YANAMANDRAN，etal.Promotermethylandsilencingofthetissuefactorpathwayinhibitor-2(TFPI-2)，ageneencodinganinhibitorofmatrixmetalloproteinasesinhumangliomacells[J].Oncogene，2003，22(29)：4509-416.[5]STEINERFA，HONGJA，FISCHETTEMR，etal.Sequential5-Aza-2-deoxycytidi-ne/depsipeptideFK228treatmentinducestissuefactorpathwayinhibitor2(TFPI-2)expressionincancercells[J].Oncogene，2005，24(14)：2386-2397.[6]HERMANJG，BAYLINSB.Promoter-regionhypermethylationandgenesilencinginhumancancer[J].CurrTopMicrobiolImmunol，2000，249：35-54.[7]JONESPA，BAYLINSB.Thefundamentalroleofepigeneticeventsincancer[J].NatRevGenet，2002，3(6)：415-428.[8]EHRLICHM.DNAmethylationincancer：toomuch，butalsotoolittle[J].Oncogene，2002，21(35)：5400-5413.[9]PAZMF，FRAGAMF，AVILAS，etal.AsystematicprofileofDNAmethylationinhumancancercelllines[J].CancerRes，2003，63(5)：1114-1121.

[10]MIZUNOS，CHIJIWAT，OKAMURAT，etal.ExpressionofDNAmethyltransferasesDNMT1，3A，and3Binnormalhematopoiesisandinacuteandchronicmyelogenousleukemia[J].Blood，2001，97(5)：1172-1179.[11]BENDERCM，PAOMM，JONESPA.InhibitionofDNAmethylationby5-Aza-2-deoxycytidinesuppressesthegrowthofhumantumorcelllines[J].CancerRes，1998，58(5)：95-101.申明：本论文版权归原刊发杂志社所有，我们转载的目的是用于学术交流与讨论，仅供参考不构成任何学术建议。幻灯片放映结束！

谢谢请您提出珍贵意见！再见O(∩_∩)O谢谢各位！OK“做〞论文的智慧和思维广州市第65中学王建春2021年4月“做〞论文的智慧和思维为何提“做论文〞，而不是“写论文〞？学术论文的四大属性如何使论文具有创新性？做论文真的需要智慧和思维？智慧和思维的源泉：阅览文献，做有心人智慧和思维的张力：逻辑的根本魅力关于提高论文投稿发表率一、为何提“做论文〞，而不是“写论文〞？做论文强调论文产生的过程：选题——资料的搜集、整理——实证操作——(数据)整理——结论形成——文本的书写与修改。写论文：侧重文本的书写与修改何者厚重与严肃?何者薄弱与应付？一目了然一、为何提“做论文〞，而不是“写论文〞？为写论文而论文：感慨：书到用时方很少状态：没有头绪，无从下笔结果：生的伟大，憋的难受产物：胡乱拼凑，美丽垃圾根源：缺乏自己的思想或观点所以，不太喜欢说“写论文〞，喜欢听别人说“做论文〞二、学术论文的四大属性〔一〕学术性首先要明白什么是“学术〞，所谓学术，是指较为专门、系统的学问。所谓学术性，就是指研究、探讨的内容具有专门性和系统性，即是以科学领域里某一专业性问题作为研究对象。从内容上看，学术论文更是富有明显的专业性。学术论文是作者运用他们系统的专业知识，去论证或解决专业性很强的学术问题。从语言表达来看，学术论文是运用专业术语和专业性图表符号表达内容的，它主要是写给同行看的，所以不在乎其他人是否看得懂，而是要把学术问题表达得简洁、准确、标准，因此，专业术语用得很多。学习一门学科本质上是掌握专业概念、术语和符号二、学术论文的四大属性〔二〕科学性：科学性是学术论文的特点，也是学术论文的生命和价值所在。开展学术研究，写作学术论文的目的，在于揭示事物开展的客观规律，探求客观真理，从而促进科学的繁荣和开展，这就决定了学术论文必须具有科学性。所谓科学性，就是指研究、探讨的内容准确、思维严密、推理符合逻辑。二、学术论文的四大属性〔三〕创新性创新性被视为学术论文的特点之一，这是由科学开展的需要决定的。科学研究是对新知识的探求。如果科学研究只作继承，没有创造，那么人类文明就不会前进。人类的历史就是不断发现、不断创造也就是不断创新的历史。一个民族如果没有创新精神，这个民族就要衰亡。同样，一篇论文如果没有创新之处，它就毫无价值。二、学术论文的四大属性〔四〕理论性学术论文与科普读物、实践报告、科技情报之间最大的区别就是具有理论性的特征。所谓理论性就是指论文作者思维的理论性、论文结论的理论性和论文表达的论证性。三、如何使论文具有创新性？论文最根本的要求是新颖，具有独创性，所以一篇学术论文的内容绝不应是空泛的、陈旧的、拾人牙慧的。一篇教育科研论文的赖以生存的属性：创新性否那么，就是美丽的垃圾三、如何使论文具有创新性？〔一〕说人家没说过的例：“根对矿质元素吸收〞教学中对学生逻辑思维的训练〔2003年11月?生物学通报?〕高中生物史例教学中对学生科学思维的训练〔2004年6月?生物学教学?〕年级委员会制：大规模普通高中学校有效的“扁平化〞管理〔2021年7月?校长引领与教师专业开展?〕创新相对容易，鬼很好画，人不太好画，但往往写作难度最大，相关文献不多，抄都没得抄三、如何使论文具有创新性？〔二〕说人家说的不全、不系统针对“盲人摸象〞现象，综合客观看待，例：提高生物课堂教学有效性的系统化研究〔2006年10月?广州市中小学、中等职业学校特约教研员论文选编?第八集〕有效教学的理论与实践概略也比较容易，只要功夫深、铁杵磨成针，功到自然成三、如何使论文具有创新性？〔三〕说人家说的不同一方向例：生物实验设计在培养学生科学思维中的作用〔2002年6月?中学生物学教学?〕；中学生的生物实验设计能力培养的迫切性；培养中学生生物实验设计能力的策略与措施讲究灵性和运气，时机总是为有准备的人准备的三、如何使论文具有创新性？〔四〕说人家说得不太对或不准确的谈高中生物新课程课堂教学生成性的正确把握〔2021年4月?教育导刊?〕需要相关领域资料的积累，更需要判断的勇气和敏锐，真理往往在少数人手中三、如何使论文具有创新性？〔五〕说人家说过，但随时代变化赋予新价值和新内涵例：在初中生物教学中运用“掌握学习教学模式〞的新视点〔2000年1月?广州市中学生特约教研员论文选编〔第六集〕?〕新课程背景下中学德育的新开展〔2021年6月?中小学德育研究?〕需要传承与创新的精神，不太容易说好四、做论文真的需要智慧和思维？那怎么会是需要？那家伙是相当需要！四、做论文真的需要智慧和思维？天下文章一大抄，看你会抄不会抄会抄不会抄的根本区别在哪里？在于有没有自己的思想和方法所以，我说教育科研的本质是智慧与思维的较量四、做论文真的需要智慧和思维？所谓做论文，即是做学问。必须：基于现实兼顾过去瞄准未来处理好“来龙〞与“去脉〞的关系问题四、做论文真的需要智慧和思维？不基于现实问题没有实用价值，面临生存问题不兼顾过去容易贻笑大方，犯低级错误不瞄准未来容易成为应时顺景文章，谈不上具有学术的沉淀价值四、做论文真的需要智慧和思维？其实，对某一问题的历史、现实和未来的关注这哪里仅仅是做学问涉及的是做人的智慧和道理所以，我说教育科研的本质是智慧与思维的较量四、做论文真的需要智慧和思维？以?有效教学的理论与实践概略?为例：处理“来龙〞与“去脉〞的关系有效教学提出的背景〔回忆过去〕有效教学的含义〔兼顾过去、基于现实〕关于有效教学认识上的整体把握〔兼顾过去、基于现实〕摈弃传统教学的“有效〞经典陋习〔兼顾过去、基于现实〕高度警惕“美丽错误〞：新课程理念下的低效、无效教学〔基于现实、瞄准未来〕有效教学的应然状态——有效教学到底是啥模样？〔基于现实〕有效教学的达成〔基于现实〕有效教学的资源〔基于现实〕学科操作性个案纲要〔基于现实〕有效教学“胎记〞的为难与可能的嬗变：从有效教学走向优效〔优质〕教学〔瞄准未来〕五、智慧和思维的源泉：阅览文献，做有心人人的运气取决于两方面：一、看过的书二、交往的人五、智慧和思维的源泉：阅览文献，做有心人眼界决定境界思路决定出路深度决定高度眼界、思路、深度从哪里来？最快速的方法是阅览文献，做有心人！哲学上间接经验与直接经验的关系五、智慧和思维的源泉：阅览文献，做有心人眼界是由资料见识决定思路可以在阅读资料中明晰深度是在不同资料中得以挖掘阅览文献，防止少见多怪，防止人云亦云，是做学问最根底但也是最重要的工作五、智慧和思维的源泉：阅览文献，做有心人著名的历史学家吴晗说过：“资料工作和研究工作实际上是一回事，从来没有做研究工作有成绩的人，不搞资料工作的。〞梁启超也说过：“大抵凡一个大学者平日用功，总是有无数小册子或单纸片：读书看见一段资料，觉其有用者，即刻抄下。马克思、鲁迅等都在自己的研究生涯中，在资料的收集方面用力甚劬。马克思写?资本论?，花了四十年心血，钻研和摘要过的书籍达1500多种。鲁迅写?中国小说史略?，仅?小说旧闻钞?就是从90余种、1500卷书中抄录下来的。

资料的搜集是如此重要，以至于达尔文认为：“科学就是整理事实，以便从中得出普遍规律或结论。〞五、智慧和思维的源泉：阅览文献，做有心人(一)搜集资料的原那么搜集资料要有目的性，要紧紧地围绕自己的选题。搜集资料要多而又有全面性，历史的、现实的、正面的、反面的、点上的、面上的、远的、近的，都要搜集。〔钟启泉、王策三两位大专家的文章资料足可以让我对本次新课程改革有更为饱满的理解〕搜集资料要持之以恒，逐渐积累。五、智慧和思维的源泉：阅览文献，做有心人

(二)阅读资料的方法〔在有限时间内尽可能掌握更多的资讯〕

先粗读，后精读。注意理解大意。

把握作者的思路，分析、研究作者的论断，掌握作者研究问题、论证问题的方式方法。先读提要、序言或后记，后读全文。现在各类图书报刊资料的数量越来越丰富，要每一本都细加阅读是不可能的，因此善于选择就显得十分重要了。在阅读资料时，应首先注意看资料的目录和内容提要，然后选择自己所需要的内容仔细阅读和研究。先读新资料，后读旧资料。五、智慧和思维的源泉：阅览文献，做有心人

(三)写读书笔记的方法

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摘录式笔记——照抄原文或内容摘要。提纲式笔记——将资料的论点或根本内容提纲挈领地表达出来。心得式笔记——将对某一问题的心得体会写成短小的文章、札记、随笔等。索引笔记——写下有关的书名或论文题目，按照内容本身的性质搞出一个索引来，以备查用。〔本人最常用〕五、智慧和思维的源泉：阅览文献，做有心人做学问的人还是要必备一些书：中华人民共和国教育部制订?普通高中课程方案〔实验〕?〔人民教育出版社，2003年4月第1版〕中华人民共和国教育部制订?普通高中生物课程方案〔实验〕?〔人民教育出版社，2003年4月第1版〕朱慕菊主审、钟启泉等主编?根底教育课程改革纲要〔试行〕解谈?〔华东师范大学出版社，2001年8月第一版〕朱慕菊主审、教育部根底教育司组织编写?走进新课程：课程实验者对话?〔北京师范大学出版社2002年6月第一版〕中华人民共和国教育部制订?全日制普通高级中学生物教学大纲?(人民教育出版社2002年4月第1版)生物课程标准研制组编写?普通高中生物课程方案〔实验〕解读?〔江苏教育出版社2004年3月第1版〕教育部根底教育司教育部师范教育司组织?普通高中生物课程标准研修手册?〔高等教育出版社2004年5月第1版〕胡文耕著?生物学哲学?〔中国社会科学出版社2002年1月第1版〕五、智慧和思维的源泉：阅览文献，做有心人做学问的人还是要必备一些书：李文痒于永仙编著?探秘生物思维?〔北京科技出版社2002年7月第1版〕汪永祥主编?马克思主义原理?〔中国人民大学出版社1989年4月第1版〕?简明国际教育百科全书?〔北京：教育出版社,1992〕冯克诚,西尔枭主编?实用课堂教学模式与方法改革全书?〔北京：中央编译出版社,1994〕吴杰主编?外国现代主要教育流派?〔吉林：吉林出版社,1989〕高文主编?现代教育的模式化研究?〔山东教育出版社，2000年12月，第2版〕柳思俭、淳于家新编?实用中学学科课堂教学模式?〔山东教育出版社，1999年3月，第1版〕石鸥?教学病理学?〔湖南教育出版社,1999〕五、智慧和思维的源泉：阅览文献，做有心人做学问的人还是要必备一些书：黄济、王策三?现代教育论?〔人民出版社,1996〕曹道平编著?生物学教学理论、方法与技术?〔山东教育出版社，1998年8月第1版〕罗树华李洪珍主编?教师能力学?〔山东教育出版社，1997年2月第1版〕麦曦主编?教学设计的理论和方法?〔新世纪出版社，1996年4月第1版〕徐仁静主编?中学生物创新教法?〔学苑出版社，1999年8月第1版〕张掌然张大松著?思维训练?〔华中理工大学出版社，2000年6月第1版〕李洪玉何一粟著?学习动力?〔湖北教育出版社，1999年2月第1版〕姚海林著?学习规律?〔湖北教育出版社，1999年1月第1版〕叶佩珉主编?生物实验论?〔广西教育出版社，2001年4月〕白月桥著?课程变革概论?〔河北教育出版社，1996年版〕李衍华著?形式逻辑自学读本?〔解放军出版社，1985年12月，第1版〕袁振国著?教育新理念?〔教育科学出版社，2003年3月第1版〕[美]BeverlyAbbey主编丁兴富等译?网络教育：教学与认知开展的新视角?〔中国轻工业出版社，2003年1月第1版〕周庆林主编?研究性学习指导?〔广西大学出版社，2002年5月第1版〕五、智慧和思维的源泉：阅览文献，做有心人做学问的人还是要必备一些书：周庆林主编?研究性学习指导?〔广西大学出版社，2002年5月第1版〕黄光扬主编?教育测量与评价?〔华东师范大学出版社2002年8月第一版〕〔美〕W.JamesPopham著?促进教学的课堂评价?〔中国轻工业出版社2003年1月第一版〕史晓燕?开展性教育评价的理论与实践?〔河北教育出版社2003年11月第一版〕〔美〕StephenD.Brookfield著，张伟译?批判反思型教师ABC?〔中国轻工业出版社，2002年