菊芋高产菊粉外切酶菌株的筛选

菊芋高产菊粉外切酶菌株的筛选

jerusalstiefer，又名洋姜，建于北美，通过欧洲引进亚洲，在中国广泛种植。菊芋适应性较广、耐盐碱,适合在沙漠、滩涂、盐碱、荒地等非农业耕地种植,且产量较高,价格低廉。菊芋块茎中含糖量高,可达到菊芋块茎干重的65%～75%,菊芋块茎中的储存性糖是以菊粉(inulin)的形式存在的,菊粉是一种多糖,又名菊糖,由D-果糖残基经β(l-2)糖苷键经过脱水缩合而成,直链结构,末端连接1个葡萄糖分子。菊粉分子式可以用GFn表示,其中G代表终端葡萄糖,F为果糖分子,n为果糖的单位数,菊粉的聚合度一般为2～60,平均分子质量约为5500,是一类简单的果聚糖,菊糖可以通过酸或者酶进行水解,水解产物为易于被微生物利用的果糖。由于含有大量果糖,可以利用产外切菊粉酶的微生物快速分解菊糖为微生物利用的果糖,然后通过发酵方法生产乙醇,以菊粉外切酶的应用研究为基础,利用菊粉外切酶水解菊粉为易于利用的果糖,利用微生物发酵生产乙醇成了酒精工业生产中一条极具能源意义的新途径。本试验从新疆石河子菊芋生长的盐碱地中经过初筛、复筛和分离纯化后得到1株具有高产菊粉外切酶活力的菌株(G-60),在单因素试验基础上,采用Plackett-Burman(PB)试验设计方法考察8个发酵因素,筛选得出3个显著因素,再利用最陡爬坡试验以及Box-Behnken(BB)响应面设计,确定对产菊粉外切酶有显著影响因素的最佳浓度,以提高菊粉外切酶酶活。1试验材料和方法1.1材料表面1.1.1仪器、仪器和仪器菊粉:西安斯诺特生物技术有限公司;HANNApH211型PH计:乌鲁木齐祥生仪器有限公司;721型分光光度计:北京市六一仪器厂;智能生化培养箱SPX-80:上海科恒实业发展有限公司;恒温振荡器:江苏省金坛市医疗器械仪器厂。3,5-二硝基水杨酸等所用试剂及药品均为分析纯(AR)。1.1.2培养基cy(1)初筛培养基:菊粉40.0g/L,蛋白胨10.0g/L,Na2HPO410.0g/L%,NH4Cl20.0g/L,琼脂15.0g/L,初始pH值7.2。(2)发酵培养基:菊粉40.0g/L,酵母膏7.0g/L,蛋白胨10.0g/L,Na2HPO410.0g/L,NH4Cl20.0g/L。(3)PDA培养基:马铃薯(去皮,切碎)200.0g/L,葡萄糖20.0g/L,琼脂20.0g/L,pH值自然。(4)斜面培养基:查氏酵母膏琼脂培养基(CYA)。以上所有培养基在配置完成后,均需要120℃高压灭菌20min。1.2制备芽孢悬液的制备从新疆石河子菊芋生长的盐碱地中分组取土壤5g置于无菌水中,180r/min摇床振荡分散。取样液1mL按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释后,涂布于初筛选培养基,28℃培养3d～5d。挑取单菌落,用平板划线法纯化培养,重复3～4次移入斜面保藏。将纯化得到的菌种接种于PDA培养基上,培养5d～7d,待孢子成熟后取适量孢子与无菌水混合均匀制成孢子悬液。在250mL三角瓶中发酵培养基装量50mL,加入制好的孢子悬液1mL,28℃、180r/min振荡培养3d～5d,进行复筛。1.3菊粉外切酶活性测定1.3.1l发酵培养基酶液的制备将复筛得到的菌株按5%接种量接入装量50mL发酵培养基的250mL的三角瓶中,28℃、180r/min摇床培养60h,12000r/min、4℃离心10min取上清液即为酶液。1.3.2还原糖含量的测定外切酶酶活测定采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法):取1mL稀释后酶液,加入4mL1.5%的菊糖溶液(用0.lmol/LpH5.0的醋酸缓冲液配制),在55℃水浴中反应10min。取反应液体系0.5mL加入0.5mLDNS溶液混匀,沸水浴反应5min后迅速冷却并稀释至5mL(在完全相同的条件下灭活酶作为底物对照),在波长540nm处测定其OD值,利用葡萄糖标准曲线计算样品中还原糖的含量。外切菊粉酶酶活单位定义:在上述条件下,每分钟产生1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位(U)。1.4试验设计1.4.1pb试验设计Plackett-Burman(PB)设计方法是一种基于两水平的试验设计方法,适用于从多因素试验中快速有效地筛选出显著影响因素,试图用最少试验次数使得各因素的主效应得到尽可能精确的估计。Plackett-Burman(PB)设计方法可以从N次试验中,最多可以研究(N-1)个因素,其中(N-4)个实际因素,3个为虚拟变量用以误差的估计。本试验选用N=12(进行12次试验)的PB试验设计,对菊粉添加量、培养基初始pH值、酵母膏含量、发酵时间、蛋白胨添加量、发酵温度、装液量和接种量8个影响菊粉外切酶酶活的因素进行试验研究。每个因素均取2个水平:低水平“-1”和高水平“1”,其中“1”为“-1”的1.25～1.5倍,一般试验均选取1.5倍,另设3个空白项对应表中的X4、X8和X11,用以考察试验误差。菊粉外切酶酶活为响应值。自变量、编码和水平因素见表1。1.4.2培养基初始ph值的影响根据Plackett-Burman(PB)试验分析结果设计最陡爬坡试验,确定爬坡方向和选择步长,由PB试验结果可知,菊粉和酵母膏含量显示正效应,初始pH值为负效应。按照一定的梯度增加培养基中菊粉含量和酵母膏浓度,并按照一定的梯度降低培养基的初始pH值,其余5个因素均选取初始浓度。测定最终发酵液中菊粉外切酶酶活,进一步确定菊粉含量、酵母膏添加量和培养基初始pH值3个因素的最佳浓度。1.4.3产酶条件筛选与响应面分析Box-Behnken(BB)试验设计方法适用于2-5个因素的优化试验。以Plackett-Burman(PB)试验结果筛选得到的对最终发酵液中菊粉外切酶酶活影响显著的因素作为试验设计因素,以最陡爬坡试验结果得出的浓度作为中心点,以菊粉外切酶酶活为响应值,通过响应面分析对产酶条件进行优化。试验因素与水平设计如表2所示。2结果与分析2.1plackett-burman试验结果分析Plackett-Burman(PB)试验设计与结果见表3。采用Design-Expert8.0软件对表3中的菊粉外切酶酶活数据进行方差回归分析,得到各影响因素的显著性(表4)。采用Design-Expert8.0软件对表3中的菊粉外切酶酶活数据进行二次逐步回归分析,得到菊粉外切酶酶活为响应值的最优多元次回归方程:由表4方差分析结果表明,所得的回归方程达到显著(p=0.0109),试验数据的变异性可以用此回归模型来解释。在Plackett-Burman试验设计的水平范围内X1、X2和X3对菊粉外切酶酶活力影响极显著(p<0.01),X7、X9和X10对菊粉外切酶酶活力的影响显著(p<0.05)其他各因素在试验所考察的水平范围内,对菊粉外切酶酶活没有显著影响。因此,对菌株G-60发酵生产菊粉外切酶最主要的影响因素为菊粉含量(X1)、酵母膏含量(X3)和初始pH值(X2)。其中,菊粉和酵母膏的添加量对外切酶酶活产生正效应影响,pH值对菊粉外切酶酶活具有负效应影响。选取此3因素为研究对象,作进一步的优化试验。2.2box-behnken试验由表5可知,随着菊粉添加量、酵母膏含量和培养基初始pH值的变化,最终发酵液中的菊粉外切酶酶活先升高后降低,当菊粉添加量、酵母膏含量和初始pH值分别为7%、0.7%和7时,所对应的最终发酵液中的菊粉外切酶酶活达到最大值30.04U/mL,选取菊粉含量为7%、初始pH值为7和酵母膏含量为0.7%作为试验中心点,进行Box-Behnken优化试验。2.3回归模型的建立和显著性分析以菊粉添加量、酵母膏含量和培养基初始pH值3个显著因素为自变量,各因素编码水平见表2,Box-Behnken试验设计及结果见表6。采用Design-Expert8.0软件对表6中的菊粉外切酶酶活数据进行方差分析及多元回归拟合,得到了各影响因子的显著性(表7),获得菊粉外切酶酶活力(Y)对自变量菊粉添加量(A)、初始pH值(B)和酵母膏含量(C)的二次多项回归模型方程:由表7可知,二次回归方程失拟项不显著(p=0.1888>0.05),可知此回归方程不失拟。方程模型极显著(p=0.0013<0.01),说明此回归方程能够很好的与试验结果拟和。由二次回归模型方程可知,回归方程因变量与自变量A和B之间一次性关系明显,回归方程的一次项、交互项的系数都较大,而二次项项系数较小,说明响应面分析所选的3个因素之间的交互效应较显著。从方差分析表(表7)还可以看出,方程的一次项中A和B极显著,说明发酵液中菊粉含量(A)和初始pH值(B)在发酵中对菊粉外切酶酶活影响显著;方程的二次项均不显著;方程的交互项中AB项显著,AC项极显著,说明菊粉浓度(A)和酵母膏浓度(C)对菌株发酵产酶有明显的交互作用。同时对回归方程进行优化,删除其中t检验不显著项,将二项式方程方程简化为:利用Design-Expert8.0软件对回归模型进行响应面分析,对回归方程进行最值求解,得到模型极值点,即当菊粉、初始pH值和酵母膏的值分别为7.91%、6.61和0.64%时,响应值Y达到最大值,即菊粉外切酶酶活达到最高为58.51U/mL。为了验证响应面试验分析的可靠性,结合实际试验条件,选择菊粉添加量8%、培养基初始pH值为6.5、酵母膏含量0.65%,其他各个不显著影响因子条件不变即选择初始浓度,进行验证试验,经过3次平行试验,测得最终发酵液中菊粉外切酶酶活力的平均值57.25U/mL,与理论预测值58.51U/mL接近可见该模型能较好的预测实际菊粉外切酶酶活发酵情况。3box-behnken试验设计及结果利用Plackett-Burman(PB)试验设计,考察影响菌株G-60发酵生产菊粉外切酶酶活的8个相关因素,包括:菊粉添加量、酵母膏含量、蛋白胨浓度、发酵时间、发酵温度、培养基初始pH值、装液量和接种量。试验结果显示菊粉添加量、酵母膏添加量和pH值对菊粉外切酶酶活力影响极显著(p<0.01),发酵温度、装液量和接种量对菊粉外切酶酶活力的影响显著(p<0.05),其他因素在所考察的水平范围内对菊粉外切酶酶活无显著影响。本试验在Plackett-Burman(PB)试验结果的基础上,通过最陡