紫外分光光度法测定黑豆皮中花青素含量

紫外分光光度法测定黑豆皮中花青素含量

黑客是中国的传统农业品种。它有着悠久的食用和药用历史。自古以来，人们就使用黑豆来补充、活血和改善头发。黑豆皮,又称乌衣,富含大量花青素,主要以飞燕草素、矢车菊素为主,具有抗氧化活性、抑制诱变、抗炎、预防癌症以及延缓衰老等多种保健功效,一直是天然食用添加剂和健康保健食品的原料。我国是农业大国,从南到北很多省份都种植黑豆,资源丰富,可谓世界各国之首。在我国的北方,如天津市、河北省、山东省都有丰富的黑豆产量,但是由于产地不同,黑豆皮中的功效成分差异较大,因此本文在文献工作基础上,利用比色法测定不同产地黑豆皮中花青素的含量,从而进一步控制黑豆皮的质量,为其在食品添加剂和保健食品中的应用提供参考。1材料和方法1.1材料、试剂和设备1.1.1黑豆皮、黑皮黑豆皮原料:黄仁黑豆皮,产自湖北;青仁黑豆皮,产至东北,青扁黑豆皮,产自安徽;市售黑豆皮,产自山东滨州;内蒙黑豆皮,产自内蒙古。所有试验黑豆皮原料由天津市尖峰天然产物研究开发有限公司提供。1.1.2试剂飞燕草素标准品:挪威Polyphenols公司;无水乙醇、甲醇:均为分析纯,天津康科德化工有限公司;盐酸:天津大茂化工有限公司。1.1.3设备UV-2401PC:日本岛津公司;HZQ-QX型电动振荡机:东联电子技术开发有限公司。1.2方法1.2.1黑豆皮提取物的吸附剂分析用1%盐酸甲醇溶液配制少量黑豆皮提取液,用UV-2401PC紫外可见分光光度计200nm~600nm的范围内对色素进行扫描,得黑豆皮提取液的吸附光谱图。同时对标准品溶液在200nm~600nm的范围内进行扫描,得到飞燕草素标准品溶液的吸附光谱图。1.2.2标准曲线的测量1.2.2.标品溶液的配制精密称取飞燕草素对照品适量,用1%盐酸甲醇溶液溶解,定容在100mL容量瓶中,配制成85.211μg/mL的标准品储备液,备用。1.2.2.标准品储备液的稀释分别精密吸取2、4、6、8、10mL标准品储备液转移至100mL容量瓶中,用1%盐酸甲醇溶液稀释并且定容至刻度。在520nm下测定吸光度,测定标准曲线。1.2.3质量检测准确称取黑豆皮原料5g加入浸提液浸泡过夜,过滤,测定其体积为V。精密吸取1mL样品浸提液,置1000mL棕色容量瓶中,用1%的盐酸甲醇定容到刻度,以同批1%盐酸甲醇溶液作空白,置520nm处测定其吸收度。花青素含量利用1.2.2.2中的标准曲线进行测定。1.2.4黑豆皮中清除蓝色素的条件1.2.4.样品溶液配制准确称取黑豆皮5g,共4份,分别置于100mL三角瓶中,分别加入甲醇、95%乙醇,1%盐酸甲醇50mL和1%盐酸乙醇各50mL,浸提8h。按照1.2.3项下配制方法进行样品制备,测量其吸光度。通过对甲醇、95%乙醇、含有体积比例为1%盐酸的甲醇溶液和95%乙醇溶液进行考察,确定最佳提取溶剂。1.2.4.盐酸甲醇溶液体积分数为5.5%盐酸甲醇溶液体积分数准确称取黑豆皮5g,共5份,分别置于100mL三角瓶中。分别加入甲醇50mL、0.5%盐酸甲醇溶液(体积分数)50mL、1%盐酸甲醇溶液(体积分数)50mL、1.5%盐酸甲醇溶液(体积分数)50mL、2%盐酸甲醇溶液(体积分数)50mL,浸提8h。按照1.2.3项下配制方法进行样品制备测量其吸光度。1.2.4.样品前提取时间的确定准确称取黑豆皮5g,共6份,分别置于100mL三角瓶中,精密加入1%盐酸甲醇50mL。6份样品,密封状态下进行提取,提取时间分别为1、2、4、6、8、10h。然后按照1.2.3项下配制方法进行样品制备,测量其吸光度。1.2.4.盐酸甲醇浸提液的制备准确称取黑豆皮5g,共5份,分别置于100mL三角瓶中。分别加入1%盐酸甲醇10、25、50、75、100mL。密闭状态下进行浸提8h。然后按照1.2.3项下配制方法进行样品制备,测量其吸光度。1.2.5加样回收率的测定精密称取已知含量的供试品原料5g,准确加入与供试品中花青素含量相同的飞燕草素对照品,按照1.2.4中确定的提取方法进行提取,按1.2.3项下确定的方法准确测定,计算平均回收率。1.3提取方法的确定分别准确称取不同产地的黑豆皮5g,按照1.2项下确定的最优提取方法进行提取,按照1.2项下的含量测定方法进行含量测定。每个产地的黑豆皮平行测定3次。2试验结果2.1花青素类色素的吸收峰图1a是黑豆皮提取物在1%盐酸甲醇溶液中的吸收光谱,从光谱中可以看出黑豆皮提取物分别在520、362、279、205nm处有吸收峰,而520nm为花青素类色素的特征吸收峰。图1b是标准品飞燕草素在1%盐酸甲醇溶液中的吸收光谱,从光谱中可以发现其在520、360、280nm处有吸收峰,综合分析后,选择520nm作为黑豆皮提取物中花青素吸收度的检测波长。2.2标准曲线的测量和方法研究2.2.1标准曲线的绘制按照1.2.2.2项下方法进行测定,结果如图2所示。标准曲线为A=0.0943x,(x表示为测试溶液的浓度,单位为μg/mL),r=0.9996(n=5),该标准曲线在浓度为1.7μg/mL~8.5μg/mL的范围内线性良好。2.2.2准确度的测量吸取标准品溶液1mL,按1.2.2.2项下的方法进行精密度测定,RSD=0.21%(n=6),本方法的精密度良好。2.2.3测定吸光度值吸取供试品溶液1mL,分别在2、4、6、8、10h后测定吸光度值。试验结果表明:在0~10h内稳定性良好,RSD=0.23%。2.2.4方法重现性测定准确称取同一产地的黑豆皮5份,每份5g。按1.2.4项下确定的方法进行提取,再按1.2.3项下方法进测定,实验结果显示,该方法重现性良好,RSD为0.74%(n=5)。2.3黑豆皮中清除蓝色素的条件2.3.1提取溶剂的选择不同溶剂的浸提结果见表1。表1测试结果显示采用1%的盐酸甲醇溶液作为提取溶剂时,吸光度最高,说明具有很好的提取效果。因此本试验采用1%的盐酸甲醇作为提取溶剂。2.3.2盐酸对提取效果的影响不同盐酸浓度的浸提结果见表2。测试结果如表2,在相同提取时间条件下,随着盐酸浓度的增加,测试溶液的吸光度值也在增高。说明酸度的增加会提高提取收率。但是从1%~2.5%的酸度变化,提取溶液的吸光度值增加并不明显,因此确定提取溶液盐酸浓度为1%。2.3.3不同浸提时间和提取时间对吸光度值的影响不同时间的浸提结果见表3。如表3所示,浸提时间达到8h时,吸光度值达到最高,而且随着提取时间的增加,吸光度值达到稳定。因而确定浸提时间为8h。2.3.4最佳料液比的确定不同料液比的浸提结果见表4。通过对不同料液比的考察,结果如表4所示,料液比为1∶10时,吸光度值达到最高,因而确定最佳料液比为1∶10。2.4样品回收率的测定按照1.2.5项下确定的方法准确测定,平均回收率为98.34%,RSD=2.32%(n=5)。2.5加标回复加量测定结果按照1.2.4项下确定的提取方法进行含量测定,结果如表5所示。分析结果如表5所示,市售的黑豆皮其花青素含量相对较低,而安徽产的青扁黑豆皮花青素含量相对较高。3品种间