五指毛桃水提取物和醇提物的量效关系比较

五指毛桃水提取物和醇提物的量效关系比较

第五指毛桃是黑莓科植物的粗叶榕树。它尝起来又冷又甜，性质温和。具有益气健脾、益肺、补水健筋的功效。属于补药类，在人们中被广泛使用。我相信它会对类似于黄黄子的补气和恢复起到同样的作用。本文从抗应激、免疫调节及补血三个方面来研究比较五指毛桃不同提取物的补益作用,现报道如下。1材料和机器1.1实验动物SPF级KM小鼠,体质量18~22g,由广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK粤2003-0001。1.2毛桃醇提物的制备五指毛桃、黄芪购于采芝林药店,经鉴定均为正品。五指毛桃、黄芪水提液的制备方法:取五指毛桃、黄芪的干燥药材,用10倍量(M/M)蒸馏水浸泡1h后,加热煮沸1h,趁热滤取药液;再加8倍量水,煮沸30min,合并两次滤液,浓缩至2g/mL备用,用时加蒸馏水稀释至所需浓度。五指毛桃醇提物的制备方法:取五指毛桃干燥药材,用10倍量95%乙醇浸泡1h后,冷凝回流2h,趁热滤取药液;再加8倍量95%乙醇回流提取1h,合并两次滤液,用薄膜蒸发仪减压回流浓缩至生药含量2g/mL,用时加蒸馏水稀释至所需浓度。无水葡萄糖由天津市大茂化学试剂厂生产,批号060211。钠石灰、柠檬酸、柠檬酸三钠、碳酸钠均由广州化学试剂有限公司生产,批号分别为060101-1、20060503-2、20070104-2、20030326。二硝基氯苯由上海试剂一厂生产,批号20000101。醋酸泼尼松由广东华南药业有限公司生产,批号071104。1.3仪器、仪器和培养箱MEK-6318K血球记数仪由日本光电公司生产;PeriFlux5000激光多普勒血流监测仪由瑞典Perimed公司生产;UNICO7200型可见分光光度计由尤尼柯上海仪器有限公司生产;AnkeTGL-16G型高速离心机由上海安亭科学仪器厂生产;WGP-450型隔水式电热恒温培养箱由上海跃进医疗器械厂生产;CU-600型电热恒温水箱由上海一恒科技有限公司生产。2对小鼠免疫功能的影响2.1五指毛桃不同提取物对小鼠抗应激的影响2.1.1抗疲劳实验:KM小鼠,雌雄各半,随机分成6组:空白组,黄芪水提物组(10g/kg),五指毛桃水提物高(20g/kg)、低剂量组(5g/kg),五指毛桃醇提物高(20g/kg)、低剂量组(5g/kg),灌胃给药,1次/天,连续6d。空白组给予等容积蒸馏水。末次给药后1h,在小鼠尾根部束一个相当于小鼠体质量10%的铁环,将小鼠放入水深20cm、水温20℃±1℃的水池中,记录小鼠从开始游泳至体力耗竭的时间,以小鼠头部沉入水中10s不能浮出水面为体力耗竭。2.1.2耐常压缺氧实验:分组及给药同“2.1.1”项。末次给药后1h,将小鼠放入盛有5g钠石灰的等容积带胶塞的玻璃瓶内,每次每组1只,将瓶口密封计时,以停止呼吸为指标观察小鼠存活的时间。2.1.3耐脑缺血缺氧实验:分组及给药同“2.1.1”项。末次给药后1h,用剪刀齐耳断头,立即计时观察断头后小鼠口开合的持续时间。2.2五指毛桃不同提取物对小鼠免疫功能的影响2.2.1对巨噬细胞吞噬能力的影响:KM小鼠,雌雄各半,随机分成7组:空白组,模型组,黄芪水提物组(10g/kg),五指毛桃水提物高(20g/kg)、低剂量组(5g/kg),五指毛桃醇提物高(20g/kg)、低剂量组(5g/kg)。除空白组外,其他各组小鼠上午灌胃给予30mg/kg醋酸泼尼松,下午空白组和模型组灌服等容积的蒸馏水,其他组小鼠灌胃给予相应药物,连续12d。末次给药后30min,尾静脉注射25%中华墨汁生理盐水溶液10mL/kg,分别于注射后2min和12min,用毛细玻管(预先用肝素钠溶液润湿)眼球取血1~2滴,用微量进样器吸20μL溶于5mL0.1%Na2CO3溶液中,摇匀后于紫外分光光度计680nm下比色,测光密度D(λ)值计算廓清指数K。廓清指数Κ=logD(λ)2-logD(λ)12Τ12-Τ2D(λ)2、D(λ)12分别为2、12min时的光密度;T12、T2分别为时间12、2min。2.2.2对血清溶血素抗体水平的影响:分组同“2.2.1”项。除空白组外,其余各组小鼠先腹腔注射5%生理盐水鸡红细胞悬液0.2mL/只进行免疫,然后灌胃给药,连续12d,空白组和模型组给等容积蒸馏水。末次给药后1h,各组小鼠摘眼球取血,3000r/min离心10min,取30μL血清用生理盐水稀释100倍,取稀释后的血清1mL,与5%生理盐水鸡血细胞混悬液0.5mL,10%补体0.5mL混合,在37℃恒温箱中保温30min后,0℃冰箱中止反应,然后离心,取上清液于分光光度计540nm处比色,测D(λ)值,另设不加血清的空白对照,取其上清液作为比色时调零的基准。2.2.3对皮肤迟发性过敏反应的影响:分组同“2.2.1”项。除空白组外,其余各组均用20%二硝基氯苯丙酮溶液20μL/只涂于小鼠右耳致敏,致敏后的第5d各组小鼠开始灌胃给予相应药物,每天1次,连续12d。致敏后第12d将2.5%二硝基氯苯丙酮溶液20μL/只涂于小鼠右耳进行攻击,24h脱颈椎处死小鼠,剪下两耳,用打孔器在两耳相同位置打下耳部皮肤,分别称量质量,求两耳的质量差。2.3五指毛桃不同提取物对贫血小鼠的影响2.3.1对失血性贫血小鼠的影响:分组同“2.2.1”项。除空白组外,其他各组小鼠于第1、4、7天眼眶放血7~8滴(约0.3mL)。造模第1天开始灌胃给药,连续16d,空白组、模型组给予等容积蒸馏水。末次给药后1h,小鼠眼球取血用EDTA抗凝测Hb及RBC。2.3.2对环磷酰胺所致小鼠贫血的影响:分组给药同“2.2.1”项。除空白组外,其他各组小鼠于实验的第1天腹腔注射环磷酰胺100mg/kg致骨髓造血功能抑制建立贫血模型,连续给药16d,空白组、模型组给予等容积的蒸馏水。末次给药后1h,眼球取血用EDTA抗凝测Hb及RBC。2.4统计学处理实验数据用ˉx±s表示,结果用SPSS11.5统计软件进行t检验分析。3结果3.15-指毛桃提取的不同对大鼠的抗抑郁作用3.1.1毛桃醇提物对小鼠称重游泳时间的影响结果如表1所示,与空白组比较,黄芪水提物组小鼠负重游泳时间明显延长(P<0.01);五指毛桃醇提物高、低剂量组效果明显(P<0.05或P<0.01);水提物高、低剂量可延长小鼠负重游泳时间,但与空白组比较无显著性差异(P>0.05)。提示五指毛桃醇提物增强小鼠负重游泳耐力的作用比水提物更明显。3.1.2不同水提物对小鼠耐u3000活性染料耐从量组织中,对小鼠耐ue结果如表2所示,与空白组比较,五指毛桃醇提物高剂量能明显延长小鼠耐常压缺氧存活时间(P<0.05),效果与10g/kg的黄芪水提物相当;醇提物低剂量组及水提物高、低剂量组与空白组比较均无显著性差异(P>0.05),但醇提物低剂量组对小鼠耐常压缺氧存活时间的影响大于水提物高、低剂量组。提示五指毛桃醇提物抗缺氧作用比水提物更明显。3.1.3毛桃水提物对小鼠断头后呼吸道行为的影响结果如表3所示,与空白组相比,五指毛桃醇提物高、低剂量均能显著延长小鼠断头后喘息时间(P<0.01),效果与10g/kg剂量的黄芪水提物相当;五指毛桃水提物高、低剂量对小鼠断头后喘息时间的影响不大(P>0.05),但也有一定的效果。提示五指毛桃醇提物抗缺血缺氧的作比水提物用更明显。3.25-指毛桃提取的不同对大鼠免疫功能的影响3.2.1毛桃醇提物对炭粒廓清指数的影响结果如表4所示,与空白组比较,模型组小鼠碳粒廓清指数显著降低(P<0.01),表明模型建立成功。与模型组比较,五指毛桃醇提物高剂量组炭粒廓清指数明显增大(P<0.05),但效果不及黄芪水提物;醇提物低剂量与水提物高、低组具有增大廓清指数的趋势,其中醇提物低剂量组对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响大于水提物高、低剂量组,3个组与模型组比较均无统计学差异(P>0.05)。提示五指毛桃醇提物调节免疫功能的作用大于水提液。3.2.2各组小鼠血清抗体检测结果结果如表5所示,经鸡红细胞免疫后,模型组小鼠血清中的抗体水平明显提高,D(λ)值显著大于空白组(P<0.01),表明模型建立成功。与模型组相比,其余给药组均有增加血清抗体的作用,其中黄芪水提物及五指毛桃醇提物高、低剂量效果极为显著(P<0.01),其次为五指毛桃水提物高剂量组(P<0.05),水提物低剂量组影响较小(P>0.05)。提示五指毛桃醇提物提高血清溶血素抗体水平的作用大于水提物。3.2.3毛桃醇提物对耳水肿度的影响结果如表6所示,与空白组比较,用DNCB致敏后,模型组小鼠耳肿胀程度明显增强(P<0.01),表明模型建立成功。与模型组比较,五指毛桃醇提物高、低剂量组均可明显增加耳肿胀度(P<0.05或P<0.01);水提物高、低剂量组有增加耳肿胀度的趋势,但影响不大(P>0.05)。提示五指毛桃醇提物增强皮肤迟发性过敏反应的作用大于水提物。3.35-指不同提取的毛桃对贫困学生大鼠的影响3.3.1模型成功后小鼠rbc和失血性开发出的小鼠结果如表7所示,与空白组比较,模型组RBC显著降低(P<0.01),Hb明显减少(P<0.05),表明失血致小鼠贫血模型成功。五指毛桃水提物和醇提物组均有提高失血性贫血小鼠RBC的趋势,但与模型组比较均无差异性(P>0.05);与模型组比较,五指毛桃醇提物高、低剂量及水提物高剂量均能明显提高Hb(P<0.05),水提物低剂量组影响不大(P>0.05);水提物对RBC及Hb的影响总体不及醇提物。提示五指毛桃醇提物对失血所致贫血小鼠的补血作用优于水提物。3.3.2对小鼠血红蛋白nd活性的影响结果如表8所示,与空白组比较,模型组小鼠RBC和Hb水平明显降低(P<0.01),说明环磷酰胺致小鼠贫血模型成功。与模型组比较,黄芪水提液组、五指毛桃醇提物高、低剂量组均明显增加RBC和提高Hb(P<0.05或P<0.01);水提物高、低剂量组有增加RBC和提高Hb的趋势,但影响不大(P>0.05)。提示五指毛桃醇提物对环磷酰胺所致贫血小鼠的补血作用优于水提物。4醇提物和黄芪的临床使用效果五指毛桃是一种食药同源的植物,在两广地区民间用于煲汤,称为“南芪”。前期研究表明,五指毛桃水提物具有调节免疫功能、抗应激及补血的作用。近年来有文献报道证明补骨脂素为五指毛桃的主要活性成分之一,分离鉴定出的补骨脂素为呋喃香豆素类化合物,具有抗菌、抗病毒、抗凝血、抑制肿瘤、免疫调节等作用,并对红细胞系统的造血有一定的促进作用,而乙醇提取法能有效提取补骨脂素和佛手内酯等成分。应激是机体处于各种不利的内、外环境条件下所进行的一系列反应。疲劳、缺氧、缺血是常见的3种应激原,通常作为反映药物抗应激能力的重要指标。巨噬细胞吞噬能力、血清溶血素抗体水平、皮肤迟发性过敏反应通常用来反映药物对机体非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫的影响。失血性贫血和骨髓抑制性贫血模型则通常用来反映药物改善贫血的作用。实验结果表明,五指毛桃醇提物能提高免疫低下小鼠炭粒廓清指数,提高小鼠血清溶血素水平及增强小鼠皮肤迟发性过敏反应;能够延长小鼠耐缺氧存活时间、负重游泳时间及断头后喘息时间;能够提高失血性贫血及骨髓抑制性贫血小鼠的红细胞数量RBC和血红蛋白Hb含量。五指毛桃水提物和醇提物相比较,醇提物在抗应激、调节机体免疫功能及改善贫血方面均