酵母基因工程

酵母基因工程酵母基因工程的发展现状酿酒酵母自身的改造（1） 将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母（2） 将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母（3） 将8—葡聚糖酶基因导入酵母（4） 将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒酵母体内表达（5） 将人血清清蛋白（HAS）的基因转化到酿酒酵母2酵母表达异源蛋白（1）表达水平（2）表达质量2酵母基因工程的发展趋势（1） 解决酵母基因工程中还存在的缺陷（2） 在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向（3） 利用酵母基因工程筛选更多新药（4） 改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本（5） 酵母的生理承受极限研究引起人们的关注3发展历程1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生牛一酿酒酵母全基因组的测序。酵母基因工程的优点安全无毒，不致病；有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作；容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率；培养条件简单，容易进行高密度发酵；能将外源基因表达产物分泌到培养基中；有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能酵母表达系统（1）酵母表达载体①载体的基本构架：大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。原核部分：大肠杆菌中复制的起点序列（ori）和抗生素抗性基因序列。酵母部分：1酵母菌中维持复制的元件：2p质粒复制起点；自主复制序列（ARS）；整合型载体的整合介导区。2营养缺陷型基因序列、抗生素抗性基因序列3基因启动子和终止子序列4信号肽序列②载体的复制形式附加型载体：在酵母染色体外自主复制1酿酒酵母2p质粒的DNA的复制元件所构建的2酵母基因组DNA的自主复制序列ARS所构建的整合型载体：随同酵母染色体一起复制1含有与受体菌基因组有某种程度同源性的一段DNA序列，介导载体与宿主染色体之间发生同源重组。2常用的外源基因整合靶位点：rDNA宿主广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)克鲁维酵母属乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)毕赤酵母属巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)裂殖酵母属非洲酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)汉逊酵母属多态汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想酵母DNA转化原生质体法:早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%离子溶液法:酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子(如Li+等)、PEG、热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA。103~104个转化子々gDNA电穿孔法(electroporation)和粒子轰击法(particlebombardment):酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA。105个转化子々gDNA酵母分泌外源蛋白的糖基化1酿酒酵母分泌的多数外源蛋白均是过度糖基化的(>40个甘露糖残基)；2巴斯德毕赤酵母分泌表达糖蛋白的寡糖链平均长度约为8~14个甘露糖残基3解脂耶氏酵母外源蛋白金含短的寡糖链(8~10个甘露糖残基)酿酒酵母分泌的外源糖蛋白不适合作为药物治疗使用。四、酿酒酵母表达系统(1)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)酿酒酵母是发酵工业中的主要生产菌株，是最先建立的酵母表达系统。应用：乙型肝炎疫苗、人胰岛素、粒细胞集落刺激因子酵母表达系统的不足•较难进行高密度发酵：发酵时产生乙醇，影响生长代谢和基因产物表达；•蛋白质的分泌表达能力较差；•蛋白质的加工过程发生过度糖基化作用。表达盒式结构组成:•启动子常用乙醇脱氢酶启动子(Padh1)和半乳糖诱导型启动子(Pgal)。•分泌信号用酿酒酵母自身。-交配因子的分泌信号•终止子用CYC1基因的转录终止子(2)、巴斯德毕赤酵母表达系统1、 巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢徐径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。应用：乙型肝炎表面抗原、肿瘤坏死因子、表皮生长因子和链激酶2、 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点启动子强并受甲醇严格诱导，可用于调控外源基因的表达；能对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、折叠和修饰，糖基化接近高等真核生物；外源DNA的转化、基因替换、基因敲除等操作简单易行，外源蛋白的表达量比酿酒酵母增加10〜100倍；容易进行工业化生产，高密度培养干细胞可达100g/L以上。3、 巴斯德毕赤酵母的整合型载体启动子•基因AOX1的启动子(Paox1)，在它控制下的外源基因在甲醇诱导时能得到高效表达；•三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pgap),组成型启动子，不需甲醇诱导，外源基因表达量高。选择标记•对应于营养缺陷型受体的野生型基因：HIS4(组氨醇脱氢酶基因)；ARG4(精氨酸合成酶基因)；TRP1(色氨酸合成酶基因)；URA3(尿嘧啶合成酶基因)。•抗性选择标记：抗生素G418抗性基因和Zeocin抗性基因信号肽序列•由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号a-交配因子4、 巴斯德毕赤酵母受体菌X-33为野生型毕赤酵母。GS115为HIS4突变型，是使用最广泛的巴斯德毕赤酵母宿主菌，含甲醇利用AOX1和AOX2基因，甲醇利用能力与野生型一样。KM71为HIS4突变型,A0X1基因缺陷的菌株，在甲醇培养基中生长缓慢，广泛用于多种外源基因的表达。5、 转化方式转化之前，将表达载体酶切线性化，使之整合于酵母基因组A0X1或HIS4基因位置，随酵母生长稳定存在。转化方法：原生质体法、电击法、LiCl2和PEG法6、 整合方式5’AOX1能与染色体发生同源重组，使受体染色体带有一个拷贝的外源基因；染色体A0X1区与载体质粒A0X1区发生单位点互换；染色体HIS4基因与载体的HIS4基因发生置换。7、 获得高拷贝数整合转化子的方法不同的转化方法导致产生天然高拷贝转化子。原生质体法转化使细胞群中产生多拷贝转化子频率相对较高；体外在载体上多次插入目的基因片段；将载体中目的基因两端连上来自宿主rDNA或其他非必需高重复的基因片段，通过同源重组而达到高拷贝整合的目的；利用基因的功能筛选高拷贝整合。8、 巴斯德毕赤酵母菌株的培养条件在甘油作碳源的培养液中，细胞迅速生长，菌体密度逐渐增大，但外源