青海省棘球感染状况及系统发育树的构建

青海省棘球感染状况及系统发育树的构建

甲壳动物病是由甲壳动物昆虫引起的，在全世界范围内广泛传播，并在许多国家造成严重的公共卫生问题和经济损失。其中由细粒棘球蚴引起的囊性包虫病在全球范围流行,是引起严重公共卫生安全的疾病。中国是包虫病的高发国家之一,包虫病在我国西北大部分地区已达到了较高的流行水平,并且98%的包虫病是由细粒棘球绦虫引起的,2005年在青藏高原东部的石渠县发现了一个新的棘球绦虫种,即石渠棘球绦虫。通过已有分子生物学研究,细粒棘球绦虫种内基因型存在差异,并且有10种基因型已被鉴定,而基因的多态性反映了各种不同基因型绦虫在生活史、宿主专一性、进化速度、致病性、抗原性和药敏性等方面的一些特性。因此,在控制包虫病流行的措施中,确定不同种和同一个种不同的基因型是最基本的也是最重要的。本实验对采集到的部分藏羊、牦牛和高原鼠兔包囊的线粒体部分CO1基因和ND1基因进行分析,确定了感染青海省牛羊的棘球蚴为细粒棘球蚴普通羊株(G1型),而高原鼠兔肺脏分离到的棘球蚴为石渠棘球蚴。1材料和方法1.1鼠兔目的分离株选取从青海省祁连县、贵南县、泽库县、兴海县和玉树县采集的牦牛棘球蚴分离株7个,藏羊棘球蚴分离株3个,称多县采集的高原鼠兔棘球蚴分离株1个。所采集的棘球蚴用0.9%生理盐水清洗后,于塑料袋中加入75%酒精,保存,待检。1.2主试剂1.3内脏器器官观察在祁连县、贵南县、泽库县和玉树县的屠宰厂,肉眼观察藏羊和牦牛的内脏器官并以手触摸藏羊、牦牛的肝脏和肺脏,计数棘球蚴包囊及钙化灶,计算感染率及感染强度,在实验室将包囊直径≥2cm的包囊,用1mL注射器抽取囊液,镜检有无原头蚴。1.4高原大鼠1911年感染调查在青海省称多县,捕捉高原鼠兔,剖检,观察肺脏、肝脏及腹腔器官,详细记录检查结果,计算感染率和感染强度。1.5dna提取包囊生发层总DNA的提取按照QIAampDNAMinikit试剂盒说明书进行。提取的DNA保存在-20℃冰箱中备用。1.6引物的基因分析采用文献的引物,引物由日本宫崎大学提供。设置体积为25μL的反应体系:2×PCRMaster缓冲液12.5μL,10pmol/μL上下游引物各1μL,基因组DNA5μL,用双蒸水补足体积。CO1基因反应条件:95℃10min,94℃1min、48℃1min、72℃1min,35个循环,72℃10min。ND1基因反应条件:95℃10min,94℃30s、52℃30s,72℃1min,35个循环,72℃10min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,将PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。1.7pcr扩增分析用MEGA5.0软件中的ClustalW法对同一基因序列进行比较分析,CO1和ND1基因序列与GenBank中线粒体DNA序列进行同源性比较,鉴定分离株基因型。应用MEGA5.0软件中的UPGMA法构建系统进化树。以牛带绦虫作为外群。2结果2.1土壤中木纳格氏兔病理变化本实验共检查藏羊254只,平均感染率为52.30%(表1),检查牦牛465头,平均感染率为36.77%(表2),检查高原鼠兔145只,共有6只感染棘球蚴,感染强度为1~3,平均感染率为4.14%,藏羊棘球蚴的感染率要高于牦牛,并且高原鼠兔棘球蚴感染率要显著低于藏羊和牦牛。2.2囊内检出原头本实验中共检出7个藏羊包囊直径≥2cm,囊内检出原头蚴的有5个;共检出32个牦牛包囊直径≥2cm,囊内检出原头蚴的有1个(表3)。2.3石渠木砂株3.细粒棘球蚴分离株(藏羊和牦牛)和石渠棘球蚴分离株(高原鼠兔)扩增的片段分别为324bp和395bp。其中10个细粒棘球蚴普通羊株(G1型)存在2类不同的基因序列,与GenBank中检索到的G1型细粒棘球绦虫mtDNA完整序列(AF297617)CO1基因区域相比存在T7220C和G7355T的点突变,变异率为0.3%~0.6%。石渠棘球蚴基因序列与GenBank中检索到的石渠棘球绦虫mtDNA完整序列(AB208064)CO1基因区域相比存在A9938G和G10313A的点突变,变异率为0.5%。细粒棘球蚴与石渠棘球蚴种间变异率为9.2%~9.3%。2.4gg3基因序列细粒棘球蚴分离株(藏羊和牦牛)和石渠棘球蚴分离株(高原鼠兔)扩增出的目的片段长度分别为428bp和440bp。10个细粒棘球蚴普通羊株(G1型)存在5类不同的基因序列,与GenBank中检索到的G1型细粒棘球绦虫mtDNA完整序列(AF297617)ND1基因区域相相比,1类基因序列未发生碱基突变,另4类基因序存在T5392C、G5400A、G5471A、T5331A和T5629A的点突变,变异率为0.2%~0.4%。石渠棘球蚴与GenBank中检索到的石渠棘球绦虫mtDNA完整序列(AB208064)ND1基因区域相比存在T7798C、C7849T、T7897C、T7945A和T8089C5的点突变,变异率为1.4%。细粒棘球蚴与石渠棘球蚴种间变异率为21.8%~22.7%。2.5系统发育树的建立本实验所获得的CO1基因序列和ND1基因序列结合GenBank收录的棘球绦虫/蚴序列,组建了CO1基因和ND1基因系统进化发育树(图1,图2)。进化树分析显示,所检测牦牛和藏羊棘球蚴与G1型细粒棘球绦虫在同一个分支,高原鼠兔肺脏寄生棘球蚴与石渠棘球绦虫在同一个分支。3本地区积极发展积极健康的土地资源本研究流行病学调查结果显示,藏羊棘球蚴的感染率高于牦牛,高原鼠兔棘球蚴感染率最低,仅为4.14%。对藏羊和牦牛育囊的比较研究发现藏羊育囊所占比例要远远高于牦牛育囊所占比例,证实藏羊是细粒棘球蚴最适宜的中间宿主。高原鼠兔的感染率虽然远低于家畜的感染率,但其在青藏高原上分布广泛,种群数量极大,不仅作为野生肉食动物和放牧犬的捕食对象同时也与藏羊、牦牛长期共存于同一片草场,这就可能成为家畜、人和野生动物之间棘球绦虫传播的媒介,使棘球绦虫在青藏高原的流行状况更加复杂。通过所测CO1基因和ND1基因核酸序列分析可见,所检测的藏羊和牦牛棘球蚴均为细粒棘球蚴普通羊株(G1型),与非洲、欧洲、南美洲和亚洲其他地区细粒棘球绦虫普通羊株相比,有个别碱基位点发生突变,突变率低,仅为0.3%~0.6%,青海省流行细粒棘球绦虫具有广泛性与普遍性。所测得的一株石渠棘球蚴的碱基位点变异率要远远高于细粒棘球蚴的碱基位点变异率,与肖宁等报道的结果相符。本次研究结果显示青海省上述地区藏羊和牦牛棘球蚴病流行比较广泛和普遍,并且以细粒棘球绦虫普通羊株(G1型)为主,高原鼠兔不仅是石渠棘球绦虫