栽培杏鲍菇和草鱼菌渣堆肥过程中微生物强化的研究

栽培杏鲍菇和草鱼菌渣堆肥过程中微生物强化的研究

蘑菇是世界上的第三种细菌，在中国排名第一，主要分布在中国。草菇的人工栽培起源于我国,在距今300年前就已经开始人工栽培,20世纪30年代才由我国传入世界各地。随着草菇人工栽培行业,特别是工厂化栽培的快速发展,草菇栽培废弃物也大量产生。然而,如何对草菇栽培菌渣进行环保有效的处理却一直没有得到很好的解决。传统的处理方法是对其进行燃烧或丢弃,燃烧只能快速取得其中10%左右的热能,是对资源的不合理利用,同时也是极大的浪费。笔者曾报道过利用杏鲍菇工厂化栽培的菌渣进行草菇再栽培的技术,该技术已经得到产业化实现,但草菇栽培后的菌渣利用问题却一直难以解决。因为经过2种食用菌的栽培生长,每种菌类最高3茬的采收,原有基质中较易被利用的营养成分已经很少。但本着对生物资源利用最大化和环境友好的食用菌行业可持续发展原则,仍有可利用价值。本研究利用草菇栽培后的废弃物为原料,分析经杏鲍菇和草菇栽培后的菌渣主要营养成分,考察了菌渣进行2种固氮菌和溶磷菌强化的生物堆肥过程中温度、pH值、E4/E6值对堆肥的影响,堆肥过程中全氮、磷、钾和速效氮、磷、钾的动态变化情况,以期为菌渣废弃物的“综合、生态、循环、经济”利用提供科学支撑。1材料和方法1.1固氮菌的获得堆肥材料为草菇栽培后的菌渣,主要是棉籽壳、木屑、麸皮等的混合物,经自然风干后粉碎备用。堆肥发酵的固氮菌(CGMCC1.233和CGMCC1.142)均来自于中国微生物菌种保藏中心;溶磷菌(ATCC14581和DSM3228)分别来自于美国模式培养物集存库和德国微生物菌种保藏中心。1.2分析1.2.1测定指标及方法各成分的分析均按照国家标准方法测定,粗蛋白测定按照GB/T5511—2008;粗脂肪测定按照GB5512—2008;粗纤维测定按照GB6434—86;灰分测定按照GB5505—2008;有机碳测定按照HJ615—2011;全氮测定按照GB/T5511—2008;钙测定按照GB/T5009.92—2003;磷测定按照GB/T6434—2002。1.2.2ph值、e4/ec值的测定温度测定:每日定时在堆肥体的上、中、下3点测定堆体温度2次,取其算数平均值。pH测定:每日取样10g,添加无菌水按固液比1∶10混匀,160r/min离心10min,取上清液测定pH值。E4/E6值测定:吸取上述pH测定中的清液在波长465nm和665nm下测定OD值,其比值即为E4/E6值。菌肥有效菌数测定:在10、30、50、70、100和130d,用稀释平板计数法测定有效菌数。1.2.3全体积肥料的测定、氮、磷、钾的有效测定速效氮、全氮、全磷和全钾按照文献的方法测定,速效磷参照NY/T300-1995、速效钾参照NY/T301-1995测定。1.3实验处理设计及有机肥生产1.3.1堆肥的发酵及培养将菌种CGMCC1.233、CGMCC1.142、ATCC14581、DSM3228进行扩大培养16～24h后,在波长600nm下测定OD值(当OD值>0.5,即认为活菌数>108),并用无菌水调节使各菌液至OD值相同。每次处理载体150kg,用无菌水50L进行浸润并调节湿度,随后接入调节好的菌液30L,充分搅拌混匀,用塑料薄膜覆盖密封。在密封膜表面均匀扎若干个通气孔,将堆肥体环境温度控制在约28℃保持7d,然后置于常温下堆肥发酵即可。堆肥的4种发酵菌保藏及扩大培养基均采用PDA培养基。对照菌肥制作与接种菌肥相似,区别为利用自来水调节菌肥湿度,不用塑料薄膜覆盖密封整个堆肥体,整个堆肥管理期调节湿度也用自来水调节。1.3.2堆肥的保护堆肥管理:在堆制的第5、18、28、38、48、60d进行人工翻堆。在堆置过程中每天观察水分的散失情况,保持堆肥含水量在50%左右,如果水分过低,立即补水,堆置2个月。采样:在堆置前及每次翻堆时采样,从堆体上、中、下3个点进行采样,每个点采样约200g左右,混合均匀,从中取200g左右,平均分成2份。一份风干进行含水量测定,一份立即进行各项指标的测定。1.3.3堆肥发酵处理为考察草菇菌渣在不同接种菌处理条件下的温度、pH、E4/E6值、全氮、磷、钾和速效氮、磷、钾的变化情况,本研究将所有堆肥发酵处理都分为4种,分别为不接种任何菌的自然发酵对照(CK;下称:不接菌)、接种2种固氮菌(CGMCC1.233和CGMCC1.142;下称:N)、接种2种溶磷菌(ATCC14581和DSM3228;下称:P)和接种所有固氮菌与溶磷菌(CGMCC1.233、CGMCC1.142、ATCC14581和DSM3228;下称:N+P)。2结果与讨论2.1不同成分的对比试验结果为进一步综合利用草菇栽培菌渣,达到循环利用的目的,对其进行营养成分的分析,揭示草菇栽培菌渣再利用的物质基础。草菇栽培菌渣的粗脂肪、粗蛋白、粗纤维、钙、磷等成分的分析结果见表1。从表1的结果可以看出,草菇栽培菌渣的营养成分与稻草相比,有机碳、全氮、粗蛋白和钙、磷等成分都具有优势,粗脂肪和粗纤维等弱项指标差别不大。另一方面,草菇菌渣的碳氮比约为40∶1,这为溶磷菌和固氮菌的生长提供了有利条件,也为实现下一步的堆肥实验提供了相应基础。因此,将草菇菌渣的链式再利用,无论是从营养成分含量,还是在营养结构上都是可行的。2.2不同菌种堆肥对堆肥温度的影响堆肥温度是反映发酵是否正常的最直接和敏感的指标。堆肥过程一般分为升温阶段、高温阶段和降温阶段。一个好的堆肥系统,其温度变化应为:堆肥48h之后,堆肥温度平稳上升到约50℃,之后保持在50～60℃之间,期间严禁突破70℃。高温维持时间的长短反映配方和原料的好坏,理想时间为5～10d,即可杀灭有害病原菌。高温阶段结束之后是二次发酵阶段,在这一阶段难降解有机质缓慢分解,堆肥逐渐趋于稳定,温度平稳下降。通过试验测得温度变化如图1。从图1中可以看出,添加2种固氮菌(N)、2种溶磷菌(P)、添加4种强化菌(N+P)和不接菌自然对照,在堆肥48h之后温度均能达到50℃并保持了至少5d。因此,草菇菌渣的堆肥处理是可行的,高温维持时间也较好,满足堆肥无害化的要求。从图1中还可看出,接种固氮菌的堆肥系统在发酵前期温度上升最快,并在环境温度低时,仍能保持较高温度,这说明固氮菌处理具有较好的保温作用。对照组在堆肥后期的温度要高于其他处理,可能是因为在堆肥第14～24d的降温天气中,受环境温度的影响较大,使得有机质没有得到充分的降解,而在降温阶段,即在二次发酵期间有机质大幅降解,导致温度再次升高。总的来说,各处理温度变化差异不大,不接菌对照相比其他3种接菌强化处理没有明显的差异,这就说明自然发酵能够在温度上保证发酵堆肥的正常进行。2.3堆肥对菌体ph值的影响pH值也是影响堆肥效果的重要因素之一,降解有机质的微生物大多在pH6.5～8.2的环境中生长,pH值过高或过低,都会影响堆肥的正常进行。在整个堆肥过程中,pH值的变化是含碳有机物所产生有机酸和含氮有机物所产生的氨共同作用的结果。通过试验测得pH值变化如图2。由图2可知,草菇菌渣堆肥的初期pH值较高,这主要是因为在栽培食用菌的配料中加入了石灰粉,其并未被完全分解。在堆肥初期,由于菌体繁殖较快,产生大量有机酸,导致4个处理的pH值均迅速下降。随着堆肥的进行,部分有机酸随着温度升高而挥发和微生物产生的氨会使pH值又上升,到后期pH缓慢上升并趋于稳定,这种变化趋势是堆体中微生物群落演替和主要代谢产物变化的结果。4种菌渣堆肥处理相比较,对照因为在发酵初期18d自然发酵的微生物种类多、适应性强,导致pH下降程度高于其他3种处理,但之后pH差别不大,这就说明自然发酵就能够满足堆肥有机质降解所需的pH条件。2.4堆肥的e4/ec由于堆肥的过程伴随着腐殖化,研究各腐殖化参数的变化是评价腐熟度的重要方法。腐熟度即堆肥中有机质经过矿化、腐殖化过程最后达到稳定的程度。本实验选择描述腐殖酸品质和芳构化程度的指标E4/E6值来评价堆肥腐殖化作用大小,E4/E6值不与腐殖酸分子数量有关,而与腐殖酸分子大小与分子的缩和度大小有直接关系,通常随腐殖酸分子量的增加或缩和度增大而减小。4种处理堆肥的E4/E6值变化如图3。由图3可知,4个处理的E4/E6值总体均呈降低趋势,符合腐殖化的规律。在堆肥初期(0～5d)4个处理差异较大,添加2种固氮菌(N)和对照的E4/E6值在5d后快速降低了近0.4,而添加4种菌(N+P)和对照的E4/E6值5d仅降低了约0.1。这说明在堆肥高温阶段,堆肥芳构化的速度由快到慢依次为N、CK、P、N+P。在堆肥后熟阶段,固氮菌处理的E4/E6值一直保持在最低水平,当堆肥进行到第46d之后,小分子化合物基本完全转化为大分子化合物,堆肥的腐殖化进程基本结束,E4/E6值趋于稳定。通常堆肥接种会加快腐殖化进程,但是与对照组相比,除了固氮菌处理有明显的加快腐殖化的作用以外,其余3个处理的变化均不是很明显,这些都说明不接菌的自然发酵对照就能够满足草菇堆肥腐殖化的要求。2.5各堆肥对各菌种初步堆肥的各疗效磷含量的影响在堆肥过程中,氮素被认为是影响微生物生长及其活性的限制性因素。微生物利用堆肥原料的有机物质合成自生细胞物质,同时堆肥原料中的难降解成分被降解。因此有必要对菌渣堆肥过程中的全N、P、K和速效N、P、K的变化进行分析,如图4。由图4可知,堆肥过程中全氮含量的变化差异不大,整体呈增加趋势,最高增加了79.91%(不接菌);全磷含量在堆肥结束时为对照组>N>P>N+P,分别比堆肥初期增加了132.62%、125.53%、14.89%和12.06%;全钾在堆肥初期呈上升趋势,之后下降速度各有不同,在堆肥结束时,对照组、溶磷菌(P)、4种菌(N+P)处理的钾含量分别下降了5.79%、7.37%、8.95%,而固氮菌(N)处理则增加了2.11%。由图4还可见,在堆肥初期,速效氮含量在第5d时达最高,之后下降,第48d后又开始上升。这种变化说明:堆肥初期,在微生物的作用下,原料中易降解有机物质剧烈降解,有机态的氮素通过氨化作用转变为铵态氮和酰胺态氮,这构成了堆肥初期速效氮的主体。之后氨化作用和硝化作用同时进行,铵态氮降低、硝态氮升高,同时由于高温作用,一部分铵态氮转变为氨气,因而速效氮含量略微下降。在堆肥46d时,微生物的硝化作用逐渐占主导,氨化作用逐渐停止,硝态氮的增加使得速效氮含量又呈上升趋势。在整个堆肥中,各个处理的速效磷含量曲折上升,没有明显的规律性差异。在结束时,各处理的速效磷含量分别增长了214.63%(2种溶磷菌P)、197.56%(4种菌N+P)、173.17%(CK)和170.73%(2种固氮菌N)。速效磷的增加主要由于堆肥初期微生物大量增殖,大量有机磷转化为微生物的细胞质,存储于核酸、磷酸等中,但随着微生物的生长消亡,这些有机磷被转化为可被植物吸收的速效磷;其二是通过解磷微生物对有机磷的矿化和无机磷的溶解,使菌糠中的磷转化成速效磷。4个处理在堆肥过程中速效K含量变化差异总体不如速效氮和速效磷显著,但也呈现上升趋势,分别比堆肥初期增长了36.22%(2种溶磷菌)、34.65%(2种固氮菌)、29.13%(CK)、16.54%(4种混合菌)。综上所述,4种处理的堆肥体全氮、磷、钾和速效氮、磷、钾含量的变化情况没有明显的规律,之间互有交叉,不接菌的草菇菌渣堆肥体没有显著的劣势,这就为自然发酵提供了科学的支撑。3菌渣添加固氮菌和溶磷菌通过对经杏鲍菇和草菇工厂化2次栽培后的菌渣成分分析发现,菌渣的有机碳、全氮、钙、磷和粗蛋白等含量较高,特别是碳氮比约为40∶1,相比普