附子和附片的质量控制

附子和附片的质量控制

附子为2005年中国药典的一个品种，包括盐附子、黑顺片和白附片。原标准采用分光光度法鉴别生物碱类成分,专属性较差,且不能区分毒性强的双酯型成分和毒性较弱的单酯型成分。采用薄层色谱法对乌头碱进行限量检查,方法较为粗放,难以有效控制质量。近年来,有关附子的研究屡见不鲜,但根据样品用途和生物碱类别同时对附子的安全性和有效性进行评价的质量标准研究尚未见报道。本实验首次根据样品不同情况,采用相应的指标测定附子和附片,可更全面地控制药材的质量,为《中国药典》2010年版附子和附片质量标准提高提供了实验依据。附子所含的双酯型生物碱毒性很强,经炮制加工,此类成分可转化为单酯型生物碱,毒性也随之减小。盐附子为炮制品淡附片的原料,不直接入药,且未经高温蒸煮加工,故以双酯型生物碱作为质量控制指标。另一方面,为防止炮制太过,导致双酯型生物碱较多转化为单酯型生物碱,故又建立了盐附子中单酯型生物碱限量检查方法。相反,黑顺片、白附片均经高温蒸煮加工而成,故以单酯型生物碱作为质量控制指标。另一方面,因两者均直接入药,需控制双酯型生物碱限量。本实验将盐附子与黑顺片、白附片分列,分别研究附子与附片的质量标准。建立了以新乌头碱、次乌头碱、乌头碱等双酯型生物碱和苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱等单酯型生物碱为指标的薄层鉴别方法,专属性强,色谱分离良好。建立的高效液相色谱法,可同时测定6种生物碱的含量,继而根据不同样品选择相应指标对附子和附片进行质量控制。1omat-5成分岛津LC-2010液相色谱仪(配备单波长检测器),MettlerAE240电子天平,ANDFX-200电子天平,高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司),FED-115烘箱,CAMAGLinomat-5半自动点样台,CAMAGREPORTSTAR薄层色谱摄像系统。硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂和烟台化学试剂公司),乙腈、四氢呋喃为色谱纯,异丙醇、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、冰醋酸、醋酸铵、氨水、正己烷、甲醇为分析纯,超纯水为RO-ZY-30型纯水机和Milli-Q纯水系统二次制备。黑顺片10批、白附片8批、盐附子8批(四川江油中坝附子科技发展有限公司)。新乌头碱(110799-200404)、次乌头碱(110798-200404)、乌头碱(110720-200410)对照品(中国药品生物制品检定所),苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱为自行制备,经标化纯度大于98%。2关于下层鉴定方法的研究2.1烷-乙酸乙酯-甲醇法固定相:硅胶G薄层板;展开剂:正己烷-乙酸乙酯-甲醇(6.4∶3.6∶1),氨蒸气饱和20min;显色剂:稀碘化铋钾试液,日光下检视。2.2对照品溶液的制备取新乌头碱、次乌头碱、乌头碱对照品(用于附子的鉴别)或苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品(用于附片的鉴别)适量,加异丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液制成每1mL各含1mg的混合溶液,作为对照品溶液。2.3供试品溶液的制备取本品粉末2g,加氨试液3mL润湿,加入乙醚25mL,25℃以下超声处理30min,滤过,取滤液低温回收溶剂至干,残渣加二氯甲烷0.5mL使溶解,作为供试品溶液。2.4薄层板下色谱点样的测定取盐附子、黑顺片、白附片供试品溶液各一份,分别采用青岛海洋化工厂和烟台化学试剂公司生产的硅胶G薄层板点样检测,结果显示,各供试品溶液在两个厂家的薄层板上色谱行为基本一致。见图1,2(青岛海洋化工厂)。2.5不同样品原则依法对样品进行鉴别,结果见图3~5(烟台化学试剂公司)。盐附子样品均可检出与新乌头碱、乌头碱或次乌头碱对照品相应的斑点;黑顺片和白附片样品均可检出与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱或苯甲酰次乌头原碱对照品相应的斑点,但因不同样品生物碱含量变化较大,各斑点颜色深浅明显不同,有的斑点未检出。规定检出3个指标中的一个即认为合格。3有限检测方法的研究3.1流动相及洗脱温度色谱柱:PhenomexGeminiC18柱(4.6mm×250mm,5μm),柱温:35℃;流动相:以乙腈-四氢呋喃(25∶15)为流动相A,以0.1mol·L-1醋酸铵为流动相B,按下列程序进行梯度洗脱:0min,15%A;48min,26%A;48.1min,35%A;58min,35%A,流速0.8mL·min-1;检测波长:235nm。3.2对照品溶液的制备分别精密称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品(用于附子的限量检查)或新乌头碱、次乌头碱、乌头碱对照品适量,加异丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液制成每1mL分别含5μg的混合溶液,作为对照品溶液。3.3超声处理法取本品适量,粉碎,过三号筛,精密称取粉末约2g置具塞锥形瓶中,精密加入氨试液3mL,再精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50mL,称重,25℃以下超声处理30min,放至室温,再称重,补足减失重量,滤过,精密量取续滤液25mL,40℃以下回收溶剂至干,精密加入异丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液3mL溶解残渣,溶液经0.45μm微孔滤膜滤过,即得。3.4外标法计算含量精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,外标法计算含量。单酯型乌头碱含量以苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱含量之和计,双酯型乌头碱含量以新乌头碱、次乌头碱和乌头碱含量之和计。3.5相对标准偏差取对照品溶液,连续进样5次,各色谱峰保留时间及峰面积值相对标准偏差均小于2.0%,理论板数在26941~44642之间,分离度在2.6~16.8之间。对照品溶液及盐附子、黑顺片和白附片供试品溶液色谱图见图6。3.6混合对照品溶液精密称取对照品各5mg于50mL量瓶中,加异丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液溶解并稀释至刻度,即得质量浓度为100μg·mL-1的混合对照品溶液。精密量取上述溶液适量,逐级稀释制得质量浓度分别为50、20、10、5μg·mL-1的混合对照品溶液,取上述5个浓度的混合对照品溶液,进样测定,以浓度为横坐标x,峰面积为纵坐标y,绘制标准曲线,并进行线性回归,在5~100μg·mL-1内,6种乌头碱线性关系良好,相关系数均为0.9999,见表1。3.7检出限和测定下限精密量取质量浓度为10μg·mL-1的混合对照品溶液适量,稀释至不同浓度,进样测定,6种乌头碱的检出限(信噪比3∶1)和定量限(信噪比10∶1)分别为1和3μg·mL-1;方法检出限和定量限分别为0.0003%和0.001%。4重量法的研究4.1对照品溶液的制备分别精密称取新乌头碱、次乌头碱、乌头碱(用于附子的含量测定)或苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱(用于附片的含量测定)对照品,加异丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液制成每1mL分别含10μg的混合溶液,作为对照品溶液。4.2精密度实验取盐附子、黑顺片和白附片的供试品溶液各一份,分别连续进样6次,结果各峰面积相对标准偏差均小于3%。4.3重复实验取盐附子、黑顺片和白附片样品,分别平行制备6份供试品溶液,进样测定,计算6种乌头碱类生物碱含量,相对标准偏差均小于3%。4.4稳定实验取盐附子、黑顺片和白附片的供试品溶液各一份,分别于0,1,3,6,12h进样测定,各峰面积相对标准偏差均小于3%。4.5化学加样回收试验精密量取混合对照品溶液适量于锥形瓶中,40℃下减压回收溶剂至干,放冷,精密称取已知含量的盐附子、黑顺片和白附片样品1g,按供试品溶液制备方法分别平行制备6份加样回收溶液,进样测定,计算各化学成分回收率,6种成分平均回收率均在95%~105%之间。4.6色谱柱的测定取同一份供试品溶液,分别采用LinchrospherC18柱(4.6mm×250mm,4μm)和ZobaxEclipseXDB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)测定含量,与PhenomenexGeminiC18柱(4.6mm×250mm,4μm)测得的含量进行比较,3种色谱柱测得各成分含量的相对标准偏差均小于3%。4.7有限检测和含量测定依法测定了8份盐附子中单/双酯型生物碱及10份黑顺片和8份白附片中双/单酯型生物碱含量,平行测定,结果见表2。5附片与金属离子检测5.1建立的薄层鉴别方法对温湿度要求较高,应在低温干燥环境下操作。薄层板和展开缸应预饱和至少20min。5.28批附子样品单酯型生物碱含量除一批特别高(0.016%)外,其余均在0.005%以下,最高值为0.004%,故建议将附子单酯型生物碱限量检查限度定为0.005%。18批附片样品双酯型乌头碱含量在0~0.017%之间,建议限度为0.020%。8批附子样品双酯型生物碱含量除一批特别高(0.655%)外,其余均在0.010%~0.100%内,含量在0.010%以上(含0.010%)的有8批,占100%。另一方面,因附子不直接入药,其含量测定意义在于控制双酯型生物碱含量,为进一步加工炮制提供可靠的原料,故建议附子的双酯型生物碱含量不得低于0.010%。18批附片样品中单酯型生物碱含量在0.001%~0.071%