林蛙油对哮喘缓解期小鼠气道炎症的保护作用及其机制

林蛙油对哮喘缓解期小鼠气道炎症的保护作用及其机制

气管哮喘是一种以呼吸道高反应性和可变气脉炎为特征的呼吸道炎症疾病。发病机制与呼吸道慢性炎症、变质、气脉高反应和气脉重建有关。目前，哮喘缓解期的治疗主要是吸入糖皮质激素，如必要时使用抗胆红素药物和白三烯帽。然而，上述治疗措施有其局限性，不能满足哮喘的临床治疗需要，且有一定的副作用。中医认为哮喘的发生与肺肾衰竭有关。中医治疗哮喘有丰富的经验。沈子音的研究结果表明，在哮喘缓解期使用补肾中药可以显著减少哮喘的发作。林青蛙油具有补肾精、健脾健胃、滋阴补肾、润肺生津的功效。它含有多种氨基酸、微量元素和激素。在本实验中，观察了林青蛙油对哮喘大鼠的治疗效果，并讨论了其机制。1材料和方法1.1药品、药品和仪器实验动物选择SPF级雌性BALB/c小鼠32只,体质量为(18±5)g,由延边大学实验动物中心提供,合格证号为SCXK(吉)2011-000.药品:卵清蛋白(OVA)(Sigma公司);氢氧化铝粉(分析纯)(Sigma公司);林蛙油(长白山二道白河市售).仪器:细胞因子白细胞介素(IL)-4,IL-5和γ-干扰素(IFN-γ)检测试剂盒(北京晶美生物工程有限公司);雾化器(上海四菱医疗器械厂,ME-U29型超声雾化器);酶联免疫检测仪(RT-2100C,美国).1.2方法1.2.1灌胃pbs和ova致敏药单次给药致敏取BALB/c小鼠适应性饲养1周后,将小鼠随机分为4个组,即正常对照组、哮喘模型组、林蛙油小、大剂量组,每组各为8只.除正常对照组外,其余各组小鼠分别于第1,14d腹腔注射给予OVA致敏液0.2mL(含OVA20μg及硫酸钾铝1mg,溶解于pH值为7.4的PBS中)致敏.从第21d开始,致敏小鼠每日雾化吸入给予OVA(1g/L,溶解于PBS中)激发30min,每周激发3次,共激发8周.正常对照组以同体积PBS代替OVA溶液致敏和激发.各组均于第21d开始每日9时灌胃给药1次,共8周.正常对照组和哮喘模型组灌胃给予生理盐水0.4mL;林蛙油小、大剂量组分别灌胃给予0.05,0.50g/kg林蛙油匀浆液(分别为成人剂量的1,10倍)0.4mL.末次给药后24h测定相关指标.1.2.2嗜酸性细胞及中性细胞的分离末次激发24h后处死小鼠,剪开颈部皮肤,并于气管正中处剪一小口,插入气管套管.以PBS4mL行支气管肺泡灌洗,来回冲洗3次,收集支气管肺泡灌洗液(BALF).混匀BALF,取其中50μL加入等量的白细胞计数液,用细胞计数板计数炎性细胞.将余液在4℃条件下,以3000r/min离心10min,取上清液,-80℃低温保存,待测细胞因子水平.沉淀涂片,行HE染色,在高倍显微镜下进行嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及淋巴细胞分类.取右肺下叶,放入液氮中速冻,-80℃保存.1.2.4肺组织病理学的观察取右肺部分组织行冰冻切片,常规固定,脱水,行HE染色,观察气道及肺组织病理学改变.1.2.5统计学处理方法利用SPSS11.50统计软件进行统计分析,所有计量资料以均数±标准偏差(ue0af±SD)表示,单因素方差分析,组间差异比较采用方差分析的q检验.以P<0.05为差异具有统计学意义.2结果2.1小鼠baf中炎性细胞计数、分离、分离、分离、分离、分离的小鼠小鼠baf细胞计数模型哮喘模型组小鼠BALF中炎性细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞与正常对照组相比较均明显升高(P<0.05),林蛙油小、大剂量组小鼠BALF中炎性细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞与哮喘模型组相比较均明显降低(P<0.05),而各组间巨噬细胞均无明显差异(P>0.05).见表1.2.2p>0.05表达对应物的2.5哮喘模型组小鼠BALF中IL-4,IL-5的水平与正常对照组相比较均明显增高(P<0.05);林蛙油小、大剂量组小鼠BALF中细胞因子IL-4,IL-5的水平与哮喘模型组相比较均明显降低(P<0.05),IFN-γ水平明显增高(P<0.05),林蛙油小、大剂量组间无明显差异(P>0.05).见表2.2.3呼吸道组织病理学检测光学显微镜下观察HE染色涂片结果显示,正常对照组支气管结构正常(图1A);哮喘模型组可见支气管腔内黏液栓形成,气道上皮杯状细胞化生,气道上皮细胞下纤维化,基底膜增厚,气道平滑肌层增厚,且支气管周围和管腔内有大量炎性细胞浸润(图1B);林蛙油小、大剂量组与哮喘模型组相比较气道炎症及气道重构有所减轻(图1C及图1D).3th1/th2细胞失衡支气管哮喘发病原因复杂,发病机制尚不完全清楚,它的主要病理学特征是以嗜酸性粒细胞、肥大细胞及淋巴细胞为主的慢性气道炎症.Mazzarella等的研究结果表明,Th1/Th2失衡是哮喘发生发展过程中的主要免疫学原因.在哮喘发生过程中,Th2细胞通过释放IL-4,IL-5等多种细胞因子促进IgE的形成及嗜酸性粒细胞的聚集和活化,从而导致黏液的过度分泌和气道纤维化;相反,Th1细胞通过释放IFN-γ从而抑制IL-4,IL-5等Th2细胞的增殖.因此,调节Th1/Th2细胞失衡状态已成为寻找哮喘免疫治疗的热点.哮喘缓解期的合理治疗对于减少急性发作、减轻患者肺功能损伤、改善预后具有重要意义.缓解期规范的吸入激素治疗是目前临床应用的有效方法,但吸入激素治疗对哮喘患者肺功能的长期改善作用是有限的,且部分哮喘患者存在激素抵抗,故降低临床疗效.中医学认为哮喘缓解期正气虚,证候有肺、脾、肾虚之偏,治疗重在扶正.沈自尹的研究结果表明,哮喘缓解期应用补肾中药可明显减少哮喘的发作.本实验采用滋阴补肾法,选用林蛙油给药治疗哮喘缓解期小鼠.现代医学研究[8,9,10,11,12,13,14,15,16]结果表明,林蛙油具有抗疲劳、增强机体免疫力、调节运动失调、抗脂质过氧化、抗衰老、滋阴养颜、耐缺氧、调节血脂等药理作用.刘玉兰等通过药理实验证实了林蛙油具有镇咳、祛痰作用.本实验通过建立小鼠哮喘缓解期模型,从细胞、分子学水平观察了林蛙油对BALF中的炎性细胞及IL-4,IL-5,IFN-γ炎性细胞因子的影响,结果表明给予林蛙油干预后小鼠肺组织病理学改变较哮喘模型组明显减轻,BALF中多种炎性细胞计数、IL-4,IL-5水平