冬虫夏草品种的真伪问题

冬虫夏草品种的真伪问题

甘草是一种传统的稀有中药。它具有益肺益肾、止血散粘液的作用。主要用于肾衰竭、阳痿、腰膝痛、久咳、哮喘和咳嗽。现代药理研究结果显示,冬虫夏草具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗疲劳和降血糖等多种药理作用。近年来,由于乱采滥挖,生态环境受损、菌源枯竭、冬虫夏草资源濒临灭绝。有学者调查研究表明,青海、西藏、四川和云南等省区大部分地区虫草的产量不到25年前的10%,甚至有些原来资源分布密集区近年没有发现虫草生长。由于冬虫夏草确切的临床功效和资源的稀缺,导致冬虫夏草的价格不断上涨,堪比黄金,从20世纪70年代的36元·kg-1,到现在的20万元·kg-1左右,最贵已达80万元·kg-1。由于现阶段冬虫夏草价格的昂贵和资源的稀缺,市场上虫草产品以次充好、以假乱真的现象大量存在,这对其临床疗效和用药安全造成了严重的影响,因此冬虫夏草的真伪鉴别研究对保证其用药的安全性和有效性尤为重要。前期已有文献对冬虫夏草鉴别方法进行了概述,本文在已有文献综述的基础上对国内外近10年来冬虫夏草真伪鉴别方法进行了系统的归纳总结,为广大消费者和科研工作者提供科学参考。根据中药鉴定学方法分类,冬虫夏草鉴别方法可以分为性状鉴别、显微鉴别、分子生物学鉴别和化学鉴别,现分述如下。1鉴别法上的特征冬虫夏草性状鉴别一般是从样品的虫体色泽、眼睛颜色、环纹数以及“一宽三狭的结构”、腹足和子座着生位置、子座表面结构、长短、数量以及样品气味等特征进行观察比较。本文根据文献记载[5,6,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19],分析总结出了冬虫夏草性状鉴别的以下特征:(1)虫体的体表呈深黄色至黄棕色,头部呈红棕色。(2)虫体环纹20~30个,1~7腹节存在“一宽三窄”结构。足8对,中部4对较明显。(3)虫体质脆易断,断面黄白色,中间会存在一个黑色“V”字或黑色圆点。(4)子座表面深棕色至棕褐色,从寄主顶部正上方发出,呈细长圆柱形,长4~7cm,直径约0.3~0.8cm。(5)气微腥,味微苦。上部稍膨大,有细纵皱纹,质地柔软。以上冬虫夏草鉴别点能够对冬虫夏草和其常见的伪品(亚香棒虫草、蝉花、蛹虫草、分枝虫草、新疆虫草、凉山虫草、香棒虫草、珊瑚虫草)进行有效区分,但是很多时候对冬虫夏草了解不深入的大众消费者来说,有些高度相似的伪品在形态鉴别方面存在一定的困难,更有造假者将混淆品或者伪品进行加工,使它们和真品冬虫夏草形态更为接近,这无形中又增加了鉴别的难度。故一般需要结合其他分析鉴定技术进行鉴别。2冬春子的鉴定显微鉴别是中药鉴定领域很常用的技术,冬虫夏草的显微鉴别一般是利用光学或电子显微镜对样品体壁刚毛、绒毛、环纹、腹足、子囊壳等结构的显微/亚显微特征进行观察和比较。冬虫夏草显微结构:冬虫夏草切片后显微观察,与其他伪虫草样品在体壁细胞的表面观、侧面观、体表刚毛、子囊壳着生位置等显微结构上也存在显著的差异,如冬虫夏草体壁细胞表面观颜色呈淡黄至黄色,侧面观可见丛生刺状毛;体表刚毛呈黄橙色,眼睫毛状,不规则排列,顶端钝圆,基部渐阔,有些上部略呈钩状;子囊壳半埋生,可以根据这些特征对冬虫夏草及其伪品进行鉴别。粉末显微结构:虫草纯粉片、虫草胶囊等粉末制品充斥市场,不法商贩为了获取巨大利润向虫草粉末制品中添加含淀粉的植物粉末、不明虫卵粉末、伪虫草粉末等,以此获高额利润。粉末制品肉眼无法鉴别,显微镜检能够辨认细小的冬虫夏草粉末和杂质。冬虫夏草虫体体壁粉末碎片表面具小刺毛或圆形残痕,团块状物质色泽呈黄色;毛片碎片呈淡黄色点状,具环状残留毛窝;子囊壳呈卵圆形、半埋生的着生方式、边缘色褐、子囊直径10μm左右等特征均可以作为冬虫夏草粉末的鉴别特征,如果未发现粉末碎片呈现上述特征或掺杂有其他特征碎片的,比如子囊全埋生或者毛片碎片无淡黄色点状等,则为伪品或掺伪品。通过番红-固绿染色、斯氏碘染色等染色方法也可以有效地对冬虫夏草粉末进行鉴别,如果每片均能清晰观察到冬虫夏草的特有结构,且没有碘液染色下的明显蓝色斑点,没有观测到明显的植物组织,即可判断为纯冬虫夏草粉,如果有蓝色斑点则表明有淀粉类物质混入。超微结构:冬虫夏草分离出的杂菌菌丝和中国被毛孢的超微结构中都存在一个瓶形小梗的结构,但是前者瓶形小梗呈圆形或椭圆形,后者呈钻形;另外,瓶形小梗着生方式也不同,前者为单生或者顶生而后者为单生或轮生。根据以上结构特点可以区分冬虫夏草中分离的杂菌和中国被毛孢菌丝体。NorikoKinjo等对冬虫夏草子囊超微结构进行了研究,干虫草标本子囊壳呈球形或花瓶形、密集排列,拟薄壁组织厚,子囊柱形、基部窄;鲜虫草标本子囊透明,4个子囊孢子平行排列在一个子囊,呈圆柱体,子囊孢子纤维状、柱形、光滑具膜,以上特征均可以作为冬虫夏草鉴别特征。3中药分子鉴定的主要矛盾传统的性状和显微鉴定方法是建立在个体形态描述和微观观测的水平上,得到的结论往往不完善。随着分子生物学技术的进步,中药鉴定方法逐渐过渡到分子生物学鉴定。中药分子鉴定一般是指依据核酸或蛋白质等大分子物质特征的鉴定,具有不受外界因素及生物体发育阶段的影响,具有准确性高,重现性好的优点。按照鉴定特征可分为核酸分子鉴定和蛋白质分子鉴定。DNA分子鉴定技术是目前应用较为广泛的中药生物分子鉴定方法。3.1基于dna分子技术的鉴定中药DNA分子鉴定主要是基于核酸序列分析、分子杂交信号、PCR扩增指纹图谱的三大DNA鉴定技术体系,基于DNA分子技术的鉴定在虫草中主要有以下几个方面。3.1.1sapsr-pcr扩增技术为杂草的鉴别提供了依据DNA条形码技术是指利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA片段作为物种标记而建立的一种生物鉴定方法,PaulHebert等将DNA条形码技术运用于物种鉴定。翁榕安等对冬虫夏草和其混淆品北虫草在分子水平进行了鉴别,提取两者DNA后使用PCR法进行DNAITS测序发现,两者在ITS序列上有显著的差异,其中ITS1差异性达到33.31%,ITS2差异性达到26.26%。钟欣等采用通用引物ITS5/ITS4对冬虫夏草、亚香棒虫草和蛹虫草中提取的核糖体基因(rDNA)进行扩增后测序发现,亚香棒虫草与冬虫夏草在ITS5/ITS4区间序列的相似度仅为80.5~81%,蛹虫草与冬虫夏草在该区间序列的相似度为80.8~81.3%。ChenYue-Qin等对冬虫夏草和各种伪品进行核酸序列分析(包括ITS1,ITS2和5.8SrRNA编码区)发现各个不同产地的冬虫夏草在ITS序列区间具有很高的同源性,其序列之间的距离值低于0.02,然而蛹虫草、古尼虫草和拟青霉分生孢子与冬虫夏草有很大的差异,序列间的距离值为0.25~0.33。将ITS区序列作为DNA条形码比对区,能够很好地将冬虫夏草和其混伪品鉴别开来。XiangLi等对冬虫夏草和罗伯茨虫草、下垂虫草、蝉花、蛹虫草、古尼虫草等多种伪虫草进行了DNA条形码分析,它们之间在ITS序列上存在很大的差异,也证实了DNA条形码技术能对冬虫夏草及其混淆品、近缘种能够进行快速、准确、经济地鉴别。此外,无性型和交配型冬虫夏草也可以通过ITS序列和5.8SrRNA序列上的差异进行比对鉴别。PCR-SSCP(PCR-single-strandconformationpolymor-phism)是ShuijiHoshino等在SSCP分析法基础上用敏感的银染法代替放射性同位素标记的改进技术,从而增强了安全性,实用性。利用该技术,可以对基于ITS2和18SrRNAPCR的产物将冬虫夏草和红座虫草、金龟子虫草、拟蛹虫草以及其他三种不知名近缘种等6种伪品进行了很好的鉴定区分。另外利用该技术可以确定不同地域的冬虫夏草遗传的多样性和冬虫夏草子座、菌核、菌丝体的真菌群落组成的多样性,这些均为冬虫夏草的鉴别提供了参考。该技术分析核酸片段大于300bp灵敏度会下降,假阳性结果的不可避免,易受各种外界环境的影响,如游离引物、凝胶的浓度、厚度、温度,故利用此种技术进行鉴定,还需要继续研究和改良。3.1.3环诱导扩增lamp环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP),是利用4种特异引物针对靶基因的6个区域,用一种链置换DNA聚合酶在等温条件完成核酸扩增的方法。李奎等通过特异性靶序列的环介导等温扩增(LAMP)引物实现了冬虫夏草特异性扩增,而其他伪虫草无交叉反应,由此可以将冬虫夏草和其混伪品鉴别开来。该检测可以便捷、准确地对冬虫夏草进行检测,适于基层推广。3.2中药鉴别方法蛋白质免疫鉴定是利用中草药中抗原类物质,制备特异性抗体,采用免疫酶联吸附法、抗体酶免疫试验等免疫学测定方法进行中药鉴别。李杨提取了冬虫夏草特异性蛋白,制备特异性多克隆抗体,采用金标法检测冬虫夏草抗原,利用该法对冬虫夏草做出了准确的鉴定,检测灵敏度达到20ng·mL-1。4化学鉴定4.1杂草的理化性质冬虫夏草的一般理化鉴别主要是根据其中所含化学成分能与某些化学试剂产生特殊颜色或者在紫外下观察发出荧光等进行鉴别,也有物理方法如沉淀法、升华法和结晶法。傅道珍对冬虫夏草与新疆虫草、亚香棒虫草、地蚕与淀粉人工伪制品进行了详细的理化比较分析。冬虫夏草的酸性醇提物在紫外灯(365nm)下观察发淡蓝色荧光,亚香棒虫草发黄绿色荧光,地蚕发鲜紫荧光,新疆虫草和人工伪制品无荧光。冬虫夏草水浸提液在紫外灯(365nm)下观察发黄蓝色荧光,亚香棒虫草发淡黄绿荧光,地蚕发青黄荧光,新疆虫草和人工伪制品无荧光。此外也比较了冬虫夏草与这些伪品在化学显色上的差异,冬虫夏草的甲醇提取物与锌粉沸水浴之后,正品不显红色,伪品显红色。4.2光谱识别4.2.1亚香棒菌株的鉴定和测定紫外-可见光吸收光谱是一种常见的光谱分析方法,利用某种溶剂对中草药进行提取之后,采用紫外光谱测定待测物质的吸光度或者光谱图,根据吸收值或光谱图上的特征,可对中药材进行鉴定和质量评价。殷仁亭的研究表明,冬虫夏草在200~400nm波段有4个特征吸收峰,而亚香棒虫草只有2个,藉此可以鉴别。顾峥嵘等利用紫外吸收光谱对虫草伪品进行了鉴别,发现正品虫草紫外吸收光谱在259nm和309nm波长处有最大吸收峰,伪品(染色金针菜套在虫体头部干燥伪制而成)在259nm波长处有最大吸收峰,在309nm波长处无最大吸收峰。高明等利用紫外吸收光谱对冬虫夏草和湖北虫草在200~300nm处的最大吸收峰进行了比较,结果显示冬虫夏草在区间内具两个吸收峰,而湖北虫草具三个吸收峰。4.2.2优势种牧草与伪菌株在红外图谱上的差异红外光谱按照波长范围的不同可分为近红外光谱(NIR)、中红外光谱(MIR)和远红外光谱(FIR),尤以中红外光谱技术最为成熟、应用最为广泛,中药材鉴定即是其重要的应用领域。该技术能够反映样品的整体化学信息,实现各种形态样品的快速无损检测,且不需要进行提取分离等前处理过程。王宜祥等利用傅里叶变换红外光谱仪对冬虫夏草和古尼虫草进行了比较分析,实验结果表明,冬虫夏草与古尼虫草的子座上部外表皮红外光谱差异很大,冬虫夏草在777cm-1、1671cm-1两处具吸收峰,古尼虫草在766cm-1、1675cm-1两处具吸收峰,且在1675cm-1处得吸收峰较冬虫夏草在1671cm-1处吸收峰强度要弱得多;古尼虫草在1025和1087cm-1处具两个尖峰,其在其两侧1191和936cm-1处具两个小的吸收峰,而冬虫夏草均无;另外古尼虫草在895、873cm-1处具双峰,在714、1316、1388cm-1处均具有吸收峰,而冬虫夏草仅在1338cm-1处具有一个弱的吸收峰。根据以上特征峰差异可以鉴别冬虫夏草和古尼虫草。宋文军等比较了不同产地野生冬虫夏草和伪虫草在红外图谱上的差异,发现伪虫草中脂类、蛋白质和多糖类物质对应的峰值处较正品冬虫夏草弱,同时,伪品虫草在1711cm-1处有羧酸强吸收峰,而真品冬虫夏草的红外谱图中没有此吸收峰,从而导致其峰形和冬虫夏草不同。YangPing等人对青海和西藏冬虫夏草和地蚕、甘露子两种伪虫草的红外光谱进行了比较,结果发现,两地产的冬虫夏草与伪虫草的一级红外图谱没有很大的差异,相似系数的比较没有明显的区别,只是伪虫草较真品吸收峰弱。但是两种伪虫草与青海、西藏产地正品冬虫夏草在二阶导数图谱上存在显著的差异,两种伪虫草在1400~1700cm-1之间不存在显著的峰值,而正品虫草则存在数个显著的峰值,可以据此做出清晰的鉴别。近红外光谱亦可用于虫草鉴定,但由于存在谱图影响因素多、背景复杂、谱峰重叠等限制,应用较少。王钢力等利用近红外光谱技术比较了青海和其他产地102批冬虫夏草样品,实验结果显示近红外光谱技术能够较好地显示出青海产药材和其他产地药材的差异,准确率高达95%以上,该技术可以作为鉴别冬虫夏草的技术模型。4.2.3核磁共振检测技术中药的核磁共振指纹图谱是一种综合的、整体的鉴定手段,可以用于中药材真伪鉴别,具有高度的重现性和特征性。陈畅等利用核磁共振技术,分别比较了冬虫夏草和蒙山九州虫草的醇提取物、水提取物的1HNMR图谱,蒙山九州虫草醇提取物核磁共振图谱在7.2ppm处有峰而冬虫夏草没有;蒙山九州虫草水提取物核磁共振图谱在4.1~4.3ppm处存在一个冬虫夏草没有的峰,而冬虫夏草在4.8-4.9ppm处的峰蒙山九州虫草不存在,这些显著的差异能够对冬虫夏草和九州虫草进行有效地鉴别。4.3识别标记4.3.1新疆菌株和亚香棒菌株的鉴别薄层色谱鉴别适合于组成成分复杂的中草药鉴别,可以在一块层析板上进行多个样品的分析,它具有分离和鉴定的双重作用。傅道珍等建立了一种薄层层析方法,发现冬虫夏草样本在层析板上出现了8个紫红色斑点,而新疆虫草样本则出现了6个、亚香棒虫草样本没有紫色斑点,据此可以对新疆虫草和亚香棒虫草进行鉴别。顾峥嵘等报道冬虫夏草在薄层层析板上具有尿苷斑点,伪品(染色金针菜套在虫体头部干燥伪制而成)无尿苷斑点,可以据此进行鉴别。朱国强等将冬虫夏草及其混伪品利用薄层层析方法进行了分析研究,发现冬虫夏草及其伪品的甲醇浸出液薄层层析结果有显著的差异,冬虫夏草和蛹虫草斑点数目为6个,其他伪品亚香棒虫草、凉山虫草、分枝虫草、蛹虫草、地蚕、人工虫草的斑点数1~5个不等;冬虫夏草最前方的斑点相对距离大于其他伪品,前两个斑点之间的距离较远,后5个斑点彼此间距大致相同,约为前两个斑点间距的1/2,蛹虫草6个斑点之间距离大致相同,由这些特征性差异可以对冬虫夏草和上述混伪品进行鉴别。4.3.2拥有识别验证结果的三级谱带检测电泳法鉴别中药的原理是利用中药中含有的带电荷的成分在同一电场作用下,各组分所带电荷的性质、电荷数量以及分子质量的不同导致泳动方向和速度的差异,可以结合谱带条数和染色的不同达到分离鉴定的目的。傅道珍等报道了运用电泳色谱可以鉴别冬虫夏草与新疆虫草、亚香棒虫草和地蚕。结果显示,新疆虫草有2条一级谱带,冬虫夏草只有1条一级谱带;亚香棒虫草有4条二级谱带,冬虫夏草有3条二级谱带,新疆虫草和地蚕均只有1条二级谱带;冬虫夏草没有显示三级蛋白电泳图谱条带,而其他三种伪品均有1~2条三级谱带,由以上三级谱带数的差异可成功鉴别出冬虫夏草与几种伪品。吕鹏等利用毛细管区带电泳(CZE)方法对冬虫夏草、蛹虫草、蒙山瘤座虫草进行了鉴别分析,冬虫夏草在2.56~4.29min处有一个明显特征吸收峰,而蛹虫草和蒙山瘤座虫草在对应的时间均无明显特征吸收峰,藉此差异可以进行有效地鉴别。古今等利用高效毛细管电泳法(HPCE)对冬虫夏草、亚香棒虫草和地蚕三者的Tris-甘氨酸和碱性、酸性蛋白所进行了检测,结果显示Tris-甘氨酸提取液中,冬虫夏草在7.048min处具有特征吸收峰;碱性蛋白质提取液中,冬虫夏草在3.725和9.243min处具特征吸收峰;酸性蛋白质提取液中,5.700和9.875min处为冬虫夏草特有吸收峰。以上实验结果表明HPEC对冬虫夏草及其伪品能够进行准确的鉴定,该方法具分辨率高、速度快、需样品量少等优点。刘玉军等利用毛细管电泳法测定了冬虫夏草和人工蛹虫草中核苷、碱基的含量,实验数据显示人工蛹虫草虫草素含量高达4581.8μg·g-1,冬虫夏草中不能测出,冬虫夏草中测出次黄嘌呤为118.5μg·g-1,而人工蛹虫草中未测出该物质含量,因此根据人工蛹虫草与天然虫草核苷及碱基成分在含量上的差异,可以高效快速的鉴别蛹虫草与冬虫夏草。4.3.3hplc指纹图谱研究高效液相色谱(HPLC)是一种高效快速的分离分析技术,在中药领域有非常广泛的应用,对中药有效成分建立指纹图谱进行分析是中药鉴别和质量控制常用方法。钟欣等比对了冬虫夏草和亚香棒虫草的HPLC指纹图谱,两者图谱的相似度低于47.9%,对这两种虫草能起到鉴别作用。栾兰等对野生冬虫夏草与虫草发酵菌丝体进行了HPLC指纹图谱比较研究,两者在高极性物质成分方面相似,在低极性成分方面有较大的差异,可以对冬虫夏草和菌丝体进行鉴别。赖宇红等对冬虫夏草与分枝虫草、亚香棒虫草、凉山虫草和人工培植的虫草花进行了HPLC指纹图谱比较,采用相似度评价和轮廓图、雷达图、星座图等多变量二维平面比对分析,结果显示冬虫夏草与伪品在水溶性成分方面存在很大的差异,可以对这些伪品进行有效鉴别。国锦琳等利用HPLC测定了10批凉山虫草的腺苷含量,发现凉山虫草比冬虫夏草中腺苷含量相比要低,可以作为凉山虫草和冬虫夏草的鉴别依据。周枝凤等进行了蚕蛹虫草与冬虫夏草水溶液成分的HPLC指纹图谱中相应化学组分的归属分析,发现蚕蛹虫草和冬虫夏草有5个共有组分,分别有4个和6个相异组分,可以有效地对两者进行鉴别。WangShuang等综合HPLC二极管阵列检测器(DAD)和蒸发光散射耦合法(ELSD)定性定量分析了野生虫草和人工虫草中的核苷和碱基、糖类、多球壳菌素等12种组分,分析结果显示含糖量的多寡也可以用作冬虫夏草鉴伪。4.4gc/ms分析色谱-光谱联用鉴定技术是将高效分离性能的色谱技术与能获取化学成分结构信息的光谱技术相结合形成的中药鉴定技术。常用的联用技术有高效液相-质谱法(HPLC-MS)、气相-质谱法(GC-MS)、毛细管电泳-质谱法(EC-MS)。钱正明等采用高效液相-四级杆飞行时间质谱联用技术(HPLC-QTOF/MS)建立了冬虫夏草高效液相特征图谱,该方法分别从冬虫夏草中鉴定了9个化学成分,北虫草中鉴定了8个化学成分,其中虫草素、脱氧鸟苷可作为冬虫夏草和北虫草的鉴别成分。陈林琤等利用液质联用技术对虫草子实体、中国被毛孢菌丝体、蛹虫草和蝙蝠蛾拟青霉中的麦角甾醇及其衍生物进行了分析,结果发现,虫草子座中含有2种