重组子的筛选与鉴定

NJU重组子的筛选（screening）与鉴定第一节、有关概念转化子重组子期望重组子筛选鉴定转化子与非转化子转化子：接纳有外源DNA分子（载体或重组分子）的受体细胞。非转化子：未接纳外源DNA分子的非转化细胞。重组子：含有重组DNA分子的转化子。非重组子：仅含有空载体分子的转化子。重组子与非重组子期望重组子与非期望重组子期望重组子：含有外源目的基因的重组子。非期望重组子：携带非目的基因的重组子。转化子、重组子、期望重组子关系转化子重组子期望重组子筛选（screening）一般指从反应体系细胞群中辨别挑选出转化子或重组子的过程。反应体系细胞的组成：1、不含外源DNA的受体细胞2、含空载体的细胞（酶切未切开或重新环化的载体转化的细胞）3、重组子：（1）含目的重组DNA的细胞（2）含非目的重组DNA的细胞鉴定对筛选出的重组子DNA进行进一步酶切、测序等，鉴定是否为目的重组子及重组子DNA序列的正确性等。选择标记基因（selectablemarkergene）指编码的产物能够使转化或转染的细胞在有选择剂或营养缺乏的情况下很好生长或表现出其他可视特征的基因。构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上的空间关系有两种：1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转化细胞报告基因（reportergene）指载体上携带的、表达产物容易被检测且能够指示外源基因导入受体细胞与否及表达水平的基因。构建载体时，一般将报告基因与目的基因融合，并将报告基因置于目的基因启动子控制之下，报告基因与目的基因同步转化与表达。第二节、大肠杆菌重组体的筛选一、质粒载体转化大肠杆菌细胞的筛选（一）抗生素平板结合插入失活筛选法—根据标记基因是否失活，确定是否有外源基因插入。插入失活筛选法的应用两种情况：双抗生素抗性基因标记载体含一个抗生素抗性标记，一个lacZ′基因的载体带双抗生素抗性标记的质粒载体转化大肠杆菌的筛选方法载体携带两个抗生素抗性基因，外源基因插入其中一个基因内导致其失活，用两种抗生素平板筛选重组子。第一步：正选择。在不进行插入失活抗性基因的相应抗生素平板上转化子可以生长，非转化子不能生长，可将转化子直接从平板上挑出来；第二步：负选择。在插入失活抗性基因的相应抗生素平板上转化子中的非重组子（未插入外源基因）可以生长，重组子（插入外源基因）不能生长，应与第一种抗生素板进行对照并在其上挑出含重组子的菌落。例如pBR322质粒含有TCr、Ampr两个抗药性基因，外源基因插入失活TCr后，会有三种不同表现的细胞:未转化的受体细胞—

TCsAmps含载体的转化菌落－AmprTcr

含重组体的阳性菌落—AmprTcs空载体转化菌落及重组载体转化菌落空载体转化菌落筛选具体做法1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子—Ampr

；2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组子。注意：氨苄平板菌落密度不宜过大影印平板培养法利用lacZ′基因的插入失活筛选重组子

—蓝白筛选法

载体同时含氨苄青霉素抗性基因和lacZ′基因，外源基因插在lacZ′基因内，受体细胞为lacZ′基因互补菌。在同时含氨苄青霉素和蓝白筛选显色剂（X-gal）的平板上筛选：未转化细胞不能生长；空载体转化菌长成蓝色菌落；重组子长成白色菌落。例：pUC质粒系列、pGEM质粒系列、M13噬菌体lacZ基因编码β-半乳糖苷酶；lacZ′基因编码β-半乳糖苷酶的N端序列α片段，互补菌染色体上携带的缺陷基因编码C端片断，两者互补（α-互补）形成有功能的全酶。蓝白筛选菌落生长照片X-gal5-Bromo-4-Chloro-3-Indoly--D-Galactoside)，5-溴-4-氯-3-吲哚-

-D-半乳糖苷

-半乳糖苷酶显色剂：生色底物IPTG及其作用IPTG：即Isopropyl-

-D-thioagalactoside，异丙基-

-D-硫代半乳糖苷作用：乳糖操纵子诱导物，和载体上携带的大肠杆菌乳糖操纵子的调节基因（LacI）编码产物—阻遏蛋白结合，阻止其与操纵基因结合，使操纵子控制的基因（lacZ等）得以表达。含LacI的载体：如pUC8，需要诱导物不含LacI的载体：如pUC18/19，不需诱导物研究中通常为何用IPTG而非乳糖作诱导物？乳糖会被宿主细胞利用而IPTG不被利用。大肠杆菌乳糖操纵子基因组成IPTG例1:pUC8中lacZ′基因的插入失活例二：pGEM-3Z中lacZ′基因的插入失活（二）插入表达筛选载体的选择标记基因前连接一段负调控序列，插入失活负调控序列后，其下游的筛选标记基因才能表达。如pTR262质粒，在Tc（Tet）基因前有来自噬菌体的cI基因，可编码cI阻遏蛋白，抑制Tet表达。cI基因（HindⅢ或BglⅠ位点）插入失活，Tc基因表达，受体细胞在Tc板上生长；未转化细胞及及空载体转化细胞Tc表达被抑制，在Tc平板上不生长。二、重组噬菌体DNA转入大肠杆菌后重组子的筛选（一）取代型载体：根据λ基因组的大小筛选，直接挑取噬菌斑即重组子机理：空载体太小而不被包装，不进入细胞；重组λ-DNA可包装成噬菌体颗粒并感染大肠杆菌产生噬菌斑；未感染菌生长成菌落。（二）插入型载体空载体及重组载体都可包装，需要插入失活载体上的标记基因筛选。

lacZ′基因插入失活筛选：蓝白筛选cI基因插入失活筛选：cI筛选利用Spi（sensitivetoP2inhibition）表型选择：Spi筛选选择标记基因1、利用lacZ′基因的插入失活筛选重组噬菌斑

如含有lacZ′基因的M13噬菌体及多种λ噬菌体载体（λ

gt11）重组噬菌斑无色透明，非重组噬菌斑呈蓝色，未转化细胞长出菌落2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选

——cI筛选法

原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠杆菌进入溶原化状态；

cI基因的插入失活使感染了λ噬菌体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。重组噬菌斑：无色透明非重组噬菌斑：浑浊未转化菌：正常菌落Polylinker插入不影响lacZ′基因表达单酶切时有这种情况噬菌斑2、cI基因插入失活筛选例：λgt10

－BNNl02（C600hflA）系统C600hflA是一种hflA突变菌；cI基因正常表达的噬菌体在其中溶原生长，不形成噬菌斑；

但cI基因插入失活的重组噬菌体却能形成噬菌斑（YoungandDavis1983a）。hfL：highfrequencelysogenization

3、spi-筛选用目的基因取代λ噬菌体取代型载体上含有redgam（整合基因）的填充片段后，使噬菌体由red+gam+转变为red-gam-，感染P2噬菌体溶源菌后使细菌由溶原生长转换为溶菌生长。

利用这种特性进行的筛选称为spi-筛选。填充片段内含有red及gam基因的载体如EMBL3和EMBL4red+gam+噬菌体可在P2噬菌体溶源菌中呈溶原生长，被定为SPi+

（sensitivetoP2inhibition，对P2介入敏感）red-gam-噬菌体在P2溶源菌中则呈溶菌生长，定为Spi-。三、杂交筛选菌落或噬菌斑杂交筛选第三节、转化/重组酵母菌的筛选营养缺陷互补基因显性标记基因一、利用营养缺陷互补基因的筛选方法原理：受体细胞为某种营养缺陷型突变株，即不能合成某种营养成分，在缺乏该营养成分的培养基上不能生长；携带相应营养成分合成基因的载体转化受体菌后，使细胞在选择培养基（不含某种相应营养物质的培养基）中能够生长，而未被转化的细胞不能生长。酵母常用营养标记基因第一类：氨基酸合成基因：组氨酸合成酶基因HIS4色氨酸合成酶基因TRP1亮氨酸合成酶基因LEU2精氨酸合成酶基因ARG4第二类：核苷酸合成基因：尿嘧啶合成酶基因（URA3）例：含HIS的载体

分泌型表达载体主要有：pPIc9，pPIc9k，pHIL-S1，pPIcza，pYAM75P6；胞内表达的载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa等组氨醇脱氢酶基因（histidinoldehydrogenasegene，his4）缺失的毕赤酵母主要有三类：GS115、SMDI168、KM71均不能合成组氨酸载体需携带his4，转染后的阳性重组子可以用不含组氨酸的平板进行筛选含URA3的载体及其相应的受体细胞载体：酵母菌的Yep系列载体：含Amp、Tc和URA3（尿嘧啶）标记基因受体细胞：EGY48菌株Amp、Tc抗性基因用于在大肠杆菌中筛选重组子URA3标记基因用于酵母转化细胞的筛选二、酵母常用显性标记基因1、氨基糖苷类药物磷酸转移酶基因：Neo（neomycin）。2、博来霉素抗性基因：Zeo（Zeocin）。如pFLD1载体、（一）Neo选择系统Neo基因编码氨基糖苷磷酸转移酶，可以灭活氨基糖甙类抗生素，是新霉素（neomycin）、新霉素衍生物G418、卡那霉素等抗生素的抗药基因。（二）Zeo选择系统Zeo是编码博来霉素抗性产物的基因。博来霉素（bleomycin）是一种光谱抗肿瘤药。三、酵母其他显性标记基因1、蓝白筛选基因：LacZ基因2、

铜离子抗性蛋白基因：CUP1基因。编码一种铜离子螯合蛋白，适合铜离子敏感菌（如酿酒酵母）的筛选。3、赭石突变抑制基因：sup4利用赭石突变抑制基因sup4筛选重组酵母菌酵母菌AB1380（与YAC载体配套）的胸腺嘧啶合成酶基因带有一个赭石突变ade2-1，使其在基本培养基上形成红色菌落，但在缺少某种营养素的选择培养基上不能生长。当带有赭石突变抑制基因sup4

的空载体存在于细胞中时，可抑制ade2-1基因的突变效应，该酵母菌在选择培养基上形成正常的白色菌落；

sup4被外源基因插入失活后重组子呈红色。YAC载体带有trp1、

leu2和his3、ura3以及sup4密码子改变成UAA的无义突变又叫赭石突变第四节、转染的哺乳动物细胞筛选一、哺乳动物细胞常用的选择标记基因1、新霉素抗性基因：neo（neomycin）2、博来霉素抗性基因：zeocin3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）基因（ecogpt）选择系统

由大肠杆菌Ecogpt

基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶，能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形成鸟苷酸（GMP）。霉酚酸能抑制次黄嘌呤核苷酸脱氢酶的作用而阻断嘌呤核苷酸的经典合成途径。携带gpt的载体转化受体细胞后，使受体细胞在含霉酚酸的HAT培养基中启动核苷酸合成替代途径，利用培养基中补加的黄嘌呤合成GMP，得以存活。合成GMP的不同途径

正常途径（经典途径）IMPXMPGMP（次黄苷酸）霉酚酸（×）（黄苷酸）（鸟苷酸）替代途径

黄嘌呤

XMPGMP

XGPRT（＋）HGPRT基因选择系统组成1、受体细胞：普通哺乳动物细胞2、载体：含有gpt基因的载体，如pAG4622（人-鼠嵌合轻链表达载体）

，pSV2gpt（人-鼠嵌合重链表达载体）3、培养基：筛选XPGRT活性缺陷细胞的HAT选择培养基组成如下：霉酚酸黄嘌呤（合成鸟苷酸GMP）腺嘌呤胸苷（合成胸腺嘧啶）透析除去鸟嘌呤的血清胸苷合成中的主要抑制剂fluorouracil（五氟脲嘧啶）methotrexate（氨甲蝶呤或甲氨蝶呤）aminopterin（氨基喋呤）二、哺乳动物细胞常用报告基因β-半乳糖苷酶基因绿色荧光蛋白基因（greenfluorescentprotein，GFP）荧光素酶基因（luciferase，Luc）三、哺乳动物细胞其他选择标记基因1、二氢叶酸还原酶基因：dfhr2、胸苷激酶基因：tk二氢叶酸还原酶基因（dfhr）选择系统二氢叶酸还原酶（dihydrofolatereductase，DHFR）可将二氢叶酸还原成四氢叶酸，后者提供核苷从头合成的甲基。Dfhr-的突变不生长体受体细胞不含外源核苷的常规培养基dfhr＋的重组D