《食品分析》课件-第十章 维生素的测定

第十章

维生素的测定1【教学目标与要求】1.教学目标：能够根据不同测定方法对样品进行预处理，对常用维生素能够正确测定其含量。2.教学要求：通过本章学习，要求学生了解维生素对人体健康的重要性。理解脂溶性维生素和水溶性维生素的处理方法，掌握VA、VD、VE和VB1、VC的测定方法。【教学重点与难点】1.教学重点：维生素A、D、C的测定原理及方法。2.教学难点：维生素A、D、C不同测定方法的样品预处理方法。【教学内容】§10-1概述§10-2脂溶性维生素的测定1.

HPLC法测定食物中VA、VE的含量2.比色法测定维生素A的含量§10-3水溶性维生素的测定1.维生素B1的测定2.维生素C的测定§10-1概述

维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各异，有的属于醇类，有的属于胺类，有的属于酸类，还有的属于酚或醌类化合物。4维生素都具有以下共同特点：1.化合物或其前体化合物都在天然食物中存在；2.它们不能供给机体热能。也不是构成组织的基本原料，主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量极小；3.它们一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；4.长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。5

我们在评价食品的营养价值，开发利用高含量维生素的食品资源，指导人们合理调整膳食结构，指导制定加工工艺或贮存条件，最大限量地保留各种维生素，还要控制强化食品中加入量，防中毒，都离不开分析检测工作。维生素分类：脂溶性（A、D、E、K）水溶性两类（B族、C）67第二节脂溶性V的测定VA、VD、VE与类脂物一起存于食物中，摄食时可吸收，可在体内积贮。

脂溶性维生素具有以下理化性质：

1．溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。

2．耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。8

3．耐热性、耐氧化性：耐热性氧化性VA

好，能经受煮沸易被氧化

（光、热促进其氧化）VD好，能经受煮沸不易被氧化

VE好，能经受煮沸在空气中能慢慢被氧化（光、热、碱促进其氧化）9

根据上述性质．测定脂溶性维生素时，通常：皂化样品水洗去除类脂物有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物)浓缩溶于适当的溶剂测定。

在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。10国际单位：

IU（InternationalUnit)

1IU=0.3μgVA=0.025VD=1.79μgβ-胡萝卜素=1.1mgα-VE=3μgVB一、维生素A的测定

维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不含VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA，故称为VA原。

1112思考题1、高效液相色谱法测定食物中VA、VE的原理？样品处理方法？测定步骤？2、高效液相色谱法测定食物中VA、VE的样品皂化的流程、用具、试剂？3、高效液相色谱法测定食物中VA、VE的样品提取的流程、用具、试剂？4、高效液相色谱法测定食物中VA、VE的样品浓缩的流程、用具、试剂？5、比色法测定VA的原理？样品处理方法？测定步骤？6、三氯化锑比色法测定VD的原理？7、液相色谱法测定VD的原理？8、荧光法测维生素B1的原理？样品处理方法？测定步骤？9、2，6—二氯靛酚滴定法测维生素C的原理？样品处理方法？测定步骤？10、荧光法测维生素C的原理？一、高效液相色谱法测定食物中VA、VE

（GB5009.82—2016）

高效液相色谱法测定维生素A能快速分离和测定视黄醇和它的同分异构体、酯及其衍生物。

原理：试样中的维生素A及维生素E经皂化(含淀粉先用淀粉酶酶解)、提取、净化、浓缩后,C30或PFP反相液相色谱柱分离,紫外检测器或荧光检测器检测,外标法定量。14正相柱和反相柱区别在于固定键合相的不同,如果反了那么柱子可能会坏,因为他们之间的色谱系统不同.

正相和反相是通过比较流动相与固定性极性大小而定义的

固定性极性小于流动相，即为反相柱，反之，为正相柱。

一般，大部分用的是反相柱，可以分离大部分的化学成分，流动相也含有水分。而正相柱，流动相只能为有机溶剂，切不能用含水溶剂，否则柱子就要废了。反相柱（reversedphasecolumn）：填料是非极性的，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等。在反相柱中C18（Octadecylsilyl，简称ODS），即十八烷基硅烷键合硅胶填料，这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛，近年来，为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了CH、C3、C4等短链烷基键合相和大孔硅胶（20～40μm）。无水乙醇、抗坏血酸、氢氧化钾、无水硫酸钠乙醚、石油醚:沸程为30℃~60℃。pH试纸(pH范围1~14)甲醇:色谱纯。淀粉酶:活力单位≥100U/mg。2,6-二叔丁基对甲酚:简称BHT。标准品维生素A标准品、维生素E标准品试剂作用？步骤：样品皂化提取浓缩色谱分析18目的、步骤方法方法、设备条件试样制备

将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎均质后,储存于样品瓶中,避光冷藏,尽快测定。注意：使用的所有器皿不得含有氧化性物质;分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油;处理过程应避免紫外光照,尽可能避光操作;提取过程应在通风柜中操作。皂化1不含淀粉样品称取试样于150mL平底烧瓶中,再加入1.0g抗坏血酸和0.1gBHT,混匀,加入30mL无水乙醇,加入10mL~20mL氢氧化钾溶液,边加边振摇,混匀后于80℃恒温水浴震荡皂化30min,皂化后立即用冷水冷却至室温。2含淀粉样品称取样品于150mL平底烧瓶中,加入0.5g~1g淀粉酶,放入60℃水浴避光恒温振荡30min后,取出,向酶解液中加入1.0g抗坏血酸和0.1gBHT,混匀,加入30mL无水乙醇,10mL~20mL氢氧化钾溶液,边加边振摇,混匀后于80℃恒温水浴振荡皂化30min,皂化后立即用冷水冷却至室温。提取

将皂化液用30mL水转入250mL的分液漏斗中,加入50mL石油醚-乙醚混合液,振荡萃取5min,将下层溶液转移至另一250mL的分液漏斗中,加入50mL的混合醚液再次萃取,合并醚层。注:如只测维生素A与α-生育酚,可用石油醚作提取剂。

用约100mL水洗涤醚层,约需重复3次,直至将醚层洗至中性(可用pH试纸检测下层溶液pH值),去除下层水相。浓缩将洗涤后的醚层经无水硫酸钠(约3g)滤入250mL旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中,用约15mL石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次,并入蒸发瓶内,并将其接在旋转蒸发仪或气体浓缩仪上,于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩,待瓶中醚液剩下约2mL时,取下蒸发瓶,立即用氮气吹至近干。用甲醇分次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至10mL容量瓶中,定容至刻度。溶液过0.22μm有机系滤膜后供高效液相色谱测定。标准曲线的制作本法采用外标法定量。将维生素A和维生素E标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中,测定相应的峰面积,以峰面积为纵坐标,以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线,计算直线回归方程。

样品测定

试样液经高效液相色谱仪分析,测得峰面积,采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中,建议每测定10个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。

二、比色法测定VA的含量（一）原理在氯仿溶液中，VA与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物，在620nm

波长处有最大吸收峰，其吸光度与VA的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。24（二）适用范围及特点本法适用于维生素A含量较高的各种样品(高于5—10μg／g)，对低含量样品，因受其他脂溶性物质的干扰．不易比色测定;该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定性差。比色测定必须在，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。

6秒钟内完成25（三）分析步骤（1）试样处理根据试样性质，可采用皂化法或研磨法。1）皂化法适用于维生素A含量不高的试样，可减少脂溶性物质的干扰，但全部试验过程费时，且易导致维生素A损失。皂化提取洗涤浓缩

26a皂化:根据试样中维生素A含量的不同，准确称取0.5-5g试样于三角瓶中，加入10mL氢氧化钾(1+1)及20mL-40mL乙醇，于电热板上回流30min，至皂化完全为止。b提取:将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，以30mL水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗(如有渣子，可用有脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗内）。用50mL乙醚分二次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振摇并注意放气，静置分层后，水层放入第二个分液漏斗内。皂化瓶再用约30mL乙醚分二次冲洗，洗液倾入第二个分液漏斗中。振摇后，静置分层，水层放入三角瓶中，醚层与第一个分液漏斗合并。重复至水液中无维生素A为止。27c洗涤:用约30mL水加入第一个分液漏斗中，轻轻振摇，静置片刻后，放去水层。加15mL-20mL0.5mol/L氢氧化钾溶液于分液漏斗中，轻轻振摇后，弃去下层碱液，除去醚溶性酸皂。继续用水洗涤，每次用水约30mL，直至洗涤液与酚酞指示剂呈无色为止（大约3次)。醚层液静置10min-20min，小心放出析出的水层。d浓缩:将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约25mL乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶内。置水浴上蒸馏，回收乙醚。待瓶中剩约5mL乙醚时取下，用减压抽气法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内。282）研磨法适用于每克试样维生素A含量大于5ug-10ug试样的测定，如肝的分析步骤简单，省时，结果准确。研磨提取浓缩

a、研磨:精确称2g-5g试样，放入盛有3倍-5倍试样质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至试样中水分完全被吸收，并均质化。29b、提取:小心将全部均质化试样移入带盖的三角瓶内，准确加入50mL-100mL乙醚。紧压盖子，用力振摇2min，使试样中维生素A溶于乙醚中。使其自行澄清(大约需1h-2h)，或离心澄清(因乙醚易挥发，气温高时应在冷水浴中操作。装乙醚的试剂瓶也应事先放入冷水浴中)。c、浓缩:取澄清的乙醚提取液2mL-5mL，放入比色管中，在70℃--80℃水浴上抽气蒸干，立即加入1mL三氯甲烷溶解残渣。30（2）测定标准曲线的制备准确取一定量的维生素A标准液于4-5个容量瓶中，以三氯甲烷配制标准系列。再取相同数量比色管顺次取1mL三氯甲烷和标准系列使用液1mL，各管加入乙酸酐1滴，制成标准比色系列。于620nm波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将其他标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入9mL三氯化锑一三氯甲烷溶液。于6s内测定吸光度，以吸光度为纵坐标，维生素A含量为横坐标绘制标准曲线图。31试样测定

于一比色管中加入10mL三氯甲烷，加入1滴乙酸酐为空白液。另一比色管中加入1mL三氯甲烷，其余比色管中分别加入1mL试样溶液及1滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线的制备。32结果计算：X试样中维生素A的含量，mg/100gc—由标准曲线查得试样中维生素的含量，µg/mLm—试样质量，gV—提取后加三氯甲烷定量之体积，mL计算结果保留三位有效数字33注意事项：①维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或使用棕色玻璃仪器。②乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在提取、洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可加几滴乙醇破乳。③所用氯仿中不应含有水分，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰比色测定。故在每毫升氯仿中应加入乙酸酐1滴，以保证脱水。另外，由于三氯化锑遇水生成白色沉淀，因此用过的仪器要用稀盐酸浸泡后再清洗。34④由于三氯化锑与维生素A所产生的蓝色物质很不稳定，通常生成6S后便开始比色，因此要求反应在比色管中进行，产生蓝色后立即读取吸光度。⑤如果样品中含β-胡萝卜素（如奶粉、禽蛋等食品）干扰测定，可将浓缩蒸干的样品用正己烷溶解，以氧化铝为吸附剂，丙酮、乙烷混合液为洗脱剂进行柱层析。⑥比色法除用三氯化锑做显色剂外，还可用三氟乙酸、三氯乙酸做显色剂。其中三氟乙酸没有遇水发生沉淀而使溶液混浊的缺点。35

三、维生素D的测定

维生素D是指含有抗佝偻病活性的一类物质，具有维生素D活性的化合物约有l0种，其中最重要的是维生素D2、维生素D3及其维生素D原。维生素D2无天然存在，维生素D2只存在于某些动物性食物中。但它们都可由维生素D原(麦角固醇和7一脱氢胆固醇)经紫外线照射形成。维生素D2

药片吃多了中毒。36

分析方法中较好的是比色法和高效液相色谱法。

(一)三氯化锑比色法原理：在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物，呈色强度与维生素D的含量成正比。样品处理：同维生素A的测定。食品中维生素D的含量一般很低，而维生素A、维生素E、胆固醇、速甾醇等成分的含量往往大都超过维生素D，严重干扰维生素D的测定，因此测定前必须经柱层析除去这些干扰成分。37

(二)液相色谱法它的的灵敏度较比色法高30倍以上，且操作简便，精度高，分析速度快。是目前分析维生素D的最好方法。原理试样在焦性没食子酸的保护下皂化，以石油醚萃取后，用正相色谱柱提取富集，用反相色谱柱进一步分离，紫外检测器定量测定。38

1、本法使用两级HPLC，正相色谱柱用于维生素D的提取富集，反相型柱用于把维生素D与许多其他干扰物质分离。2、本法对维生素D2、维生素D3不加区分，两者混合存在时，以总维生素D定量。3、维生素D的含量表示可用mg/100g，也可用国际单位（IU），1IU相当于0.025ug维生素D。39作业题测定脂溶性维生素时样品需如何处理？40

第三节水溶性维生素的测定

水溶性维生素，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足。但是由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任何多余量都能从机体排出。为避免耗尽，需要经常地由饮食来提供。411.水溶性维生素的理化性质

①水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。②在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；③但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部分或全部破坏。④它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响。维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。422.前处理

根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。

维生素Bl、B2

盐酸水解酶解

提取纯化维生素C通常采用草酸、草酸—醋酸、偏磷酸—醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用。草酸价廉，使用方便，对维生素C有很好的稳定作用。淀粉酶、木瓜蛋白酶活性人造浮石、硅镁吸附剂43一、维生素Bl的测定

维生素Bl又名硫胺素、抗神经炎素，通常以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。分析方法：GB/T5009.84—2016441.原理

硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成硫色素（吡哆色素），在紫外光照射下，硫色素发出蓝色荧光，在给定的条件下以及没有其他荧光物质干扰时，其荧光值与硫色素的含量成正比，即与溶液中硫胺素含量成正比。452.分析步骤（1）试样处理样品采集后将样品尽量处理均匀，于低温冰箱中冷冻保存，用时将其解冻后使用。（2）提取：A、精确称取一定量试样，置于锥形瓶中，加入0.1或0.3mol/L盐酸使其溶解，瓶口加盖小烧杯后放入高压锅中加热水解30min（硫胺素由结合态变为游离态），凉后取出。B、用2mol/L乙酸钠调其pH为4.5（溴甲酚绿为外指示剂）。C、按每克试样加入20mg淀粉酶的比例加入淀粉酶。于45-50℃保温16h。D、冷却至室温，定容至100mL，混匀过滤，即为提取液46（3）净化：A、用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出；再装入活性人造浮石，保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石，防止浮石氧化，失去活性B、用移液管加入提取液20-80mL。C、加入约10mL热水冲洗交换柱，弃取洗液。重复3次。D、加入90℃、250g/L的酸性氯化钾20mL，收集入25mL刻度试管中，冷却至室温，用酸性氯化钾定容至25mL，即为试样净化液。E、将20mL硫胺素标准使用液加入盐基交换管代替样品提取液，重复A-D，即得到标准净化液。47（4）氧化：A、将5mL试样净化液分别加入A、B两个Maizel-Gerson反应瓶。B、在避光暗处将3mL150g/L氢氧化钠加入反应瓶A中，振摇约15s，然后加入10mL正丁醇；将3mL碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶B中，振摇约15s，然后加入10mL正丁醇；将A，B两个反应瓶同时用力振摇，准确计时1.5min。C、用标准净化液代替试样净化液，重复A，B。D、用黑布遮盖A，B反应瓶，静置分层后弃取下层碱性溶液，加入2-3g无水硫酸钠使溶液脱水。48（5）荧光强度的测定A、测定条件：激光波长365nm；发射波长435nm；激发波狭缝5nm；发射波狭缝5nm。B、依次测定试样空白荧光强度、标准空白荧光强度、试样荧光强度、标准荧光强度。3.计算494.说明：

（1）食品中的维生素B1有游离型的，也有结合型的，即与蛋白质、淀粉等结合在一起，故需用酸和酶水解，使结合型成为游离型。（2）可在加入酸性氯化钾以后停止实验，因为硫胺素在此溶液中比较稳定。（3）加入的铁氰化钾量要充足，但也不能过量，否则会将硫色素氧化。样品与铁氰化钾溶液混合后，所呈现的黄色应至少保持15秒，否则应再滴加铁氰化钾溶液1-2滴。因为样品中如含有还原性物质，而铁氰化钾用量不够时，硫胺素氧化不完全，给结果带来误差。但过多的铁氰化钾会破坏硫色素，故其用量应恰当控制。50（4）硫色素能溶于正丁醇（微溶于水），在正丁醇中比在水中稳定，故用正丁醇提取硫色素。萃取时振摇不宜过猛，以免乳化，不宜分层。（5）硫色素在紫外线照射下会被破坏，所以硫胺素氧化后，反应瓶要用黑布遮盖或在暗室中进行反应和荧光测定。（6）用甘油-淀粉润滑剂代替凡士林涂盐基交换管下活塞，因凡士林具有荧光。（7）谷类物质不需酶分解，样品粉碎后直接用25%酸性氯化钾直接提取，氧化测定。（8）氧化是操作的关键步骤，操作中应保持加试剂的迅速一致。51二、维生素B2的测定

维生素B2即核黄素。在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。膳食中的主要来源是各种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。分析方法：GB/T5009.85—2016中第一法为高效液相色谱法。第二法为荧光法。52一、理化性质：

1、能溶于水，水溶液呈现强的黄绿色荧光；2、对空气、热稳定；3、在中性和酸性溶液中即使短时间高压加热也不至于破坏，在碱性溶液中则较易被破坏；4、游离核黄素对光敏感，特别是紫外线，可产生不可逆分解。53荧光法

原理：维生素B2（即核黄素）在440-500nm紫外光激发下产生黄绿色荧光，在一定浓度范围内其荧光强度与核黄素浓度成正比。用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光强度之差与内标荧光强度的比值，计算样品中核黄素的含量。54

注意：1、测定中，需用高锰酸钾氧化去杂质，用硅镁吸附剂吸附分离；2、核黄素对光敏感，整个操作应在暗室中进行；3、核黄素可被低亚硫酸钠还原成无荧光型，但摇动后很快就被空气氧化成有荧光物质，所以要立即测定。55三、维生素C的测定

维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。维生素C广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑桔等食品中含量尤丰富。

维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。测定维生素C常用的方法有：靛酚滴定法、苯肼比色法、荧光法和高效液相色谱法等。GB5009.86—2016食品中抗坏血酸的测定第一法为高效液相色谱法。第二法为荧光法。第三法为2，6—二氯靛酚滴定法56(一)2，6—二氯靛酚滴定法

1．原理还原型抗坏血酸可以还原染料2，6-二氯靛酚。该染料在酸性溶液中呈粉红色(在中性或碱性溶液中呈蓝色)，被还原后颜色消失。还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗杯血酸含量成正比。57试剂偏磷酸(HPO3)n

草酸碳酸氢钠(NaHCO3)。2,6-二氯靛酚(2,6-二氯靛酚钠盐,C12H6Cl2NNaO2)。白陶土(或高岭土):对抗坏血酸无吸附性。2,6-二氯靛酚标定方法标定方法:准确吸取1mL抗坏血酸标准溶液于50mL锥形瓶中,加入10mL偏磷酸溶液或草酸溶液,摇匀,用2,6-二氯靛酚溶液滴定至粉红色,保持15s不褪色为止。同时另取10mL偏磷酸溶液或草酸溶液做空白试验。抗坏血酸标准溶液标准品L(+)-抗坏血酸标准品(C6H8O6):纯度≥99。标准溶液的配制L(+)-抗坏血酸标准溶液(1.000mg/mL):称取100mg(精确至0.1mg)L(+)-抗坏血酸标准品,溶于偏磷酸溶液或草酸溶液并定容至100mL。该贮备液在2℃~8℃避光条件下可保存一周。测定整个检测过程应在避光条件下进行。试液制备:称取具有代表性样品的可食部分100g,放入粉碎机中,加入100g偏磷酸溶液或草酸溶液迅速捣成匀浆。准确称取10g~40g匀浆样品(精确至0.01g)于烧杯中,用偏磷酸溶液或草酸溶液将样品转移至100mL容量瓶,并稀释至刻度,摇匀后过滤。若滤液有颜色,可按每克样品加0.4g白陶土脱色后再过滤。滴定准确吸取10mL滤液于50mL锥形瓶中,用标定过的2,6-二氯靛酚溶液滴定,直至溶液呈粉红色15s不褪色为止。同时做空白试验。结果计算试样中L(+)-抗坏血酸含量按下式计算:X=(V-V0)×T×A×100 式中:X———试样中L(+)-抗坏血酸含量,单位为毫克每百克(mg/100g);V———滴定试样所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,单位为毫升(mL);V0———滴定空白所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,单位为毫升(mL);T———2,6-二氯靛酚溶液的滴定度,即每毫升2,6-二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数(mg/mL);m———试样质量,单位为克(g)。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。(二)荧光法

样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化生成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺反应，生成具有荧光的喹喔啉，其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和还原型抗坏血酸的总量。64(三)2，4—二硝基苯肼比色法1、原理

先将样品中的还原型抗