蛋白质分离纯化2014.7

蛋白质的分离纯化2014-07-17蛋白质纯化的一般注意事项

1、操作尽可能在低温下进行。

2、蛋白浓度要合适，蛋白浓度维持在μg/mL～mg/mL。

3、合适的pH。

4、避免样品反复冻融和剧烈搅动。

6、在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/LDTT（β-巯基乙醇）

7、加1~10mmol/LEDTA金属螯合剂蛋白质性质蛋白质分离纯化方法溶解度盐析，有机溶剂沉淀等大小、形状透析、凝胶过滤层析密度密度梯度离心带电荷（等电点）离子交换层析，电泳分子形状、大小和净电荷凝胶电泳（变性/非变性）吸附性质吸附层析疏水性质疏水层析/反相HPLC与配体的亲和力亲和层析能用作蛋白质纯化依据的蛋白质性质+++++++（1）蛋白质胶体稳定的因素电荷层：蛋白质在非等电点状态时带电荷，在颗粒表面形成电荷层，不同分子间同性电荷互斥，使分子不能聚集。水化层：可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒表面形成水化层，其可防止蛋白质分子聚集而沉淀。（2）蛋白质的沉淀pH，离子强度和性质，溶剂的极性盐析法:有机溶剂沉淀法：等电点沉淀法：有机酸：聚乙二醇：盐析法:

大量的中性盐（(NH4)2SO4），使蛋白质脱去水化膜而聚集沉淀。蛋白质的沉淀方法盐离子会跟蛋白质表面争夺水分子，破坏蛋白质分子表面的水化层，以至于蛋白质表面疏水性区域倾向于结合，而沉淀下来在蛋白质的盐析中，以硫酸铵最为常用。溶解度大温度系数小(在25℃时，溶解度为767g／L；0℃时，溶解度为697g／L)、不使蛋白质变性价廉易得盐析的操作1、盐的处理：硫酸铵使用时要求纯度较高，应用分析纯。2、加盐的方法（1）直接加入固体硫酸铵法（2）加入饱和硫酸铵溶液法在搅拌下缓慢均匀加入，避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。一般硫酸铵全部加完后，应放置30min以上才可更好的进行固-液分离。沉淀获得的蛋白质里含有较多的硫酸铵，需脱盐。①pH值对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。因此用沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。②蛋白质的浓度：比较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当于25mg/mL～30mg/mL。蛋白质浓度过高，除杂蛋白的效果会明显下降；浓度过低，则最后蛋白质的回收率低。盐析注意事项硫酸铵浓度的确定把样品分成五份，每份分别加硫酸氨至20%，30%，40%，50%，60%，离心去掉沉淀，保留上清向上清里面添加硫酸氨使浓度从20%到30%，30%到40%，40%到50%，50%到60%，60%到70%，离心保留沉淀，然后分析沉淀里的蛋白，看看目的蛋白在哪个浓度里分段盐析：使用不同浓度的硫酸铵溶液可将不同的蛋白质进行初步分离

利用透析袋（半透膜）把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）透析(dialysis)商品透析袋为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，实验时依次用50％乙醇、0.01mol/L碳酸氢钠和0.001mol/LEDTA溶液煮沸，最后用蒸馏水冲洗。（直接沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净）。透析卡蛋白质颗粒沉降不仅决定于它的大小也取决于它的密度。颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停止不前。在离心力的作用下，各种蛋白质在不同密度介质中形成独立的区带。聚蔗糖密度梯度氯化铯密度梯度离心依据密度的纯化方法密度梯度制备和分离的新时代蛋白质化学中的层析技术

层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。

1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠定了基础。该技术的使用使得化学、生物学和医学的研究得到迅速的发展。

一、层析技术原理层析技术是利用混合物在互不相溶的溶剂中分配系数的差异，而将它们分离的方法。层析系统固定相：固定在支持介质上(如硅胶、树脂等)

可以是液体，固体，固液混合流动相：可自由流动

液体、气体在流动相流经固定相的过程中，由于各组分在两相溶剂中的作用情况不同（电荷、离子亲和力、溶解度、疏水作用力等），而以不同的速度前进，从而达到分离的目的。

二、层析的分类1.按固定相基质的形式：纸层析、薄层层析、柱层析柱中填充不溶的基质颗粒，常用的有葡聚糖，树脂等

2.根据流动相的形式：液相层析、气相层析

凝胶过滤原理吸附层析疏水层析亲和层析离子交换3.根据分离的原理不同分类三、柱层析基本操作过程

装置上样和洗脱结果检测

上样均一性洗脱方法目的不同检测方法不同活性检测柱层析的L/d比值1、柱层析的L/d比值根据层析的基质和分离目的而定。一般柱子的直径与长度比为1:10~50；凝胶柱可以选1:100~200基质的处理将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸（0.5N~1N）、碱（0.5N~1N）或盐（0.5M~1M）溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。然后用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除去其内部的气泡装柱关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约3cm高。打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。注意不能干柱、分层、气泡，否则必须重新装柱。最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2~3cm高的缓冲液，同时关闭出水口。检测柱效

柱子装好后，要用所需的缓冲液平衡柱子。用蓝色葡聚糖过柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的（凝胶过滤层析）。平衡平衡液体积一般为3~5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。2

、加样

加样量的多少直接影响分离的效果。加样量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于20%的操作容量体积应低于5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床体积的1%。加样时应缓慢小心地将样品溶液加到基质表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。3、洗脱

（1）不改变溶剂体系

（简单洗脱）柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。

改善：蠕动泵或恒流泵维持流速恒定的简易装置

（2）改变溶剂系统分步洗脱

在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。

梯度洗脱当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值等。样品收集、鉴定及保存图谱保存记录仪绘制的图谱监测用紫外检测仪进行，在280nm处观察洗脱液的光吸收收集用分布收集器收集，可以自动收集，也可以手动收集鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳、测定活性等

许多基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）可以反复使用多次，而且价格昂贵，所以层析后要回收处理，以备再用。基质的再生和保存离子交换层析IonExchangeChromatography离子交换层析是利用离子交换基质上的可解离基团对各种蛋白结合力不同而达到分离目的的一种分离方法支持基质：纤维素，琼脂糖——CH2COO-Na+——DEAE+Cl-活性基团：阳离子：羧甲基（CM）阴离子：二乙基氨基乙基（DEAE）由于蛋白质分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行蛋白的分离纯化。阳离子交换层析原理洗脱方法：改变盐浓度和改变pH的方法

+离子交换剂的基质

琼脂糖离子交换剂

离子交换交联葡聚糖聚苯乙烯离子交换纤维素

1、交联葡聚糖类

型性

能离子基因反离子DEAE-sephadexA-25弱碱性、阴离子交换剂DEAE+Cl—DEAE-sephadexA-50QAE-sephadex-25弱碱性、阴离子交换剂QAE+Cl—QAE-sephadexA-50CM-A-sephadex25弱碱性、阳离子交换剂CM—Na+CM-sephadexA-50SP-sephadexA-25强碱性、阳离子交换剂SP—Na+SP-sephadexA-50交联葡聚糖（Sephadex）开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，大分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多。亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。

回收率高优点：2、离子交换纤维素

离子交换纤维素种类交换剂名

称（纤维素）作用基团特

点阴离子交换剂二乙氨基乙基DEAE+

Cl-最常用在pH8.6以下氨乙基AE+

Cl-胍乙基强碱性、极高pH仍有效阳离子交换剂羧甲基CM－Na+最常用在pH4以上磷酸P－Na+

用于低pH磺甲基SM－Na+磺乙基SE－Na+强酸性用于极低pH四、基本操作

缓冲液的选择层析柱的选择

洗脱流速↓↙加样洗脱洗脱液的监测收集及组分鉴定离子交换剂的清洗、再生和保存

↓↓↓←离子交换剂的处理

↘↑离子交换剂的选择2、离子交换剂的处理酸碱浸泡使离子交换剂带上需要的平衡离子，一般阳离子交换剂最后用碱NaOH处理，阴离子交换剂最后用酸HCl处理。

膨化将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的配基充分暴露出来。水悬浮去除杂质和细小颗粒5、上样样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。上样量要适当，不要超过柱的负荷能力，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。

6、洗脱改变溶液的pH或改变离子强度

洗脱方法阶段洗脱和梯度洗脱

再生

对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。

酸碱交替浸泡保存处理洗净蛋白等杂质后，加入适当的防腐剂，一般加入0.02%的叠氮钠，4°C下保存。凝胶过滤层析（gelfiltrationchromatography）凝胶颗粒为多孔网状结构的聚合物。凝胶过滤层析又称分子筛过滤、分子排阻层析等，根据蛋白质分子大小不同来分离纯化蛋白质葡聚糖（Sephadex）聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）琼脂糖凝胶（Sepharose,Bio-GelA）交联葡聚糖（Sephadex）凝胶过滤层析的原理凝胶过滤层析的原理是分子筛效应，小分子可以进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。如同过筛那样，它可以把蛋白质按不同分子大小进行分离。2、影响分离效果的因素流速加样体积样品浓度离子强度①流速

影响洗脱液流速的因素洗脱液加在柱上的压力

为保持层析过程中恒定的压力，可使用恒压瓶。凝胶颗粒大小

②加样体积上样体积为柱体积应合适体积过大

洗脱峰和相邻峰重叠体积过小目的蛋白收集量少、稀释倍数大、浓度低③样品浓度进样前，样品一般为10～20mg/mL粗分离&脱盐除杂适当提高样品浓度精细分离&分析性实验浓度低④离子强度可防止蛋白质与蛋白质之间或与凝胶介质之间的相互作用常用盐溶液：

20-100mmol/LNaCl二、凝胶过滤层析的介质

葡聚糖系列琼脂糖系列聚丙烯酰胺系列多孔硅胶葡聚糖系列以微生物产生的葡聚糖苷Dextran为原料用环氧氯丙烷为交联剂，在碱性条件下交联而成商品的凝胶，称为Sephadex先制成丙烯基的衍生物，然后再用N，N’-甲叉双丙烯酰胺交联，得到商品化的凝胶，被称为SephacrylSephadexG-X，X表示葡聚糖的交联程度，数值越大则交联度越小，但吸水量越高。四、凝胶过滤层析的应用

脱盐，分离提纯高分子溶液的浓缩测定高分子物质的分子量蛋白质复性研究

logMr

=K1-

K2Ve洗脱体积Ve：自加入样品开始到该组分的洗脱峰峰顶（即收集液中该组分浓度最大时）出现时所流出的洗脱液体积。凝聚过滤法测定蛋白质分子量高分子溶液的浓缩将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外