第六章 酶的发酵生产

第六章酶的发酵生产一、微生物酶工业的发展概况二、酶的生产菌种三、酶生物合成调节的基本理论四、酶的发酵生产技术五、酶发酵动力学六、微生物酶制剂生产工艺举例1第一节、概述酶是由细胞产生的具有催化作用的蛋白质，生物体进行的各种生物化学反应都是在酶的作用下进行的，没有酶，代谢就会停止，生命也会停止。现代意义的酶，已经不单单是一些微生物的重要产物，它已成为现代生物产业中的一个不可缺少的组成部分。酶作为生物催化剂，在许多化学反应中具有不可低估的作用。酶催化剂作为生物进化的高级形式，与一般的化学催化剂相比，它可以在非常温和的条件下高效、专一性地将催化底物转变为产物。2通过酶，尤其是固定化酶的催化作用，可以简化生产工艺、降低生产成本、改善操作环境，其经济效益是非常可观的。随着人们对环境保护和生活质量要求的提高，酶在医药、食品、轻工等领域的应用是益广泛。酶工程技术已成为生物工程技术的重要组成部分，无论在基因工程、蛋白质工程、细胞工程和发酵工程都需要酶分子的参与。酶催化的高效、特异性、产品的高效回收和反应体系简单等优点使酶工程技术成为现代生物技术的主要支柱之一。3酶对作用物具有高度的专一性、严格的选择性，只对某一种物质起催化作用。有的酶单一使用就可起催化作用，有的则需加上辅酶或辅基等辅助因子才能完成催化作用。酶的催化作用受到温度、酶浓度、pH值、激活剂、酶抑制剂等条件的影响。大多数生物都是有用酶的来源,但实际上只有有限数量的植物和动物是经济的酶源,在工业生产中所用的酶制剂绝大部分是通过微生物发酵、提取、精制而获得。全世界已发现的酶有3000多种，目前工业生产的有60多个产品，达到工业化生产规模的仅有20多个产品。4一、微生物酶工业的发展概况1、酶制剂的发展历史人类利用微生物生产酶具有悠久的历史，最有代表性的就是制曲酿酒。公元前12世纪周代人们酿酒，制作饴糖和酱，2000多年前，春秋战国时期已知用曲治疗消化不良的疾病519世纪末酶蛋白学术的建立，开创了酶工业生产的历史。1949年日本开始用深层培养法生产细菌α－淀粉酶。随着酶工业提纯技术的进步和应用领域的开发，果胶酶、葡萄糖氧化酶等也相继进入了工业化生产阶段。70年代后固定酶技术的发展，加速了酶制剂工业的发展。相继开发了脂肪酶、微生物凝乳酶、柚苷酶、磷酸二酯酶等。近年来又开发了青霉素酰化酶、异淀粉酶等等。62、国内外酶制剂生产和应用现状世界三大酶制剂公司NovoNordisk（丹麦）GenencorInternational(美国）Cuitor(芬兰）三大公司销售额占世界总额的70%73、我国酶工业发展阶段1965无锡酶制剂厂淀粉酶1979糖化酶碱性蛋白酶中性蛋白酶1993耐高温淀粉酶1998国外大公司纷纷入驻1999年投产目前我国已能生产α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、中性脂肪酶、青霉素酰化酶、果胶酶、纤维素酶、饲料用复合酶、葡萄糖异构酶、凝胶酶。年产量260多万吨。8酶制剂的产业规模

酶制剂总规模（2004年）：670亿元水解酶31％蛋白酶59％其它10％碱性蛋白酶25％中性蛋白酶12％凝乳酶10％淀粉酶5％糖化酶13％葡萄异构酶6％果胶酶3％纤维素酶1％9一、概述二、脂肪酶的一般性质三、产酶微生物及其筛选四、酶活的测定五、发酵工艺和酶的提取六、国内外研究情况七、参考文献蛋白酶、果胶酶、葡萄糖异构酶、

纤维素酶、糖化酶、脂肪酶10二、酶制剂的应用食品工业洗涤剂纤维工业有机合成和制药工业医学上的应用用于分析化学和临床检验生物工程11国际市场酶制剂销售额比例

2001年工业酶制剂的世界市场约为15亿美元用于制药工业与精细化学工业约1.2亿~1.5亿美元1213淀粉酶类与淀粉糖业14果汁生产与果胶酶乳制品与凝乳酶15酶制剂在国外饲料工业中得到不断应用，不仅提高了饲料原料的转化率，也促进了对饲料的消化。植酸酶

Bio-Feed®Phytase(Ronozyme®P)

主要用于提高植酸磷的消化率，并相应改善钙和其它矿物元素的利用率。大大降低了动物粪便中磷的排放量，有益环保。16酶水解了毛根部的毛囊蛋白而使毛松动脱落。蛋白酶分解皮纤维间质中的可溶性蛋白质，使皮纤维进一步松散软化。加速蛋白质的分解染色温度降低皮革脱毛与软化加酶洗涤剂生丝脱胶与羊毛染色蛋白酶回本章目录17青霉素酰化酶与抗生素改造18溶菌酶19凝血酶20健美生消化酶—帮助肠胃蠕动【产品规格】90片／瓶【食用方法】成人每日3片，随主餐服用【成分(每片含)】1)消化蛋白质：木瓜蛋白酶50毫克、菠萝蛋白酶30毫克；2)消化脂肪：脂肪酶30毫克；3)消化碳水化合物/淀粉：淀粉酶50毫克；4)消化乳制品：乳糖酶30毫克；5)消化纤维：纤维素酶15毫克。另含：能抑制过多胃酸的葡萄糖酸钙，能缓解反胃薄荷叶和茴香【适用人群】·消化不良者·肠胃疾病患者·大病初愈者消化酶类21SOD22生物抛光是一种用纤维素酶改善纤维素纤维制品表面的整理工艺,以达到持久的抗起毛起球并增加织物的光洁度和柔软度

23三、酶制剂的生产方式1.固态发酵法微生物的培养物是固态，一般使用麸皮、米糠作为培养基。在曲房内将培养基拌入种曲后（固态，含水量60％左右）铺成薄层（1cm左右）在曲盘或帘子上，然后置于多层架子上进行微生物的培养。培养过程中控制曲房的温度和湿度（90～100％），逐日测定酶活力的消长，待菌丝布满基质、酶活力达到最大值不再增加时，即可终止培养，进行酶的提取。固态培养法一般适用于霉菌的生产。起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术，生产简单易行，但劳动强度高。近年新发展了通风制曲工艺，在酶制剂的生产中仍占有重要作用。242.深层液体培养法采用在通风搅拌的发酵罐中进行微生物深层液体培养，是目前酶制剂发酵生产中最广泛应用的方法。液体深层发酵法的优点机械化程度高，发酵条件易控制。酶的产率高、质量好。培养的无菌要求高，在生产上要特别注意防止染菌。25第二节酶的生产菌种1．酶发酵生产的细胞必需具备如下条件①易于快速繁殖，产生大量健壮的营养细胞、孢子或其它繁殖体。②菌种不易变易退化，不易感染噬菌体。③酶的产量高；产酶稳定性好；④容易培养和管理；发酵周期短，营养需求简单；产物杂质少，利于酶的分离纯化；⑤安全可靠，非致病性。262．常见酶发酵生产用微生物

微生物主要功能枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis

-淀粉酶，中性蛋白酶、β葡聚糖酶大肠杆菌Esherichiacoli

－半乳糖苷酶，谷氨酸脱羧酶，天门冬酸酶，苄青霉素酰化酶，限制性核酸内切酶，DNA聚合酶，DNA连接酶，核酸外切酶黑曲霉Aspergillusniger糖化酶，果胶酶，纤维素酶，半纤维素酶，葡萄糖，氧化酶，酸性蛋白酶，柚苷酶米曲霉Aspergillusoryzae淀粉酶，中性蛋白酶，果胶酶，氨基酰化酶、脂肪酶，磷酸二酯酶根霉属Rhizopus糖化酶，转化酶，脂肪酶，酸性蛋白酶，半纤维素酶毛霉Mucor蛋白酶，糖化酶，脂肪酶，凝乳酶27产黄青霉Penicillium

chrysogenum葡萄糖氧化酶，青霉素酰化酶，果胶酶，纤维素酶，桔青霉，5‘－磷酸二酯酶，脂肪酶，葡萄糖氧化酶，核酸酶，凝乳蛋白酶，木霉属Trichoderma纤维素酶，17

-羟化酶链霉菌Streptomyces葡萄糖异构酶，中性蛋白酶，几丁质酶酿酒酵母Saccharomycescerevisiae转化酶假丝酵母Candida脂肪酶，转化酶，尿酶，乳糖酶脆壁酵母乳糖酶28枯草芽孢杆菌纯培养的镜下形态（革兰染色）枯草芽孢杆菌在营养琼脂平板上的菌落特征（18～24h）29枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)

30大肠埃希氏杆菌醋酸杆菌（Acetobacter）31图2-84酿酒酵母32毛状菌落（丝状真菌菌落形态之一）毛霉总状毛霉（PDA）33根霉的假根根霉形态和囊托照片

34少根根霉（低倍镜见假根）35（曲霉）分生孢子头、分生孢子梗、足细胞黑曲霉（蔡氏培养基）36日本曲霉（蔡氏培养基）37日本曲霉（顶囊球形，小梗单层）黑曲霉（顶囊球形，小梗双层）38解脂假丝酵母解脂变种393、工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源40酶作用特性产酶微生物用途α-淀粉酶（液化酶，中温）切淀粉内部1，4糖苷键；pH6.0-7.0；T-60-70℃；产物糊精枯草芽胞杆菌地衣芽胞杆菌米曲霉食品，淀粉液化，织物退浆，消化助剂，加酶洗涤剂β-淀粉酶（1，4麦芽糖苷酶）切淀粉非还原型末端1，4糖苷键；pH6.5；T-50℃；产物麦芽糖。巨大芽胞杆菌啤酒制造葡萄糖淀粉酶（糖化酶，1，4葡萄糖苷酶）切淀粉分子非还原性末端；pH4.0-4.5；T-58-60℃主要是曲霉（佐美曲霉，泡盛曲霉）、根霉（雪白根霉，德氏根霉）制造葡萄糖，发酵氨基酸、酿酒等工业的淀粉水解糖。耐高温淀粉酶内切淀粉酶，随机水解淀粉、糊精、低聚糖的α-糖苷键。pH5.5-7.0；T-100-105℃白地霉发酵淀粉原料的转化异淀粉酶支链淀粉α-1，6糖苷键形成直链淀粉和糊精；pH5.6-7.2；T-45-50℃产气克雷伯氏菌，芽孢杆菌制造直连淀粉加工；麦芽糖4142酶作用特性产酶微生物用途酸性蛋白酶酸性介质中水解动植物蛋白质；pH2.5-4.0；T-30-50℃；黑曲霉、米曲霉、根霉、微小毛霉、拟青霉、青霉皮革软化，果汁澄清，啤酒去浊，蛋白质水解液制备，羊毛染色，饲料添加剂。中性蛋白酶pH6.8-8.0；T-50℃；枯草芽胞杆菌，巨大芽孢杆菌，腊状芽孢杆菌，米曲霉，栖土曲霉、灰色链霉菌皮革、毛皮加工，食品加工，调味品制造、助消化、消炎、啤酒澄清，蛋白质水解液制备，羊毛染色。碱性蛋白酶pH10-11；T-40-50℃；枯草芽胞杆菌，巨大芽孢杆菌，腊状芽孢杆菌，米曲霉，栖土曲霉、灰色链霉菌地衣芽胞杆菌加酶洗涤剂植酸酶黑曲霉，毕赤酵母工程菌株饲料添加剂43纤维素酶包括内切β-1，4葡聚糖酶（Cx）；外切葡聚糖酶（C1）；纤维二糖酶（β葡萄糖苷酶）；有效pH2.8-5.8；T-45-60℃；绿色木霉，里氏木霉、康氏木霉，黑曲霉，青霉纺织工业（水洗布生产），饲料添加剂，消化植物细胞壁，食品工业，石油工业半纤维素酶木霉、曲霉、根霉饲料添加剂，消化植物细胞壁，低聚木糖生产β葡聚糖酶枯草芽胞杆菌，黑曲霉，Penicilliumemersonii啤酒酿造，饲料添加剂乳糖酶乳酸酵母，米曲霉，黑曲霉，米根霉乳品工业（处理牛乳和乳清）果胶酶曲霉、欧文氏菌水果加工，果汁、果酒澄清，麻类纤维脱胶44工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源转化酶啤酒酵母、假丝酵母制造转化糖凝乳酶米赫毛霉,大肠杆菌和真菌生产的重组酶制造乳酪脂肪酶曲霉、根霉、酵母等加酶洗涤剂，油脂加工，生物化工葡萄糖氧化酶青霉、曲霉食品去氧、除葡萄糖，测定葡萄糖葡萄糖异构酶凝结芽胞杆菌，白色链霉菌生产果葡糖浆青霉素酰化酶细菌、霉菌、放线菌制造6-氨基青霉烷酸454、酶在食品工业中应用的案例

----啤酒行业酶制剂应用概述及展望46（1）酶制剂在啤酒行业的应用情况：利用现代化生物化学技术，并与传统啤酒酿造技术相结合，对提高啤酒质量降低生产成本、增加效益都大有益处。啤酒中使用外加酶制剂的用途：提高辅料比例：改善啤酒口味，降低成本。提高发酵度：提高啤酒发酵度，为生产新品种干啤酒提供了基础。弥补麦芽质量差的问题：由于麦芽质量不佳，会出现糖化不完全、过滤速度慢、收率低等现象，而添加必要的酶制剂可以弥补麦芽质量的不足。提高质量：添加酶制剂，生产不同品种的啤酒，由于可不使用麦芽糊化，可减少麦皮中色素、单宁等不良杂质在糖化过程中浸出，因而在保证啤酒色度、品味及非生物稳定性方面有一定的效果。操作方便。使用耐高温α-淀粉酶可迅速升温，液化彻底，便于控制。减少成品中双乙酰含量，使成品符合标准。提高啤酒非生物稳定性，使酒质清澈透明。提高设备利用率，便于高浓度糖化工艺要求。47（2)、啤酒生产参考用酶48

啤酒酿造中主要使用的酶制剂：啤酒生产中，外加酶制剂的品种很多，而且新的酶制剂品种还在不断被研发出来，并在生产中推广应用。表1列出了目前啤酒生产中主要使用的酶制剂种类及简单说明，其中推荐的使用量仅供参考，具体用量，需根据实际情况而定。49产品产生菌推荐用量应用说明耐酸、耐高温α-淀粉酶地衣芽孢杆菌（Bacillulicheniformis）0.04%~0.06%(对淀粉干基计)添加在湖化锅中，用于大米等淀粉质辅料的液化。糖化酶黑曲霉(Aspergillusniger)米曲霉(Aspergillusoryzae)0.05%~0.1%(对淀粉干基计)糖化酶可提高麦汁的可发酵性糖，改变麦汁的组分，对于干爽型的啤酒和低热能啤酒的酿造，可在糖化时添加。β－淀粉酶植物中提取(大麦和麦芽)0.10~0.20/L麦汁本产品是从大麦中提取，可水解淀粉为麦芽糖，在啤酒酿造中，可用于提高麦汁糖分；与普鲁兰酶合用，可用于干爽型和低糖啤酒的生产真菌淀粉酶曲米霉菌株(Aspergillusoryzae)0.3Kg/吨原料（麦芽和辅料）20-30g/吨冷麦汁本产品可提高发酵度，改善残糖率；提高发酵速度，“冷混浊”；麦汁香味修饰。可添加到发酵罐中普鲁兰酶(链淀粉酶)异淀粉酶普鲁兰杆菌菌株(Bacilluacidopullulgticus)0.1-1.5Kg/吨淀粉干物质普鲁兰酶可提高麦汁的可发酵度和改变麦汁糖化的组分，对于干爽型啤酒和低热能啤酒的酿造，可在糖化时添加。糖化复合酶（糖化酶＋普鲁兰酶）0.05~0.1%(对淀粉干基计)与上述的糖化酶和普鲁兰酶的作用相同，但比糖化酶和普鲁兰酶单独添加更有效。50产品产生菌推荐用量应用说明中性蛋白酶黑曲霉(Aspergillusniger)宇佐美曲霉(Aspergillususamii)栖土曲霉(Aspergillusterricola)放线菌(Astinomycessp.)地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)0.3-0.7kg/吨麦芽增加α－氨基酸，防止啤酒混浊，改善麦芽质量，加快过滤速度，得到好的泡沫。β－葡聚糖酶枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)绿色木霉(Trichodermaviride)0.2-0.6kg/吨(麦芽粉干基计)本产品可分解葡聚糖、木聚糖及其它胶质成分。在糖化锅添加，用于降低麦芽和大米中上述碳水合物引起的麦汁粘度，加快过滤速率，同时可提高麦汁的转化率；消除成品酒“冷混浊”现象，在纯生啤酒生产中大幅提高清酒过滤的速率。α－乙酰乳酸脱羧酶枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)绿色木霉(Trichodermaviride)1-2kg/1000hl麦芽汁减少和防止形成双乙酰，可以大大缩短发酵后熟期。葡萄糖氧化复合酶（葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、转化酶）2-3mg/kg啤酒通过催化啤酒中葡萄糖的氧化反应而消耗氧，来除去啤酒中的溶解氧和瓶颈空间的氧，使啤酒口味明显好转，老化味减轻，澄清度提高，延长保质期，可在清酒中添加。溶菌酶从鸡蛋中提取1-10mg/kg清酒通过破坏细菌的细胞壁从而消除引起腐败的革兰氏阳性细菌。可加于酵母中，应用于清酒和鲜啤中。51产品产生菌推荐用量应用说明各种复合酶根据需要对选择外加酶制剂进行组合。根据实际情况而定复合酶是一种啤酒行业优化的酶制剂。根据需要和各酶的活性特点进行合理匹配，满足不同要求。.木瓜蛋白酶一种高活性的植物蛋白酶10g/吨啤酒可迅速将啤酒中的大分子量蛋白质降解为易溶于啤酒的中分子、小分子蛋白质，能缩短发酵时间，有利于啤酒澄清和双乙酰还原。转苷酶是曲霉经控制发酵而得0.5-1.0kg/吨麦汁降低可发酵性糖，生产低醇啤酒。脯氨酸内切酶基因修饰技术改良黑曲霉经控制发酵而得4-15ppm能有效延长啤酒非生物稳定性，对泡沫有一定影响。52（3）、啤酒中外加酶的具体应用：外加酶制剂使用注意事项：生产中应根据原料和工艺状况有针对性地精选外加酶制剂，对于效果不明显，作用不突出、介于可用不可用的情况，应坚决不使用。因为酶制剂属于生物制品，大多由微生物发酵而来，不恰当的使用，将给啤酒生产带来不利影响，甚至是污染。酶制剂的用量应在保证其作用效果的前提下选择最低的添加量，除成本原因外，过量使用酶制剂会造成底物过度分解，在工艺和啤酒口感方面容易出现异常。甚至有些酶的失活温度很高，过量添加，酶制剂将在啤酒成品中继续分解底物，造成产品质量异常。酶制剂添加时要考虑其纯度。纯度低使酶的用量加大，并且其无效的杂质会影响啤酒质量；其它杂酶会催化底物生成一些不需要的物质，对啤酒的泡沫、口味和气味造成不利影响。53酶活力是研究酶特性和应用时一项必须考虑的指标，也是决定产品价格和添加量的主要因素。选择高活力的酶制剂将在一定程度上减少使用剂量，被酶中的杂酶、杂质和少量微生物污染的机会将减少。啤酒厂家应完善对酶活力的检测手段。由于酶制剂大多由细菌或霉菌发酵生成（少量从植物中提取的酶除外），同时卫生标准允许酶制剂中存在一定量的活菌数，因此在发酵和清酒环节添加的酶制剂，很容易将耐热菌和孢子带入成品酒，若巴氏杀菌强度不够，会严重影响产品质量。因此要对其高度重视，尽量减少外加酶制剂的微生物染污。酶制剂使用时应注意添加细节，此过程对其作用效果的发挥有很大影响。温度、pH的变化会使酶产生变性，甚至在一定的温度范围内，pH对酶产生的影响要远大于温度的变化对酶的影响，因此在生产中有必要先调整好pH之后再加入酶。否则酶作用效果不好，或造成酶不可逆变性。此外糖化并醪过程应精心控制，不可出现温度偏高再降温的情况，高温将导致酶失活，且无法挽回。54酶制剂在啤酒生产过程中的应用：a、啤酒中辅料液化用酶：为降低生产成本，啤酒生产中广泛利用各种淀粉质原料如大米、玉米、小麦等作用辅料，用量一般占３０％，甚至更高；生产中采用耐高温α－淀粉酶作为淀粉质辅料的液化用酶，所生产的淡爽型口味啤酒受到消费者普遍欢迎。b、提高发酵度：发酵度是指原麦汁中的浸出物被酵母发酵所消耗的量与原浸出物总量的比值。在生产干啤，淡爽型啤酒时，为增加可发酵性糖，提高发酵度，可外加高转化率液体糖化酶、β－淀粉酶、真菌淀粉酶、切支酶（如：普鲁兰酶、异麦芽糖酶）等。c、降低双乙酰：用来降低啤酒发酵液中双乙酰含量，缩短啤酒酒龄，加快啤酒成熟。d、改善麦汁过滤：麦汁经过糖化后立即过滤，除去麦糟，以免影响色、香、味。麦汁粘度对过滤速度的影响很大。温度高时则粘度小，过滤快；此外原料粉碎度直接影响滤层可透性，粉碎度不宜太细。当辅料比增加时，麦芽相对减少，麦芽中降解β-葡聚糖的酶系不足；或者麦芽质量差，在麦汁中的β-葡聚糖没有完全分解，使麦汁过滤困难。同时也有可能影响啤酒过滤、风味和引起混浊。一般可在糖化时加入β-葡聚糖酶，可达到过滤速度加快的目的。55新研究表明，其它多聚糖对过滤速度也存在很大的影响，尤其是戊聚糖，因为这种多聚糖含有木聚糖的主链,因此人们越趋向于使用带有戊聚糖酶制剂和其它胶质水解活性的β-葡聚糖复合酶制剂。这样可使麦汁过滤速度大大提高，酒糟中残留的麦汁量减少；原料细胞壁的框架物质被分解，促进糖化酶系作用，尤其是可以提高蛋白酶的作用效果，提高麦汁中α-氨基氮的含量，这有利于啤酒酵母的发酵，提高麦汁产量和收率，缩短热麦汁被氧化的时间，减轻氧化程度，有利于提高啤酒质量；由于粘度降低，有利于酵母沉降，使发酵液澄清度提高，发酵液中酵母数的减少，使硅藻土的堵塞机率大大减小，因此过滤量有了很大提高，啤酒的胶体稳定性得到有效改善；同时清酒的过滤速度也得以加快，提高糖化设备利用率，能降低麦汁浊度，对提高啤酒的非生物稳定性有较大促进作用。e、增加a-氨基氮：α-氨基氮是酵母进行发酵的主要氮源，如果为酵母提供的游离氨基氮不足的活，发酵将不甚理想，导致啤酒质量低劣，而在糖化工序中加入中性蛋白酶，可以增加麦芽中的游离氨基氮含量。同时中性蛋白酶可使原料中的可溶性蛋白质很好地提取出来，并使啤酒产生良好的泡沫。56f、提高啤酒非生物稳定性：啤酒稳定性是啤酒保质、保鲜的能力。造成啤酒不稳定的因素很多，大致可分为生物混浊和非生物混浊两种。非生物混浊在啤酒混浊中是主要的，而非生物混浊中蛋白质引起的混浊又是主要的，约占90%以上，如啤酒巴氏灭菌后不久，出现热凝固蛋白沉淀，这是由于麦汁煮沸强度不够而析出；麦芽中的β－球蛋白与麦汁中的大麦表皮和酒花中的花色苷以氢键结合，也形成沉淀。为解决冷浊蛋白质引起的混浊问题，可添加酸性蛋白酶－木瓜蛋白酶（酶清）或菠萝蛋白酶分解蛋白质，木瓜蛋白酶是一种半胱氨酸蛋白酶，它可以分解与多酚相关的啤酒中的蛋白质而避免成品啤酒的冷混浊，同时并不对啤酒中形成泡沫的蛋白质起作用。脯氨酸内切酶：DSM公司产品，是黑曲霉经基因修饰改良发酵控制生产得到的酶制剂，对啤酒非生物稳定性效果明显。57g、复合作用：随着酶制剂生产技术的发展，以及工业生产应用技术的提高，国内外酶制剂公司纷纷生产出各种性能的多功能复合酶。复合酶是采用发酵方法，生产以某种酶制剂为主，其化酶为辅的产品，也有将几种性能和功用近似的配套合并在一起组成复合酶，由于复合酶的协同和互补作用，可以提高产品的收得率和设备利用率。现将主要复合酶列举如下。1).复合酶＝糖化酶＋普鲁兰酶2).复合酶＝中性蛋白酶＋中温淀粉酶＋β－葡聚糖酶3).复合酶＝中性蛋白酶＋β－葡聚糖酶＋半纤维素酶＋α—淀粉酶4).复合酶＝蛋白酶复合粉剂＋糖化酶5).复合酶＝异淀粉酶＋极限糊精酶必需指出，复合酶的应用目的必须明确，其主要功能是什么?辅助功能是什么?不可能依靠复合酶来解决所有酶的作用。应用时，其酶解条件也应以主要酶的工艺特性为主，尽可能满足主要酶所需的工艺条件，兼顾其他辅助酶，58h、其它：除以上提到的酶制剂品种以外，还有很多可以满足其他工艺的酶制剂种品，如在纯生啤酒的生产中为改善膜过滤速度，可以采用耐热真菌β－葡聚糖复合酶（含木聚糖酶和半纤维素酶，其作用是改善纯生啤酒的膜过滤效果；提高麦汁提取收率及过滤速度，增加硅藻土过滤啤酒每批的过滤量。消除由β－葡聚糖而引起的成品酒“冷混浊”。此外在生产扎啤、桶啤、鲜啤和纯生啤酒时防腐保鲜十分重要，从啤酒受微生物污染分析中看到，乳酸杆菌约占６０％，果胶杆菌占２１％，巨形环菌属和片环菌约占３％左右，其他微生物占７％，采用高效溶菌酶可以抑杀有害菌。溶菌酶是一种催化细菌细胞壁中的肽多糖的水解，它专一地作用肽多糖分子N－乙酰胞壁酸与N－乙酰氨基葡萄糖之间的β－１，４键，从而破坏细菌的细胞壁，使细胞因水解死亡，溶菌酶对酵母不起作用，它能使酵母重复使用，清酒罐中防止杂菌繁殖，还能用于大包装啤酒的生物稳定性处理；氧对啤酒风味、稳定性有较大危害。葡萄糖氧化酶是一种高效去氧复合酶，含有葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和转化酶，主要作用是除氧，能大幅度减少啤酒中溶解氧和瓶颈空间氧，最大限度消除啤酒中氧化味，延长啤酒保质期。59（4）、展望：啤酒的主要原料是麦芽等，在拓宽啤酒行业原料使用的范围上应该有很多工作可以展开，比如，在非洲SABmiller公司充分利用当地高粱做原料，开展酶制剂的应用研究，由于高粱成分比较特殊，需要B-葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶及多肽酶等组成。选育生产菌种的产毒（素）和致病性研究：产毒的量在一定范围内，不能使用致病菌。酶产品的毒理学研究：急性毒性，致突变性，30天喂养实验等。生产的GMP和原辅料：生产过程符合GMP的要求，原辅料食品级。产品的标准：符合理化和卫生标准。60第三节酶生物合成调节的基本理论一、酶的生物合成：酶在生物体内产生的过程。（蛋白质的生物合成）二、酶蛋白生物合成的调节1、酶生物合成的诱导作用2、酶合成的反馈阻遏作用3、分解代谢物的阻遏作用611、诱导作用（诱导酶）定义：加进某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的过程。酶基质基质结构类似物-半乳糖苷酶乳糖异丙基巯基-

-D-半乳糖苷

安慰性诱导物62酶基质产物葡萄糖淀粉酶淀粉麦芽糖，异麦芽糖，葡萄糖

脂肪酶油脂脂肪酸纤维素酶纤维素葡萄糖63某些商业酶的诱导

酶底物诱导物α-淀粉酶淀粉淀粉或麦芽糊精葡萄糖淀粉酶（异淀粉酶）淀粉麦芽糖或异麦芽糖转化酶蔗糖蔗糖普鲁兰酶普鲁兰普鲁兰或麦芽糖木糖异构酶木糖木聚糖或木糖642、反馈阻遏作用定义：酶催化作用的产物或代谢途径的未端产物使该酶的生物合成受阻的过程。途径终点产物与细胞内阻遏物蛋白结合，产生阻遏物，可关闭编码酶的结构基因，遏制酶的合成，这类酶叫可阻遏的酶①限制曲霉培养基中磷酸盐浓度可增加核酸酶、磷酸酯酶、植酸酶的生产30到50倍。65②色氨酸的过量积累，对色氨酸合成途径中的5种酶的生物合成均起反馈阻遏作用。E、D、C、B、A分别为邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸磷酸转移酶，邻氨基苯甲酸异构酶，吲哚甘油-3-磷酸合成酶，色氨酸合成酸。分枝酸色氨酸66调节基因（R）启动基因（P)操纵基因(O)673、分解代谢物阻遏定义：容易利用的碳源阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。葡萄糖阻遏

－半乳糖苷酶的生物合成机理：葡萄糖的大量存在，降低了胞内cAMP浓度①葡萄糖抑制腺苷酸环化酶活性，降低cAMP生成：ATP→cAMP+Pii；或②葡萄糖存在引起ATP浓度上升，消耗胞内cAMP：cAMP+H2O→ADP→ATP），结果启动子上没有cAMP－CRP复合物结合，RNA聚合酶也就无法结合到启动子的位点上。P启动子包括两个结合位点：RNA聚合酶结合位点，cAMP－CRP复合物结合位点68第四节酶的发酵生产技术酶的发酵生产：通过人工操作控制，利用细胞（包括微生物细胞、植物细胞和动物细胞）的生命活动，产生人们所需要酶的过程。一、微生物发酵产酶方式1.固体培养定义：利用麸皮和米糠为主要原料，添加谷壳，豆饼等，加水拌成半固体状态，供微生物生长和产酶用。适合来源于霉菌的酶制剂的生产，如米曲霉的α-淀粉酶、蛋白酶、乳糖酶；木酶的纤维素酶；黑曲霉的果胶酶等。产生的酶具有混合与酶活性强的特点。方法：浅盘法、转桶法、厚层通气法69浅盘法：将固态培养基平铺在浅盘（多为木盘或竹匾）内，厚约3-5厘米，在能够控制湿度、温度的曲房里进行发酵。转桶法：将固态培养基接入菌种后，放在可旋转的转桶内，当桶慢慢转动时，培养基即在转桶内翻动，通气及温湿度调节较为均匀，有利于微生物的生长和产酶。厚层通气法：将固体培养基接入菌种后，平铺在具有多孔的大池内，厚度可达20-30厘米；待微生物已开始生长，即从池底通入一定温度和相对湿度的空气，使微生物比较均匀适宜地生长繁殖和产酶。707172优点：①设备简单，投资较少。②环境污染少；③特别适用于霉菌的培养和发酵产酶。缺点：①劳动强度大；②原料利用率低；③产酶纯度较差；提取精制较难；④传质传热效率低，发酵条件不易控制均匀，产酶不稳定；⑤不宜胞内酶生产（菌体分离难度大）732.液体深层发酵液体表面发酵，目前已不采用。液体深层通风发酵，主要设备是一个具有搅拌桨叶和通气系统的密闭容器。优点：①产酶纯度高，质量稳定；②较易控制发酵条件，有利于自动化控制；③机械化程度高，劳动强度小；设备利用率高。缺点：设备投资较大，能源消耗大。747576773.固定化细胞发酵优点：①固定化细胞的密度大，反应器生产强度大；②发酵稳定性好，可以连续使用较长时间，易于连续化，自动化生产；③可在高稀释率的条件下连续发酵,提高设备利用率；④发酵液含菌体较少，利于产品分离。缺点：①不能强烈搅拌；②技术要求高，传质传热效果差（氧气供给，温度控制。培养基成分的控制）；理论研究阶段；③只适用于胞外酶的生产；78二、发酵工艺条件及控制

1．酶的发酵生产要求①性能优良菌种（产率，稳定性，发酵周期，营养要求，副产物，安全性）②满足菌种生长需求；③满足菌种产酶需求。792．酶发酵生产的工艺流程保藏菌种

菌种活化

菌种扩大培养

发酵

分离纯化

酶803、培养基微生物酶生产的培养基微生物酶生产的培养基与其它发酵产品的培养基一样，都包括碳源、氮源、无机盐和生长因子。在酶制剂的生产过程中常加入产酶促进剂，即加入少量的某种能显著增加酶产量、作用并未阐明清楚的物质。在酶的发酵生产中，对于诱导酶来详，在培养基中添加适量诱导物，也可使产酶量显著提高。产酶诱导物通常是酶作用的底物或底物类似物，如常用的产酶促进剂有吐温-80、植酸钙镁、洗净剂LS、聚乙烯醇、乙二胺四乙酸等。81培养基设计考虑：①菌种特性②不同培养阶段③产物④原料来源难易。培养基的营养成分：碳源：构成菌体成分的元素，能量的来源。氮源：含氮物质的如氨基酸、蛋白质、核酸等的成分。无机盐生长因子产酶促进剂82几种农副产品和野生淀粉质原料成分（近似%）

原料名称

水分

粗淀粉

粗蛋白

粗脂肪

粗纤维

灰分

甘薯干

12.976.66.10.51.42.4玉

米

12.073.08.54.31.31.7麸

皮

12.155.413.53.810.44.8米

糠

11.538.516.018.57.05.5马铃薯

68.526.72.60.10.91.2木

薯

70.321.41.20.41.10.5土茯苓

10.852.52.7——11.52.3橡

子

11.055.05.7——————石蒜——40.04.5——0.99.7(2)碳源：83几种常用有机氮源成分（近似%）

原料名称

水分

粗淀粉

粗蛋白

粗脂肪

粗纤维

灰分

豆

饼

12.527.543.011.57.85.8花生饼

10.724.346.87.98.74.9菜籽饼

4.629.938.111.410.15.9棉籽饼

6.628.640.37.410.86.2常用无机氮源：硫酸铵、氯化铵、氨水84（4）无机盐角色：蛋白质（包括酶）和核酸的主要元素（参与细胞的组成，细胞能量代谢，调节细胞膜的透性，酶的激活剂），并对培养基的pH，氧还电位，渗透压起调节作用。主要元素：磷、硫、钾、镁、钙、钠、微量元素：铁、铜、锌、锰、钴、85磷，特别重要的元素作用：构成核酸和磷脂的成分；参与所有的能量转移过程（ATP，GTP）；许多酶的组成成分。常用的补磷剂：KH2PO4，K2HPO4，Na2HPO4，(NH4)2HPO4，H3PO4微量元素：有的是某些酶组成成分，有的是酶的激活剂，有的是辅酶的必须成分。天然原料中常已存在，一般无须另外加入。86（5）生长因子定义：细胞生长繁殖不可缺少的微量有机化合物，如aa,Vit,嘌呤，嘧啶，激素提供生长素的天然原料：玉米浆(含生长素32-128mg/ml、豆芽汁、麦芽汁，酵母膏等。举例：添加含有生长因子的大豆的酒精提取物，米曲霉的蛋白酶产生量提高2.9倍，金黄曲霉的脂肪酶产生量提高2.6倍87（6)产酶促进剂定义：凡能显著增加酶产量的某种少量物质，主要为酶的诱导物或表面活性剂，酶的底物或底物类似物，诱导物的前体。纤维素酶生产中纤维二糖是诱导物。表面活性剂能增加酶的产量，土温80，植酸钙镁、洗净剂LS、聚乙烯醇、EDTA等。酶的诱导物：酶作用底物、酶反应产物、酶的底物类 似物表面活性剂：①提高膜的通透性②对酶的失活有保护作用③消泡以提高氧传递系数88添加吐温80（0.1%）对多种酶产量提高的倍数

酶

来源

酶产量提高倍数

纤维素酶

多种霉菌

20蔗糖酶

多种霉菌

16β-1,3葡聚糖酶

多种霉菌

10β-葡萄糖苷酶

多种霉菌

8木聚糖酶

多种霉菌

4淀粉酶

多种霉菌

4核苷酶

多种霉菌

5酯酶

多种霉菌

6右旋糖苷酶

绳状青霉

2茁霉多糖酶

产气气杆菌

1.589三、发酵过程的控制1.发酵过程中的代谢变化与代谢变化有关的参数1）物理参数：温度、压力、搅拌转速、搅拌功率、溶解氧等。2）化学参数：基质浓度、pH值、酶活力。3）生物参数：菌体形态，菌体浓度等。生长代谢曲线1）菌体生长阶段2）产酶阶段3）菌体自溶阶段90912.影响产酶的重要条件与细胞的生物繁殖以及发酵产酶有密切关系。①影响微生物体内各种酶的活性，从而导致微生物的代谢途径发生改变；②影响微生物形态和细胞膜的透性，从而影响微生物对培养基中的营养成分的吸收和代谢产物的分泌。③影响培养基中某些营养物质的分解或中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。（1）、pH值对酶生产的影响及控制92酶生产的适宜的pH值通常与酶反应的最适pH值相接近。但酶反应的最适pH值对某些酶来说可能是最不稳定的。在这种情况下，酶反应的最适pH值与酶生产的合适pH值差距就较大。如黑曲霉3350酸性蛋白酶反应的最适宜pH值为2.5-3.0，而在pH6左右培养时酸性蛋白酶产量较高。细菌、放线菌6.5-8.0霉菌、酵母菌4.0-6.0植物细胞

5-6产酶最适pH：酸性蛋白酶4-6，中性蛋白酶6-7，碱性蛋白酶8.5-9；一般接近该酶反应的最适pH93发酵过程中培养基pH的变化由菌种的特性、培养基组分、发酵条件等决定，引起pH变化的主要原因：微生物对培养营养成份的利用和代谢产物的积累。生理酸性物质的生成或释放，或生理碱性物质的消耗导致发酵液pH下降。生理碱性物质的生成或释放，或生理酸性物质的消耗导致发酵液pH上升。由于酶生产受培养基pH值的影响，故可利用培养基pH值来控制酶活性。例如利用黑曲霉生产糖化酶时，除糖化酶外还有α-淀粉酶和葡萄糖苷转移酶的存在。当pH值在中性时，糖化酶的活性高，其他两种酶的活性低。其他两种酶特别是葡萄糖苷转移酶，因为它的存在严重影响葡萄糖吸收，在糖化酶生产时是必须除去的。因此将培养基pH值调节到酸性就可以使这种酶的活性降低，如pH值达到2-2.5则有利于这种酶的消除。94培养基的pH值和碳氮比密切相关，因此微生物生产酶类的pH值也和碳氮比有关。例如米曲霉在碳氮比高的培养基中培养，产酸较多，pH值下降，有利于酸性蛋白酶的生成；在碳氮比低的培养基中培养，则pH值升高，有利于中性和碱性蛋白酶生成。由此可见，在酶生产过程中通过培养基的碳氮比来控制pH值，从而控制酶产量是很重要的。酶生产的pH值控制，一般根据酶生产所需求的pH值确定培养基的碳氮比和初始pH值，在一定通气搅拌条件的配合下，使培养过程的pH值变化适合酶生产的要求。但是，也有在培养基中添加缓冲剂使其具有缓冲能力以维持一定pH值的；也有在培养过程中当培养液pH值过高时添加糖或淀粉来调节，pH值过低时用通氨或加大通气量来调节的。此外，也有用补料来控制培养基的碳氮比和pH值。95pH控制①初级调节控制（起始培养基）调整C/N，调整生理酸性物质与生理碱性物质之比。②补料调节：流加酸/碱，初加碳、氮源③溶解氧调节：控制代谢中间产物的氧化程度。④维持一定的pH值，添加缓冲液96（2）、温度温度是影响细胞生长繁殖和发酵产酶的重要因素之一。酶发酵培养温度随菌种不同而不同。细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度亦不同。1最适生长温度：枯草杆菌34-37℃，黑曲霉28-32℃，植物细胞25℃2最适产酶温度低于最适生长温度，在较低温度下，提高酶的稳定性，延长细胞产酶时间。3有些酶的发酵生产，要在不同阶段控制不同温度条件。在产酶过程中，为了有利于菌体的生长和酶的合成，可采用阶段控制温度，即在生长期，控制生长的最适温度，在酶的合成期采用生产的最适温度。但由于微生物合成酶的模式不同，应根据合成模式，来控制适宜的温度。97一般在较低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长细胞产酶时间。例如，用酱油曲霉生产蛋白酶，在28℃条件下发酵，蛋白酶产量比在40℃条件下高2-4倍；在20℃条件下发酵，蛋白酶的产量会更高。但并不是温度越低越好，若温度过时低，氧化反应速度很慢，反而降低酶的产量，延长发酵同期，故必须进行试验，以确定最佳产酶温度。酶生产的培养温度随菌种不同而不同，同一种微生物，在不同温度下，可产生不同的酶，同一种酶也可由不同的微生物产生。例如利用芽孢杆菌生产蛋白酶，常采用30-37℃，而霉菌、放线菌的蛋白酶生产以28-30℃为佳。在20℃生长的低温细菌，在低温下形成蛋白酶最多。嗜热微生物在50℃左右蛋白酶产量最大。98例：用枯草芽胞杆菌AS1.3398生产中性蛋白酶，采用变温发酵培养温度必须从30℃逐渐升温至40℃，然后再降温至31℃进行培养，蛋白酶产量比不变温高66％温度控制发酵时间发酵单位变温0-4h30-30℃4-8h32-40℃(2℃/h↑)26.57100u/ml8-12h40-32℃(2℃/h↓)12h后30-32℃恒温30-32℃27h4275u/ml99（3）、溶解氧对酶生产的影响酶生产所用的菌体一般都是需氧微生物，培养时都需要通风搅拌，但培养基中溶氧的浓度因菌种而异。一般，通气量少对霉菌的孢子萌发和菌丝生长有利，对酶生产不利。例如米曲霉的淀粉酶生产，培养前期降低通气量则促进菌体生长而酶产量减少；通气量大则促进产酶而对菌体生长不利。又如，以栖土曲霉生产中性蛋白酶，风量大时菌丝生长较差，但酶产量是风量大时的7倍。然而并不是利用曲霉进行酶生产时产酶期的需氧量都比菌体生长期大，也有氧浓度过大而抑制酶生产的现象。例如黑曲霉的淀粉酶生产，酶生产时的需氧量为生长旺盛时菌的需氧量的30-40％。100利用细菌进行酶生产时，一般培养后期的通气搅拌程度比前期剧烈，但也有例外的情况，例如枯草杆菌的α-淀粉酶生产，在对数生长期末降低通气量可促进α-淀粉酶生产。据报道，利用霉菌进行固体培养生产蛋白酶时，CO2对孢子萌发与产酶有作用，而不利于生长，因此在孢子发芽与产酶时通入的空气中掺入CO2有利于提高酶产量。在枯草杆菌的α-淀粉酶生产中，CO2对细胞繁殖与产酶均有影响，当通入的空气中含CO28％时，α-淀粉酶活性比对照提高3倍。101调节溶氧速率的方法：①调节通气量。②调节氧的分压：富氧增加空气压力。③调节气液接触时间：增加液位高度，增设档板。④调节气液接触面积：提高搅拌速率，空气分布管及其直径⑤培养液的特性：粘度、表面张力、菌体浓度，离子浓度。如培养液粘度高，通气搅拌也要加强，以利于提高溶氧。102（4）、泡沫

1酶制剂发酵过程中产生的泡沫较多，产生原因：强烈的通气搅拌和培养基中天然蛋白质原料含量较高。2造成危害：①阻碍CO2的排除，影响氧的溶解；②溢罐，导致浪费原料，引起染菌；③装液量减少，降低发酵罐的利用率。3采取措施：①减少泡沫形成（原料，罐压，搅拌）②机械消泡与化学消泡。消泡剂：天然油脂；高碳醇脂肪酸和酯；聚醚；硅酮。103（5）、发酵过程的中间补料补料方案：①补糖(碳源)②补氮源③补无机盐和产酶促进剂④补全料和补水。-淀粉酶：用3倍浓度碳源的培养基补料，体积相当于基础料的1/2；从培养12h开始，每小时1次，分30余次添加完毕。糖化酶：补氨水，C、N源总浓度30-35%酶活25000-30000U/ml104（1）、添加诱导物:对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物能使酶的产量显著增加。一般可分为三类：①酶的作用底物②酶的反应产物③酶的底物类似物3、提高酶产量的措施

（2）降低阻遏物浓度微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法使培养基中的碳源保持在不致于引起分解代谢物阻遏的浓度。1053、表面活性剂：改变细胞的通透性4、添加产酶促进剂:产酶促进剂是指可以促进产酶、但作用机理并未阐明清楚的物质。添加产酶促进剂往往对提高酶产量有显著效果。例如添加植酸钙可使多种霉菌的蛋白酶和橘青霉的5'5'--磷酸二酯酶的产量提高2-20倍。106第五节酶发酵动力学酶发酵动力学：研究发酵过程中速率及其影响因素的科学。包括细胞生长动力学、反应基质消耗动力学和酶生成动力学等。107一．微生物细胞生长与产酶的关系产酶细胞在一定条件下进行培养,其生长过程要经历调整期、对数生长期、平衡期和衰退期四个阶段。通过分析酶产生与细胞生长的关系，可以把酶的生物合成模式分为以下四种类型1081091、同步合成型：酶的合成与生长同步进行。酶的生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。去除诱导物或细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止。酶的合成与细胞生长同步进行，细胞进入对数生长期，酶大量产生，细胞生长进入平衡期后酶的合成随着停止表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。米曲霉可由单宁诱导生成鞣酸酶（单宁酶）dP/dt=α·dX/dtqP=α·μqP：产物比生产速率α：产物得率(g产物/g菌体）μ：菌体比生产速率(h-11102、延续合成型酶的合成伴随着细胞的生长而开始，但在细胞生长进入稳定期后，酶还可以延续合成较长的一段时间。该类酶的生物合成可以诱导，但不受分解代谢物和反应产物阻遏。这类酶所对应的mRNA相当稳定，在生长稳定期以后相当长的一段时间内继续用于酶的合成。在细胞生长期和平衡期均可产生酶，是部分生长偶联型.黑曲酶生产β-半乳醛酸酶，经纯果胶为诱导物时酶的合成为延续合成型dP/dt=α·dX/dt＋β·XqP=α·μ＋ββ：与菌体生长非相关的产物比生成速率（g产物/g细胞.h)1113、中期合成型酶合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞进入稳定期后，酶的合成也随着停止。酶的合成特点：为特殊的生长偶联型，其产酶动力学方程与同步合成型相同，然而，在有阻遏物存在时，α＝0，无酶产生，在解除阻遏后，才开始酶的合成。受反馈阻遏，而且其所对应的mRNA不稳定。

枯草杆菌合成碱性磷酸酶