药品无菌检查

药品无菌检查及相关知识吉林省药品检验所微生物室主要内容1、药品无菌检查法根底2、2021年版药典无菌检查法的变动3、洁净实验室微生物的监测和控制4、菌种的管理5、二级生物平安实验室药品无菌检查法定义及特点培养基、冲洗液方法学验证供试品的无菌检查无菌检查的要点药品无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。假设供试品符合无菌检查法的规定,仅说明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。也并不表示所有的产品都是无菌的。反之，当供试品中检出微生物污染，那么可以认为批产品的微生物污染风险相当高。药品无菌检查法无菌制剂比非无菌制剂存在更高的风险一系列的药品不良事件2006年的“欣弗事件〞---安徽华源生产的“克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液〞引起了11人死亡，93人感染，企业倒闭，总经理自杀。未按批准的工艺参数灭菌，降低灭菌温度、缩短灭菌时间，增加灭菌柜装载量，影响了灭菌效果，经中检所检验，发现无菌不合格。2021年10月，美国新英格兰合成制药中心生产的注射用类固醇霉菌污染，造成数百人感染真菌脑炎，至年底统计死亡39人。这些事故促使无菌制剂GMP监管的进步，同时也对无菌检验提出更高更严的要求。药品无菌检查法特点无菌检验结论为一次性，药典规定为不得复试，为什么不得复试，菌落的分布具有不均匀性，检验过程是破坏性的，不具有重复性。---------------对操作过程的要求非常高。过程的控制----------1、环境控制；2、操作影响，人员、物流是否引入外源性污染？无菌性检查灵敏度检查SOP操作有效的结果有效的方法环境保证培养基保证方法学验证过程控制结果判断可靠的结论药品无菌检查法培养基配制后采用验证合格的灭菌程序灭菌。什么是验证合格的？保存条件：2-25℃、避光，非密闭容器在3周内使用，密闭容器一般在1年内使用。流乙醇酸盐流体：供试品接种前，培养基氧化层不超过深度的1/5，否那么100℃水浴加热至粉红色消失〔不超过20分钟〕，只能加热一次，培养结束后氧化层不超过1/2药品无菌检查法药品无菌检查法培养基适用性检查无菌性—每批次培养基取不少于5瓶〔支〕，培养14天，应无菌生长。灵敏度6种菌〔<100cfu〕金、铜绿、生孢---------流乙醇酸盐流体7支，12ml/支，每种菌接种2支，阴性一支，枯草、白念、黑曲----------胰酪大豆胨液体7支，每种菌接种2支，9ml/支，一支阴性流乙醇酸盐流体培养3天，胰酪大豆胨液体5天，空白对照管应无菌生长，假设加菌的培养基管均生长良好，判断该培养基的灵敏度符合规定药品无菌检查法冲洗液0.1%蛋白胨水溶液pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液可选用其他经验证过的适宜的溶液药品无菌检查法方法适用性试验证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。假设检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。菌种：金葡、大肠、枯草、生孢、白念、黑曲方法：1、薄膜过滤2、直接接种药品无菌检查法薄膜过滤法试验组：取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中参加小于100cfu的试验菌，过滤。将培养基加至滤筒内。对照组：另取一装有同体积培养基的容器，参加等量试验菌，培养时间不得超过5天。药品无菌检查法直接接种法取流乙醇酸盐流体培养基〔不少于15ml〕6管，分别参加金葡、大肠、生孢各2管，其中一管接入供试品，另一管作为对照，TSB〔不少于10ml〕6管，分别参加枯草、白念、黑曲各2管，其中一管参加供试品，另一管作为对照，培养时间不得超过5天。结果判断：与对照管比较，试验组的试验菌生长良好，那么说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用可以忽略不计；如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长----供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用-----增加冲洗量、培养基用量、中和剂或灭活剂、更换滤膜品种，重新进行方法适用性试验。药品无菌检查法供试品的无菌检查检验数量：一次试验所用供试品最小包装容器的数量

出厂产品按表1，上市产品监督检验按表2

最少检验数量不包括阳性对照用的。

检验量：按表3，采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。

药品无菌检查法1、薄膜过滤法封闭式薄膜过滤器只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤抗生素样品选用低吸附的滤膜水溶性供试品过滤前先将少量冲洗液过滤以润湿滤膜油类供试品的滤膜和滤器在使用前应充分枯燥冲洗量一次一般为100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以免膜上的微生物受损。总冲洗量特别大时应尽量减小流速。药品无菌检查法水溶性的液体-----直接过滤或混合至含不少于100ml适宜稀释液的无菌容器中，混匀，立即过滤，如供试品有抑菌作用，须冲洗一般不少于三次。水溶性的固体----溶取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签复溶。非水溶性供试品-----直接过滤，或乳化后〔加吐温80等〕立即过滤，用含0.1-1%吐温80的冲洗液冲洗，培养基中可参加吐温80可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油性供试品-----溶解于适量无菌十四烷酸异丙酯中，过滤，加热仍然没法过滤的，萃取，静置，取水层过滤无菌气雾剂----在-20℃冷冻1小时，取出在容器上钻一小孔释放抛射剂后再无菌开启容器，转移至无菌容器中。装有药物的注射器供试品——注意应采用适宜的方法进行包装中所配带的无菌针头的无菌检查带有导管的医疗器具〔输血、输液袋等〕---每个最小包装用50-100ml冲洗液分别冲洗内壁，过滤冲洗液。同时注意应采用直接接种法对配带的无菌针头做无菌检查药品无菌检查法2、直接接种法培养基的用量符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，流乙醇酸盐每管装量不少于15ml，TSB不少于10ml适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的。药品无菌检查法混悬液等非澄清水溶液供试品取规定量，等量接种至各管培养基中固体供试品取规定量，直接等量接种至各管培养基中，或参加适宜的溶剂溶解，或按标签说明复溶后，取规定量等量接种至各管培养基中。非水溶性供试品参加适量的乳化剂及稀释剂使其乳化再接种，或直接接种至含乳化剂的培养基中敷料供试品以无菌操作拆开每个包装，于不同部位剪取约100mg或1cm*3cm的供试品，等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。肠线、缝合线等供试品取最小包装，无菌拆开包装，等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。灭菌医用器具供试品必要时将其拆散或切成小碎段，等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。放射性药品取供试品1支，等量接种于装量为7.5ml的流乙醇酸盐流体培养基和TSB中。每管接种量为0.2ml。药品无菌检查法阳性对照

无抑菌作用及抗革兰氏阳性菌为主的----金葡抗革兰氏阴性菌为主的------大肠抗厌氧菌的------生孢梭抗真菌的-----白念阳性对照72小时内生长良好阴性对照

相应的溶剂、稀释液、冲洗液同法操作，不得有菌生长药品无菌检查法培养及观察液体培养基浑浊物理变化？化学变化？生物学变化？培养14天，逐日观察并记录，注意和阳性、阴性比照，培养14天后依然无法从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液转种至同种新鲜培养基，培养3天，观察是否再次出现浑浊。药品无菌检查法假设明显浑浊------怎么办？1〕立即转接2ml该培养物至相同的培养基中继续培养；2〕取5支冻存管，每管分装1ml浑浊培养物，-80℃保存；3〕取浑浊培养物在TSA平板/血琼脂上划线，别离污染微生物；4〕如果发现硫乙醇酸盐流体培养管变浑浊，还应增加血平板划线，并在厌氧条件下培养别离厌氧菌。由平板别离到的菌落应进一步鉴定，并逐一保藏。药品无菌检查法结果判断阳性对照生长良好，阴性不得有菌，否那么试验无效假设供试品澄清，或虽然浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定假设任何一管浑浊并确证有菌生长，判不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，符合下面至少一个条件：1、无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求2、回忆试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素3、供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和〔或〕无菌操作技术不当引起的。假设确认无效，应重试。药品无菌检查法要点一个标准的SOP，物料进场，外围消毒剂消毒外表，撤除外包装，洁净传递，风淋、紫外照射，过氧化氢灭菌等，由低级别向高级别递进，最后到达A级核心区人员进场，合理的更衣程序，A/B级：应用头罩将所有头发以及胡须等相关部位全部遮盖，，必要时戴防护目镜。应戴经灭菌且无颗粒物〔如滑石粉〕散发的橡胶或塑料手套，穿经灭菌或消毒的脚套，裤腿应塞进脚套内，袖口应塞进手套内。工作服应为灭菌的连体工作服，不脱落纤维或微粒，并能滞留身体散发的微粒。无菌操作技术，动作熟练，关键点的控制实验过程的监控：环境菌，外表微生物，手部微生物，对环境菌进行鉴定，建立档案，以便OOS调查，进行溯源。2021年版药典的变化主要修订点改进马丁培养基修订为胰酪大豆胨肉汤培养基〔TSB〕无菌检查实验条件由“万级下的局部百级〞修订为“B+A〞三部药典的统一2021年版药典的变化药典2010年版2015年版名称改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基

配方蛋白胨-----5.0g胰酪胨------17.0g酵母浸出液-----2.0g大豆木瓜蛋白酶水解物-----3.0g葡萄糖------20.0g氯化钠------5.0g磷酸氢二钾-----1.0g磷酸氢二钾--------2.5g硫酸镁-----0.5g葡萄糖-------2.5g目的培养真菌需氧菌、真菌、专性和兼性厌氧菌培养条件23-28℃20-25℃培养基的变化2021年版药典的变化意义1、与国际接轨USP\BP2、培养-观察的体系改变，取消严格意义上的以真菌、细菌划分的培养，而以需氧、厌氧的培养体系来划分，是一个更加广泛，更加互补的体系。2021年版药典的变化培养基的改变导致阳性菌的培养条件改变培养基灵敏度实验：2021年版药典的变化方法适用性实验：2021年版药典的变化菌种的培养条件改变2021年版药典的变化无菌检查实验条件由“万级下的局部百级〞修订为“B+A〞和以前的100级、10000级的区别？需要怎么控制环境？洁净实验室洁净室的定义及分级两版药典对洁净室的要求比照洁净室微生物的监测与控制微生物鉴定隔离器简介消毒剂的选择与使用几种空间灭菌方法洁净实验室洁净室的定义与分级药品洁净实验室是指用于药品无菌或微生物检验用的洁净实验室、隔离系统及其它受控环境。洁净室不是绝对无菌的。概念不等于无菌室〔命名需准确〕洁净实验室洁净室的分级ISO14644---按悬浮粒子大小划分了洁净室的级别〔等级1-9级〕ISO14698---洁净室及其相关控制环境洁净实验室各国不同法规对于洁净室污染控制的要求比照美国联邦标准FED-STD-209E：率先建立了由悬浮粒子含量规定空气洁净度的分级标准，以每立方英尺空气所含最大允许微粒的数量确定，分为1、10、100、1000、10000、100000六个级别。国际标准ISO14644-1：空气洁净度分为9个级别，比美国联邦标准多出3个。美国FDA?无菌工艺药品CGMP工业指南?：以动态期间在物料漏置临近处所测数据为依据，强调了动态概念，对微生物进行了控制，100、1000、10000、100000对应ISO5、6、7、8美国药典?1116?：根据美国联邦标准改编，M1-M7欧盟GMP：A、B、C、D，静态、动态监测、强调了粒子的在线监测2021年版GMP:等同于欧盟洁净实验室按空气悬浮粒子大小和数量的不同参考现行“药品生产质量管理标准〞分为A、B、C、D4个级别。洁净实验室初次使用的洁净实验室应进行参数确认，确认参数包括物理参数、空气悬浮粒子和微生物。物理参数空气悬浮粒子微生物浮游菌沉降菌外表微生物空气过滤器完整性，气流组织、空气流速，换气次数、压差、温度和相对湿度参数确认执行标准?洁净室施工及验收标准?附录D3高效空气过滤器现场扫描检漏方法粒子计数器法、附录E12气流的检测、附录E1风量和风速的检测、附录E2静压差的检测、附录E5温湿度的检测洁净实验室2021年版与2021年版的物理指标相比100级与A级比较，单向流断面风速相差较大，100级洁净区需要增加循环风量才能到达A级，10000级洁净区空调系统需要增加1倍的送风量，才能到达B级洁净实验室洁净室微生物监测和控制定期清洁、消毒、消毒效果验证包括：非生物活性的空气悬浮粒子数和有生物活性的微生物监测，其中微生物监测包括环境浮游菌和沉降菌监测，及关键的检测台面、人员操作服外表及5指手套等的微生物检测。洁净实验室悬浮粒子用于空气洁净度分级的空气悬浮粒子尺寸范围在0.1μm-1000μm的固体和液体粒子。洁净实验室方法：GB/T16292-2021?医药工业洁净室〔区〕悬浮粒子的测试方法?采样点数目：最少采样数，两种方法，一、NL—最少采样点A—洁净室或被控洁净区的面积，单位为平方米〔单向流，垂直于气流方向上的横截面积〕洁净实验室二|查表洁净实验室采样点位置与分布：离地面0.8m高度的水平面上均匀分布采样点多于5点时，也可在离地面0.8-1.5m高度的区域内分层布置，每层不少于5点静态测试时，采样点布置力求均匀〔附录A〕，动态测试，应根据关键操作区布置。洁净实验室采样次数：对任何小洁净室〔区〕或局部空气净化区域，采样点数目不少于2个，总采样次数不少于5次，每个采样点的采样次数可以多于1次，不同采样点的采样次数可以不同每次采样量：洁净实验室计算：〔计算详细见GB标准〕结果：每个采样点的平均悬浮粒子浓度必须不大于规定的级别界限全部采样点的悬浮粒子浓度平均值均值的95%置信上限必须不大于规定的级别界限，UCL≤级别界限洁净实验室浮游菌、沉降菌：洁净度级别2010年版浮游菌/m3沉降菌/皿，0.5h100≤5＜11000——10000≤100≤3100000≤500≤10洁净实验室方法：GB/T16293-2021?医药工业洁净室〔区〕浮游菌的测试方法?GB/T16293-2021?医药工业洁净室〔区〕沉降菌的测试方法?浮游菌最少采样点——参照悬浮粒子GB/T16292-2021采样点的位置——参照悬浮粒子GB/T16292-2021工作区测点位置离地0.8-1.5m左右〔略高于工作面〕送风口测点位置离开送风面30cm左右。可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。采样次数——每个采样点采样一次洁净实验室最小采样量：洁净度级别采样量L/次100100010000500100000100300000100本卷须知单向流区域，采样器采样口朝向应正对气流方向；非单向区域，采样口朝上。采样点避开回风口。测试人员站在采样口的下风侧，尽量少走动。为防止培养皿运输或搬动过程的影响，应对培养皿做阴性对照〔不暴露采样〕，应无菌生长。记录———测试者名称，日期，测试依据，洁净室的平面位置，测试仪器，方法描述，包括测试环境条件，采样点位置，布置图，测试次数，采样量，测试仪器检定证书，动态测试应记录现场人员数量位置，设备的数量和位置，测试结果。洁净实验室结果每点浮游菌平均浓度〔个/m3〕=菌落数/采样量结果评定每个测点的浮游菌平均浓度必须低于标准的界限静态测试，某点浮游菌平均浓度超过评定标准，那么应重新采样两次，两次结果均合格才能判定为合格。洁净实验室沉降菌最少采样点参照悬浮粒子GB/T16292-2021采样点的位置参照悬浮粒子GB/T16292-2021最少培养皿数洁净度级别最少培养皿数（90mm）1001410000210000023000002洁净实验室结果计算平均菌落数=(M1+M2+……MN)/NM1——1号培养皿菌落数N——培养皿总数结果评定—同浮游菌洁净实验室外表微生物外表微生物测定是对环境、设备和人员的外表微生物进行监测，方法包括接触碟法和擦拭法。接触碟法——将充满规定的琼脂培养基的接触碟对规那么外表或平面进行取样，然后置适宜的温度下培养一定时间并计数，每碟取样面积约为25cm2，微生物计数结果以cfu/碟报告；擦拭法——接触碟法的补充，用于不规那么外表的微生物监测，特别是设备的不规那么外表。擦拭法是采用适宜尺寸的无菌模板确定擦拭的面积，取样后，将拭子置适宜的缓冲液或培养基中，充分振荡，然后采用适宜的方法计数，每个拭子取样面积为约25cm2，微生物计数结果以cfu/拭子报告。接触碟法和擦拭法采用的培养基、培养温度和时间同浮游菌或沉降菌〔一般采用TSA，当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时，可增加SDA〕外表菌测定应在实验结束后进行。洁净实验室推荐的药品洁净实验室的监测频次及监测工程洁净度级别悬浮粒子浮游菌沉降菌表面微生物A级每月每月每次每次B级每季度每季度每周每周C级每半年每半年每季度每季度D级每半年每半年每半年每半年洁净实验室如果出现连续超过纠偏限和警戒限、关键区域内发现有污染微生物存在、空气净化系统进行任何重大的维修、消毒规程改变、设备有重大维修或增加、洁净室〔区〕结构或区域分布有重大变动、引起微生物污染的事故、日常操作记录反映出倾向性的数据时应考虑修改监测频次。洁净实验室洁净实验室偏差处理当微生物监测结果超出警戒限度和纠偏限度时，应当按照偏差处理规程进行报告、记录、调查、处理以及采取纠正措施，并对纠正措施的有效性进行评估。微生物鉴定建议对受控环境收集到的微生物进行适当水平的鉴定1、有助于预期常见菌群。2、有助于评估清洁/消毒方法、消毒剂的有效性。3、有助于污染源的调查，辅助OOS调查。

洁净实验室微生物鉴定通那么9205“药品洁净实验室微生物监测和控制指导原那么〞建议对洁净室和其他受控环境别离到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺〔如培养基灌装〕失败时，对检出的微生物鉴定至少到达种属水平，必要时到达菌株水平。洁净实验室微生物鉴定借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程。洁净实验室鉴定程序—别离纯化—初筛试验—表型微生物鉴定—基因型微生物鉴定〔16SrDNA、18SrDNA、聚合酶链式反响、DNA-DNA杂交、焦磷酸测序、多位点序列分型等〕洁净实验室别离纯化纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体平板划线法是最常用的技术洁净实验室初筛试验〔革兰氏染色、芽孢染色、镜检观察细胞形态、重要的生化反响〕重要的生化筛选试验—氧化酶试验：氧化酶阳性：不发酵的革兰氏阴性杆菌、氧化酶阴性：肠道菌—过氧化氢酶试验阳性：葡萄球菌阴性：链球菌—凝固酶试验阳性：致病性阴性：非致病性洁净实验室表型微生物鉴定—培养物〔菌落形态、菌落颜色、形状、大小和产色素〕—形态学〔细胞形态、大小、形状、鞭毛、内容物、革兰氏染色、芽孢和抗酸染色、孢子形成模式〕—生理学〔氧气耐受性、pH值范围、最适温度和范围、耐盐性〕—生化反响〔碳源利用、碳水化合物的氧化或发酵、酶的模式〕—抑制性〔胆盐耐受性、抗生素敏感性、染料耐受性〕—血清学〔凝集反响、荧光抗体〕—化学分类〔脂肪酸构成、微生物霉素、全细胞组分〕—生态学〔微生物来源〕洁净实验室基因型微生物鉴定—微生物由于特殊环境的影响，表型特征常发生变异，传统形态学鉴定手段难以得到种水平结果，以其核酸序列为鉴定根底，从遗传进化角度说明微生物种群之间的分类学关系—〔16SrDNA、18SrDNA、聚合酶链式反响、DNA-DNA杂交、焦磷酸测序、多位点序列分型等〕洁净实验室洁净实验室洁净实验室—?伯杰氏系统细菌学手册?对细菌的分类是通过遗传物质的分析比较来实现。—基因鉴定法不但技术需要保证，还需要昂贵的分析设备和材料，通常在关键微生物调查中使用，如产品不合风格查，假设使用，方法必须经过确认鉴定方法确实认包括：准确度、专属性、重现性、灵敏度、阳性预测值、阴性预测值洁净实验室隔离器分类：硬仓、软仓结构：1、空气处理系统〔高效空气过滤器〕2、传递接口及传递门3、灭菌设备〔一般为过氧化氢、过氧乙酸等灭菌〕4、配套设备与辅助设备洁净实验室洁净实验室洁净实验室隔离系统的验证1、操作验证2、隔离器完整性验证3、灭菌验证4、灭菌循环验证5、隔离器内部洁净度验证6、仪器仪表验证洁净实验室药品洁净实验室怎样实现微生物的良好控制？处于受控状态？1、硬件设施的满足洁净室的验收应符合标准，换气次数，送风量、环境温湿度等等2、良好的环境管理，清洁、消毒程序，并严格执行，选择适当的消毒方式，合理的消毒剂，清洁消毒频率。监测到位。3、减少人员干预，人是最大的污染源，标准人员进出洁净区的程序，严格按照A/B洁净区的要求做好人员防护。做好人员培训。4、控制物流的干扰，做好物流的消毒、外外表灭菌工作，减少物流的污染5、应当对监测数据进行分析、回忆，通过收集的数据和趋势分析，总结和评估洁净实验室是否受控。

洁净实验室消毒剂的选择与使用微生物的抗力从小到大排列一般为：—细菌繁殖体—真菌繁殖体—真菌孢子—病毒—分枝杆菌—细菌芽孢洁净实验室消毒剂选择、使用将消毒剂种类分为四个作用水平〔1〕灭菌：可杀灭一切微生物〔包括芽孢〕到达灭菌保证水平的方法。甲醛、戊二醛、环氧乙烷、过氧乙酸、过氧化氢等。〔2〕高水平消毒法：可以杀灭各种微生物，对芽孢杀灭到达消毒效果的方法。这类消毒方法应能杀灭一切细菌繁殖体〔包括结核分枝杆菌〕、病毒、真菌及其孢子和绝大多数细菌芽孢。用含氯、二氧化氯、过氧乙酸、过氧化氢、含溴消毒剂、臭氧、二溴海因等甲基乙内酰脲类化合物和一些复配的消毒剂等消毒因子进行消毒的方法。〔3〕中水平消毒法：杀灭和去除细菌芽孢以外的各种病原微生物的消毒方法，碘类消毒剂(碘伏、碘酊等)、醇类、醇类和氯已定的复方，醇类和季铵盐类化合物的复方、酚类等消毒剂进行消毒的方法。〔4〕低水平消毒法：只能杀灭细菌繁殖体〔分枝杆菌除外〕和亲脂病毒的化学消毒剂。如单链季铵盐类消毒剂(苯扎溴铵等)、双胍类消毒剂如氯己定、植物类消毒剂和汞、银、铜等金属离子消毒剂。消毒剂种类推荐使用浓度用途注意事项苯酚（石炭酸）3%～5%工作台面、器皿消毒中等毒来苏儿1%～3%（皮肤、器械）；3%～5%（器皿、污染物、工作台面）皮肤、器械、器皿、污染物、工作台面中等毒新洁而灭0.25%皮肤、小型器皿对病毒、芽孢无效乙醇70%～75%皮肤、金属器具、生物安全柜内表面易挥发自燃碘伏0.3%～0.5%皮肤低温不发挥效能氯消毒剂（二氧化氯、次氯酸钠、次氯酸钙等）0.1%～0.5%工作台面、环境、器皿、污染物等广泛使用腐蚀金属、高浓度对人有刺激性，污染环境漂白粉0.5%～1%（5min杀菌）；5%（1h杀芽孢）空气、表面、地面消毒、污染物处理腐蚀金属、高浓度对人有刺激性，污染环境过氧化氢3%细菌污染器皿，口腔黏膜不稳定、易氧化金属，现用现配，刺激性大，需戴手套、防护镜过氧乙酸0.2%～0.4%（3min）；0.50%皮肤；一般物品不稳定、严禁与金属接触，现用现配，刺激性大，需戴手套、防护镜过氧乙酸2%（8ml/m3）1h空气空气湿度越大越好，灭菌后通风甲醛加热熏蒸至少8小时空气空气相对湿度70%以上臭氧2.5mg/L～5mg/L(2h)空气空气湿度越大越好，灭菌后通风戊二醇0.2mg/L～1mg/L(10-15min)怕高温、怕腐蚀的医疗器械盛装容器必须加盖洁净实验室消毒剂的配制：1、按供给商的使用说明配制和储存。2、A/B级区域应使用经除菌过滤的消毒剂。3、尽量高级别的水配制，纯化水、灭菌水、注射用水,配好后放置一会。影响消毒剂效力的因素：浓度、接触时间、pH值、温度、微生物的数量和种类洁净实验室消毒剂的选择原理1、根据市售消毒剂的抗菌谱、根据区域等级，A/B级选用杀孢子剂，其他区域可配合使用其他水平的消毒剂，定期使用杀孢子剂。2、根据使用说明，标准使用浓度和作用时间3、根据待消毒外表的材质。如对设备外表的腐蚀程度对操作者的平安性。〔残留、腐蚀、粘膜刺激〕4、和清洁剂，其他消毒剂的相容性5、选用多种类的消毒剂，交替使用，防止微生物对其产生耐受性。洁净实验室几种空间灭菌方法：熏蒸灭菌概念1980年收录于USP，在一定温度和压力的密闭条件下，化学消毒剂转为气态渗透到生物体内，使生物致死。有助于降低洁净区死角的微生物污染。

甲醛：对所有微生物都有杀灭作用。杀孢子剂通常推荐12小时灭菌时间，排气、通风至少24小时，过程漫长，有致癌作用，现在已很少使用

臭氧：对所有微生物都有杀灭作用。杀孢子剂无残留，无污染，臭氧对人体有害，为强氧化剂，对多种物品有损坏，橡胶老化、铜片生锈，织物褪色等。过氧化氢：对所有微生物都有杀灭作用。杀孢子剂2H2O2→2H2O+O2过氧化氢灭菌平安，环境友好，不产生有毒有害残留物最终分解产物为H2O和O2，无毒无残留。洁净实验室紫外消毒的应用紫外线：空气消毒、物体外表消毒用UV进行外表消毒时，要求灯管距离污染外表不超过1m，30WUV灯照射时，照射时间不应短于30分钟，灯管周围1.5-2.0m为消毒有效区。应对灯的紫外线照射强度进行监测，当强度低于规定值时，及时更换。方法：生物指示剂/物理学检测生物指示：大肠杆菌，照射剂量应到达20000μw·s/cm2,枯草杆菌黑色变种芽孢应到达100000μw·s/cm2。物理学检测方法：灯管的紫外线强度〔μw/cm2〕用中心波长为253.7nm的紫外线强度测定仪〔标定有效期内〕，在灯管垂直位置1m处测定。洁净实验室判定指标〔1〕电压220V，室温20～25℃，253.7nm紫外线辐射强度〔垂直1m处〕普通30W直管型紫外线灯≥70μw/cm2；高强度紫外线灯≥200μw/cm2。〔2〕外表消毒接受的照射剂量，应达杀灭目标微生物所需。应到达100000μw.s/cm2。剂量〔μw.s/cm2〕=辐射强度〔μw/cm2〕×时间〔s〕。

菌种的管理

?9203药品微生物实验室质量管理指导原那么?药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株。CMCC-----中国医学菌种保藏中心CMCC〔F〕\CMCC〔B〕,F--------真菌；B--------细菌ATCC-美国标准菌种收藏中心

菌种的管理

定义标准菌株至少定义到属或种水平的菌株。按其特征进行分类和描述，有明确的来源。标准储藏菌株从国内或国外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储藏菌株。应进行纯度和特性确认。可用于制备每月或每周1次转种的工作菌株。工作菌株由标准菌株、标准储藏菌株转接后获得的同种菌株。工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代。菌种的管理

申购验收确认保藏传代使用销毁

菌种的管理

申购：菌种管理人员提出购置申请验收：接受菌种时应检查菌种的名称，代号，数量，完整性，记录信息。菌种复活：冷冻菌种的复活，无菌操作翻开玻璃管，用相应的液体培养基0.5-1ml溶解冷冻菌种，转移至适宜的培养基中复活。确认：用无菌接种环取复活的培养物，在相应的培养基平板上划线别离培养，观察典型的菌落形态，菌落形态的一致性，挑取单个菌落形态进行革兰氏染色、镜检，观察染色特性及微生物形态学特征，生化反响或用菌种鉴定系统进行进一步鉴定。

菌种的管理

保藏-----确保在相应的保藏条件下的菌种不会变异且性能稳定，经济简便。甘油冷冻保藏：液体培养物参加等体积的20%甘油，混匀，分装于1ml的小管，-80℃---30℃保存；或菌苔刮取后分散于无菌水中，参加等体积20%甘油的TSB中。再分装。瓷珠保藏法将培养好的微生物细胞或孢子制成悬浮液，转入装有无菌多孔玻璃珠〔或瓷珠〕的无菌瓶中，使其吸附于玻璃珠外表，去除多余悬浮液，低温冷冻保存的一种菌种保藏方法。SN/T2660-2021食品微生物实验室菌种保藏方法：-70℃可保存10年斜面低温保藏：把待保藏菌接种在适宜的斜面培养基外表，充分生长后，在4℃左右冰箱保存。铜绿不能用此法保存。菌种的管理

菌种的管理

传代：工作菌株的传代次数不得超过5代〔标准菌株为第0代〕。1代是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何形式的转种均被认为是传代1次。传代时，应对工作菌株的特性和纯度进行确认。

使用：使用工作菌种制备菌液，做好记录。菌液制备后假设在室温下放置，应在2小时内使用；假设保存在2-8度，可在24小时内使用。销毁：传代、使用过程产生的所有活的微生物均应进行高压灭菌处理。

菌种的管理

菌种的标识每一支菌种都应以适当的标签、标识来表示其名称、菌号、接种日期、代数等信息。

例如1：大CMCC(B)44102标140606/0/3，其中“大〞表示大肠埃希菌，“标〞代表标准菌株，“140606〞指标准菌株的购置日期即2021年6月6日，“0〞代表是零代，“3〞代表是一共购置3支。例如2：大CMCC(B)44102储〔瓷〕140606/2/10，其中“大〞表示大肠埃希菌，“储〞代表标准储藏菌株，“瓷〞表示用瓷珠保藏法来保藏此菌种，“140606〞指标准储藏菌株的传代日期即2021年6月6日，“10〞代表是一共制备了10支。生物平安实验室生物平安实验室简介二级生物平安实验室的建设要求生物平安柜的分类与特点二级生物平安柜的使用生物平安实验室?人间传染的病原微生物名录?根据微生物的危害程度将其分为4类，药品微生物检测所涉及到的菌都为第三类，应该在二级生物平安实验室操作。具有一定的生物平安防护水平的实验室统称为生物平安实验室。通过标准化的建筑、生物平安设备配置、个人防护、翔实的SOP和严格的管理来实现。生物平安实验室气溶胶aerosol悬浮于气体介质中粒径一般为0.001-100μm的固态或液态微小粒子形成的稳定的分散体系。吸入〔病原微生物污染的空气〕〔气溶胶－0.001-100μm的固态、液态微小粒子悬浮在气体介质中形成的相对稳定的分散体系〕感染性病原微生物气溶胶的吸入是造成实验室相关感染的主要因素。生物平安实验室二级生物平安实验室建设要求〔1〕必须为实验室平安运行、清洁和维护提供足够的空间。在实验室的工作区外还应当提供另外的可长期使用的储存间。应当为平安操作及储存溶剂、放射性物质、压缩气体和液化气提供足够的空间和设施.在实验室的工作区外应当有存放外衣和私人物品的设施。在实验室的工作区外应当有进食、饮水和休息的场所〔2〕实验室墙壁、天花板和地板应当光滑、易清洁、不渗漏、耐化学品和消毒剂的腐蚀。地板应当防滑。实验台面应是防水的，并可耐消毒剂、酸、碱、有机溶剂和中等热度的作用。实验室器具应当巩固耐用，在实验台、生物平安柜和其他设备之间及其下面要保证有足够的空间以便进行清洁。实验室的门应有可视窗，并到达适当的防火等级，最好能自动关闭(3)

应保证实验室内所有活动的照明，防止不必要的反光和闪光。要有可靠和充足的电力供给和应急照明，以保证人员平安离开实验室。生物平安实验室(4)

必须为实验室提供可靠和高质量的水。要保证实验室水源和饮用水源的供给管道之间没有交叉连接。应当安装防止逆流装置来保护公共饮水系统。每个实验室都应有洗手池，并最好安装在出口处，尽可能用自来水.(5)

平安系统应当包括消防、应急供电、应急淋浴以及洗眼设施。应当配备具有适当装备并易于进入的急救区或急救室。(6)

BSL-2实验室，应在靠近实验室的位置配备高压灭菌器或其他去除污染的工具。(7)在设计新的设施时，应当考虑设置机械通风系统，以使空气向内单向流动。如果没有机械通风系统，实验室窗户应当能够翻开，同时应安装防虫纱窗。(8)

必须考虑平安保卫措施。必须使用巩固的门、平安窗户以及门禁系统。适当时还应使用其他措施来加强平安保障。

生物平安实验室生物平安实验室防护要求在实验室工作时，必须穿着适宜的工作服或防护服。在进行可能接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性的材料或感染性动物的操作时，应戴上适宜的手套。手套用完后，应先消毒再摘除，随后必须洗手。在处理完感染性实验材料和动物后，以及在离开实验室工作区域前，都必须洗手。为了防止眼睛或面部受到喷溅物的污染、碰撞或人工紫外线辐射的伤害，必须戴适宜的平安眼镜、面罩〔面具〕或其他防护设备。严禁穿着实验室防护服离开实验室工作区域。不得在实验室内穿露脚趾的鞋。禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化装和处理隐形眼镜。禁止在实验室工作区域储存食品和饮料。在实验室内用过的防护服不得和日常服装放在同一柜子内。生物平安实验室生物平安柜〔BiosafetyCabinetBSC)负压过滤排风柜－在生物因子操作过程中用来保护操作人员、环境和〔或〕实验材料，防止感染性材料在实验中产生的气溶胶向操作者和环境扩散。生物平安实验室的重要设备，是病原微生物操作的一级防护屏障，关系生命平安和环境平安，有严格质量要求。平安柜分级：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个级别。生物平安实验室生物平安柜种类BSC有三个级别，一共有六种。生物安全柜正面气流速度（m/s）气流重新循环部分（%）气流排出部分（%）排风系统Ⅰ级0.360100硬管Ⅱ级A10.38-0.517030排到房间或套管连接处Ⅱ级A20.517030排到房间或套管连接处Ⅱ级B10.513070硬管Ⅱ级B20.510100硬管Ⅲ级不适用0100硬管生物平安实验室Ⅰ级生物平安柜操作者可通过前窗操作口在平安柜内进行操作。前窗操作口向内吸入的负压气流保护人员的平安。污染气流经高效过滤器过滤后排出，保护环境不受污染。不保护操作对象。A-前窗操作口B-观察窗

C-排气过滤器D-负压排气通路

Ⅰ级平安柜结构和气流模式示意图生物平安实验室Ⅱ级生物平安柜根据结构特点和气流模式的不同分为A1、A2、B1、B2四种类型操作者通过前窗操作口在平安柜内进行操作。操作口流入气流：保护人员经高效过滤器过滤的下降气流：保护产品被污染气流经高效过滤器过滤后排出：保护环境生物平安实验室ⅡA1型生物平安柜前窗操作口流入气流的最低速率为0.38m/s；下降气流为局部流入气流和局部循环气流的混合气流，经高效过滤器过滤后送至工作区；污染气流经过高效过滤器过滤后可以排到实验室中或经平安柜的外接排风管道排到大气中；平安柜内的污染部位可以处于正压状态；A1型平安柜不能用于挥发性有毒化学品和挥发性放射性核素的实验。生物平安实验室IIA1型生物平安柜70%气体循环利用30%气体外排.环境空气污染的空气HEPA过滤的空气負压的污染空气生物平安实验室操作口流入气流的最低速率为0.50m/s；下降气流为局部流入气流和局部循环气流的混合气流，经高效过滤器过滤后送至工作区；污染气流经过高效过滤器过滤后可以排到实验室或经平安柜的外接排风管道排到大气中；平安柜内所有污染部位均处于负压状态或者被负压通道和负压通风系统环绕；平安柜用于进行以微量挥发性有毒化学品和痕量放射性核素为辅助剂的微生物实验时，必须连接功能适宜的排气罩。生物平安实验室IIA2型生物平安柜70%气体循环使用.30%气体排出，既可以接管道外排，也可以不接管道直接排放在实验室环境空气污染的空气HEPA过滤的空气污染空气

生物平安实验室Ⅱ级B1型生物平安柜操作口流入气流的最低速率为0.50m/s；下降气流大局部由未污染的流入气流循环提供，经过高效过滤器过滤后送至工作区；大局部被污染的下降气流经过高效过滤器过滤后通过专用的排气管道排入大气中；平安柜内所有被污染部位均处于负压状态或者被负压通道和负压通风系统包围；如果挥发性有毒化学品或放射性核素随空气循环不影响实验操作或实验在平安柜的直接排气区域进行，B1型平安柜可以用于以微量挥发性有毒化学品和痕量放射性核素为辅助剂的微生物实验生物平安实验室Ⅱ级B2型生物平安柜前窗操作口流入气流的最低速率为0.50m/s；下降气流来自经过高效过滤器过滤的实验室或室外空气(即流经样本后的气体不再循环使用)；流入气流和下降气流经过高效过滤器过滤后通过专用排气管道排到大气中，不允许回到平安柜和实验室中；所有污染部位均处于负压状态，污染气体过滤后被全部外排〔不在工作区循环〕；B2型平安柜可以用于以挥