2023届高考生物考前冲刺过关回归教材重难点06微生物的选择培养与计数

回归教材重难点06微生物的选择、培养与计数【★01教材方位直击】本题主要考查微生物的筛选与培养及相关实验探究，要求考生识记培养基的成分、种类及作用；掌握分离微生物常用的两种方法及操作过程；掌握探究实验的原则，能结合图中信息知识答题，同时本章节会经常以流程图，来考查微生物的分离和培养，土壤中尿素分解菌的分离与计数与纤维素分解菌等微生物分离的原理及方法，是常考的内容，同时也会伴随着灭菌方法的考察，学生要准确记忆培养基的种类及作用，同时对于微生物计数的计数，学生要能掌握直接计数法和间接计数法的计数原理，准确掌握并运用公式进行计算。【★02重难点背诵归纳】易错点01．培养基（1）概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养物质。（3）营养成分：水、无机盐、碳源、氮源，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及氧气的要求。2．无菌技术（1）目的：获得纯净培养物。（2）关键：防止外来杂菌的入侵。（3）不同对象的无菌操作方法[连线]：营养物质定义作用主要来源碳源凡能提供所需碳元素的物质构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质无机化合物：CO2、NaHCO3等；有机化合物：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等氮源凡能提供所需氮元素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子生长必不可少的微量有机物酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等水在生物体内含量很高不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定外界摄入无机盐为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂无机化合物易错点02：微生物的纯化1.方法：（1）平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。（2）稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。稀释操作时：每支试管及其中9mL水、移液管均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2cm处。（3）涂布平板时：稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“无菌”，应特别注意：①酒精灯与培养皿的距离要合适。②吸管头不要接触任何其他物体。③吸管要在酒精灯火焰周围使用。2.注意事项：（1）倒平板操作：①培养基灭菌后，需冷却至50℃左右时才能倒平板，原因是琼脂在44℃以下凝固。②培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开。③整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。④平板冷凝后要倒置的原因：防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基，造成污染。⑤若倒平板时，培养基溅在皿盖和皿底之间的部位，这个平板应丢弃。（2）平板划线操作：①第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环。②灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。③划线时最后一区域不要与第一区域相连。④划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。3．平板划线法和稀释涂布平板法的比较项目优点缺点适用范围平板划线分离法可以观察菌落特征，对混合菌进行分离不能计数适用于好氧菌稀释涂布平板法可以计数，可以观察菌落特征吸收量较少、较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延适用于厌氧菌和兼性厌氧菌4.两种菌种保存方法的比较项目临时保藏法甘油管藏法适用对象频繁使用的菌种长期保存的菌种培养基类型固体斜面培养基液体培养基温度4℃－20℃方法菌落长成后于冰箱中保存，每3～6个月将菌种从旧的培养基转移到新鲜培养基上将培养的菌液与等体积灭菌后的甘油混合均匀后于冷冻箱内保存缺点菌种易被污染或产生变异易错点03：微生物的选择分离与计数1.选择培养基是指通过培养混合的微生物，仅得到或筛选出所需要的微生物，其他不需要的种类在这种培养基上是不能生存的。2.分解纤维素的微生物的分离的实验原理：（1）土壤中存在着大量纤维素分解酶，包括真菌、细菌和放线菌等，它们可以产生纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。故在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。（2）在培养基中加入刚果红，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌。3.统计菌落数目的方法：（1）显微镜直接计数法：①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量；②方法：用计数板计数；③缺点：不能区分死菌与活菌。（2）间接计数法（活菌计数法）：①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作：a.设置重复组，增强实验的说服力与准确性。b.为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。③计算公式：每克样品中的菌株数=（c÷V）×M，其中c代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。【★03真题好题演练】真题演练：1.（2021·河北省）葡萄酒生产过程中会产生大量的酿酒残渣（皮渣）。目前这些皮渣主要用作饲料或肥料，同时研究者也采取多种措施拓展其利用价值。回答下列问题：（1）皮渣中含有较多的天然食用色素花色苷，可用萃取法提取。萃取前将原料干燥、粉碎的目的分别是__________，萃取效率主要取决于萃取剂的__________。萃取过程需要在适宜温度下进行，温度过高会导致花色苷__________。研究发现，萃取时辅以纤维素酶、果胶酶处理可提高花色苷的提取率，原因是____________________。（2）为了解皮渣中微生物的数量，取10g皮渣加入90mL无菌水，混匀、静置后取上清液，用稀释涂布平板法将0.1mL稀释液接种于培养基上。104倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为78、91和95，则每克皮渣中微生物数量为__________个。（3）皮渣堆积会积累醋酸菌，可从中筛选优良菌株。制备醋酸菌初筛平板时，需要将培养基的pH调至__________性，灭菌后须在未凝固的培养基中加入无菌碳酸钙粉末、充分混匀后倒平板，加入碳酸钙的目的是______________________________。培养筛选得到的醋酸菌时，在缺少糖源的液体培养基中可加入乙醇作为__________。（4）皮渣堆积过程中也会积累某些兼性厌氧型乳酸菌。初筛醋酸菌时，乳酸菌有可能混入其中，且两者菌落形态相似。请设计一个简单实验，区分筛选平板上的醋酸菌和乳酸菌_________。（简要写出实验步骤和预期结果）【答案】（1）利于萃取剂溶解花色苷、使原料与萃取剂充分接触（2）性质和使用量（3）分解（4）纤维素酶、果胶酶可破坏细胞壁，有利于提高花色苷的提取率（5）8.8×106（6）中性或偏碱（7）使培养基不透明，从而使醋酸菌菌落周围出现透明圈（8）碳源（9）实验步骤：将平板置于无氧环境下继续培养，观察菌落形态和透明圈大小

预期结果：若菌落继续生长，且透明圈增大，则为兼性厌氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能继续生长，透明圈不再扩大，则为醋酸菌菌落【解析】（1）天然食用色素花色苷可用萃取法提取，萃取剂与水应不混溶，萃取前将原料干燥，有利于萃取剂溶解花色苷，提高溶解率；粉碎的目的是使原料与萃取剂充分接触；萃取效率主要取决于萃取剂的性质和使用量。萃取过程需要在适宜温度下进行，温度过高会导致花色苷分解。萃取时辅以纤维素酶、果胶酶处理，可破坏细胞壁，有利于提高花色苷的提取率。（2）为了解皮渣中微生物的数量，取10g皮渣加入90mL无菌水，混匀、静置后取上清液，用稀释涂布平板法将0.1mL稀释液接种于培养基上。104倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为78、91和95，则三个平板中平均菌落数为（78+91+95）÷3=88，每克皮渣中微生物数量为88÷0.1×104=8.8×106个。（3）醋酸菌属于细菌，制备醋酸菌初筛平板时，需要将培养基的pH调至中性或弱碱性，灭菌后在未凝固的培养基中加入无菌碳酸钙粉末、充分混匀后倒平板，加入碳酸钙可使培养基不透明，醋酸菌产生的醋酸可分解碳酸钙，产生透明圈，根据这一特点可筛选出醋酸菌，在缺少糖源的液体培养基中醋酸菌以乙醇为碳源，先把乙醇氧化为乙醛，再把乙醛氧化为乙酸。（4）醋酸菌为好氧菌，与兼性厌氧型的乳酸菌菌落形态相似，且二者产生的代谢产物均可使碳酸钙分解，区分筛选平板上的醋酸菌和乳酸菌，可将平板置于无氧环境下继续培养，观察菌落形态和透明圈大小。若菌落继续生长，且透明圈增大，则为兼性厌氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能继续生长，透明圈不再扩大，则为醋酸菌菌落。2.（2021·湖南省）大熊猫是我国特有的珍稀野生动物，每只成年大熊猫每日进食竹子量可达12~38kg。大熊猫可利用竹子中8%的纤维素和27%的半纤维素。研究人员从大熊猫粪便和土壤中筛选纤维素分解菌。回答下列问题：（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即_________。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以_________为唯一碳源的固体培养基上进行培养，该培养基从功能上分类属于_________培养基。（2）配制的培养基必须进行灭菌处理，目的是_________。检测固体培养基灭菌效果的常用方法是_________。（3）简要写出测定大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数的实验思路_________。（4）为高效降解农业秸秆废弃物，研究人员利用从土壤中筛选获得的3株纤维素分解菌，在37℃条件下进行玉米秸秆降解实验，结果如表所示。在该条件下纤维素酶活力最高的是菌株_________，理由是_________。菌株秸秆总重（g）秸秆残重（g）秸秆失重（%）纤维素降解率（%）A2.001.5124.5016.14B2.001.53235014.92C2.001.4229.0023.32【答案】（1）C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶（2）纤维素（3）选择（4）为了杀死培养基中的所有微生物（微生物和芽孢、孢子）（5）不接种培养（或空白培养）（6）将大熊猫新鲜粪便样液稀释适当倍数后，取0.1mL涂布到若干个平板（每个稀释度至少涂布三个平板），对菌落数在30～300的平板进行计数，则可根据公式推测大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数（7）C（8）接种C菌株后秸秆失重最多，纤维素降解率最大

【解析】（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以纤维素为唯一碳源的固体培养基上进行培养；培养基从功能上分类可分为选择培养基和鉴别培养基，故该培养基从功能上分类属于选择培养基。（2）配制培养基的常用高压蒸汽灭菌，即将培养基置于压力100kPa、温度121℃条件下维持15～30分钟，目的是杀死培养基中的所有微生物（微生物和芽孢、孢子）。为检测灭菌效果可对培养基进行空白培养，即将未接种的培养基在适宜条件下培养一段时间，若在适宜条件下培养无菌落出现，说明培养基灭菌彻底，否则说明培养基灭菌不彻底。（3）为测定大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数，常采用稀释涂布平板法，在适宜的条件下对大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌进行纯化并计数时，对照组应该涂布等量的无菌水。将大熊猫新鲜粪便样液稀释适当倍数后，取0.1mL涂布到若干个平板（每个稀释度至少涂布三个平板），对菌落数在30～300的平板进行计数，则可根据公式推测大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数。（4）测定酶活力时可以用单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量来表示。由表格可知，在适宜的条件下，C菌株在相同的温度和时间下，秸秆失重最多，纤维素降解率最大，说明该菌株的纤维素分解菌产生的纤维素酶活力最大。3.（2021·浙江省）回答下列（一）小题：（一）某环保公司从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物细菌菌株，制备了固定化菌株。（1）从淤泥中分离细菌时常用划线分离法或________法，两种方法均能在固体培养基上形成________。对分离的菌株进行诱变、________和鉴定，从而获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株。该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖。（2）固定化菌株的制备流程如下；①将菌株与该公司研制的特定介质结合；②用蒸馏水去除________；③检验固定化菌株的________。菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，可以采用的2种方法是________。（3）对外，只提供固定化菌株有利于保护该公司的知识产权，推测其原因是________。【答案】（1）涂布分离（2）单菌落（3）筛选（4）未固定的细菌（5）降解富营养化污水污染物的能力（6）包埋法和吸附法（7）特定介质能为菌株繁殖提供X【解析】1.分离纯化细菌最常用的方法是划线分离法（平板划线法）和涂布分离法（稀释涂布平板法）。接种的目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，并在培养基表面形成单个细菌繁殖而成的子细胞群体——菌落。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。2.固定化酶（insolubleenzyme）就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。3.植物组织培养的原理是植物细胞具有全能性，其具体过程：外植体→愈伤组织→胚状体→新植体，其中脱分化过程要避光，而再分化过程需光。4.在植物组织培养时，通过调节生长素和细胞分裂素的比值能影响愈伤组织分化出根或芽。（一）分析题意可知，本实验目的是从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备固定化菌株。（1）分离纯化细菌最常用的方法是划线分离法或涂布分离法，两种方法均能在固体培养基上形成单菌落。为了获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株，还需对分离的菌株进行诱变处理，再经筛选和鉴定。（2）固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。由于菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，故可以采用的2种方法是包埋法和吸附法。（3）由于该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖，可推测特定介质能为菌株繁殖提供X，故该公司对外只提供固定化菌株，有利于保护该公司的知识产权。4.（2021·全国甲卷）加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉。某同学通过实验比较了几种洗衣粉的去渍效果（“+”越多表示去渍效果越好），实验结果见下表。加酶洗衣粉A加酶洗衣粉B加酶洗衣粉C无酶洗衣粉（对照）血渍++++++++油渍++++++++根据实验结果回答下列问题：（1）加酶洗衣粉A中添加的酶是__________；加酶洗衣粉B中添加的酶是__________；加酶洗衣粉C中添加的酶是__________。（2）表中不宜用于洗涤蚕丝织物的洗衣粉有__________，原因是___________。（3）相对于无酶洗衣粉，加酶洗衣粉去渍效果好原因是___________。（4）关于酶的应用，除上面提到的加酶洗衣粉外，固定化酶也在生产实践中得到应用，如固定化葡萄糖异构酶已经用于高果糖浆生产。固定化酶技术是指___________。固定化酶在生产实践中应用的优点是_________（答出1点即可）。【答案】（1）蛋白酶（2）脂肪酶（3）蛋白酶和脂肪酶（4）加酶洗衣粉A和加酶洗衣粉C（5）蚕丝织物的主要成分是蛋白质，会被蛋白酶催化水解（6）酶可以将大分子有机物分解为小分子有机物，小分子有机物易溶于水，从而将污渍与洗涤物分开（7）利用物理或化学方法将酶固定在一定空间内的技术（8）固定在载体上的酶可以被反复利用，可降低生产成本（或产物容易分离，可提高产品的产量和质量，或固定化酶稳定性好，可持续发挥作用）【解析】加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉，目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶。其中，应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽，使污迹容易从衣物上脱落。（1）从表格中信息可知，加酶洗衣粉A对血渍的洗涤效果比对照组的无酶洗衣粉效果好，而血渍含有大分子蛋白质，因此，加酶洗衣粉A中添加的酶是蛋白酶，同理，加酶洗衣粉B中添加的酶是脂肪酶；加酶洗衣粉C对血渍和油渍的洗涤效果比无酶洗衣粉好，油渍中有脂肪，因此，加酶洗衣粉C中添加的酶是蛋白酶和脂肪酶。（2）蚕丝织物中有蛋白质，因此，表中不宜用于洗涤蚕丝织物的洗衣粉有加酶洗衣粉A、加酶洗衣粉C，原因是蚕丝织物主要成分是蛋白质，会被蛋白酶催化水解。（3）据分析可知，相对于无酶洗衣粉，加酶洗衣粉去渍效果好的原因是：酶可以将大分子有机物分解为小分子有机物，小分子有机物易溶于水，从而将污渍与洗涤物分开。（4）固定化酶技术是指利用物理或化学方法将酶固定在一定空间内的技术，酶既能与反应物接触，又能与产物分离，所以固定在载体上的酶还可以被反复利用。所以固定化酶在生产实践中应用的优点是：降低生产成本（或产物容易分离，可提高产品的产量和质量，或固定化酶稳定性好，可持续发挥作用）。好题演练：1．（2022·陕西渭南·）进行垃圾分类收集可以减少垃圾处理时间，降低处理成本。科研小组欲分离及培养若干种微生物用于处理湿垃圾，如剩菜剩饭、骨头、菜根菜叶、果皮等食品类废物。请分析回答：（1）科研小组从土壤中筛选产脂肪酶的菌株时，配制的培养基需要以__________为唯一碳源。制备固体培养基的步骤是；计算→称量→溶化→__________→__________。接种微生物最常用的方法是__________。（2）获得产脂肪酶的菌株后，在处理含油垃圾的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。现获得可产脂肪酶的A、B两种菌株，并进行了培养研究，结果如图1所示。据图分析，应选择菌株__________进行后续相关研究，理由是______________________________。（3）科研小组从土壤中筛选淀粉分解菌时，加碘液染色后，选择培养基上出现了A、B和C三种菌落（如图2所示）。若要得到淀粉酶活力最高的菌株，应选择__________（填“A”“B”或“C”）菌落进一步纯化。经检测A菌落为硝化细菌，A菌落能在此培养基上生长且没有形成透明圈的原因是____________________。（4）在微生物分解处理垃圾的过程中，纤维素分解菌能够分泌纤维素酶，该酶可将纤维素分解为葡萄糖。纤维素酶由三种复合酶组成，其中__________酶可将纤维二糖分解为葡萄糖。【答案】（1）脂肪灭菌倒平板稀释涂布平板法和平板划线法（2）B该菌株增殖速度快，且脂肪剩余比例小，降解脂肪能力强（3）C硝化细菌为自养细菌，能够利用空气中的二氧化碳合成有机物，但硝化细菌不能产生淀粉酶，所以无透明圈（4）葡萄糖苷【分析】分析图1可知，菌株A的细胞密度增殖速率低于菌株B，脂肪剩余量菌株A高于菌株B。从图2中可知，ABC三种菌株中，BC菌落周围出现透明圈，而A菌落周围未出现透明圈。（1）科研小组从土壤中筛选出产脂肪酶的菌株时，需设置只利于产脂肪酶的菌株生长，而其他杂菌生长受抑制的培养基，因此配制的培养基需要以脂肪为唯一碳源。制备固体培养基的步骤是：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。微生物接种最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法，其次还有穿刺接种和斜面接种。（2）据图1分析可知，菌株B增殖速度快，且脂肪剩余比例小，降解脂肪能力强，故应选择菌株B进行后续相关研究。（3）科研小组从土壤中筛选淀粉分解菌时，加碘液染色后，选择培养基上出现了A、B和C三种菌落，淀粉遇碘液会变蓝，而淀粉酶能够分解淀粉，则不同产酶活力的菌株周围会形成不同直径的透明圈，淀粉酶活力越强的菌株周围的透明圈越大，因此若要得到淀粉酶活力最高的菌株，应选择C菌落进一步纯化，这是因为C菌株的透明圈直径与菌落直径比值最大。经检测A菌落为硝化细菌，A菌落能在此培养基上生长且没有形成透明圈的原因是硝化细菌为自养细菌，能够利用空气中的二氧化碳合成有机物，但硝化细菌不能产生淀粉酶，所以无透明圈。（4）纤维素酶由三种复合酶组成，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。2．（2021·河南·）培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。基本培养基能满足野生型菌株的最低营养要求，一些突变型菌株因合成能力出现缺陷，需要在补充培养基（基本培养基中添加所缺陷的营养物质）上才能正常生长，可以满足各种营养缺陷型的该微生物生长的培养基称为完全培养基。回答下列问题：（1）培养基一般都含有__________四类成分；制备固体培养基的步骤包括计算、称量、溶化、__________、倒平板；其中“计算”的依据是____________________。（2）借助完全培养基和基本培养基，采用影印法培养可以筛选出合成能力有缺陷的突变型菌株，过程如图所示。用__________（填工具）将菌液接种到完全培养基上；由基本培养基上得到的结果推测，菌落__________最可能是合成能力有缺陷的突变型菌株。（3）为鉴定某突变型菌株的具体缺陷类型，将其涂布接种于以下5组添加了不同类型氨基酸的基本培养基中，观察其生长状况。结果该菌株只能在A、C两组培养基中生长，则该菌株为__________（填氨基酸名称）营养缺陷型菌株。简述如何临时保存所鉴别出的菌株：______________________________。组别氨基酸组合A组氨酸苏氨酸谷氨酸天冬氨酸亮氨酸B精氨酸苏氨酸赖氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸C酪氨酸谷氨酸赖氨酸色氨酸丙氨酸D甘氨酸天冬氨酸甲硫氨酸色氨酸丝氨酸E半胱氨酸亮氨酸苯丙氨酸丙氨酸丝氨酸【答案】（1）碳源、氨源、水和无机盐灭菌培养基的配方比例和用量（2）涂布器2、7（3）谷氨酸将鉴别出的菌株接种到试管的固体斜面培养基上，待菌落长成后放在4℃的冰箱中保藏（以后每3～6月转移一次，将菌种转移到新鲜的培养基上）【分析】微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养．在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。（1）培养基一般都含有碳源、氨源、水和无机盐四类成分；制备固体培养基的步骤包括计算、称量、溶化、灭菌、倒平板；其中“计算”的依据是培养基的配方比例和用量。（2）筛选菌株用稀释涂布平板法，用涂布器将菌液接种到基本培养基上；营养缺陷型不能生长，故2、7最可能是合成能力有缺陷的突变型菌株。（3）该菌株只能在A、C两组培养基中生长，说明两组培养基都含有该菌需要的氨基酸，即谷氨酸。临时保存所鉴别出的菌株方法为：将鉴别出的菌株接种到试管的固体斜面培养基上，待菌落长成后放在4℃的冰箱中保藏（以后每3～6月转移一次，将菌种转移到新鲜的培养基上）。3．（2021·四川·树德中学）生物兴趣小组试图探究牛和山羊的瘤胃中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能降解尿素的细菌（目的菌）。培养基成分如表所示，实验步骤如图所示。请分析回答问题：KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖10g尿素1g琼脂15g溶解后自来水定容到1000mL（1）分解尿素的细菌能分泌____________酶，能将尿素分解成_______________。以尿素为唯一氮源的培养基因为________________________________具有选择作用。（2）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有___________（答出两点即可）。（3）实验是否需要振荡培养来提高溶氧量：______（“是”或“否”），原因是______________。转为固体培养时，常采用___________法接种，获得单菌落后继续筛选。（4）分离分解尿素的细菌实验时，甲同学从培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。甲同学实验结果差异的原因可能有__________（填序号）。①取样不同②培养基污染③操作失误④没有设置对照（5）要想增加该实验的说服力，还应该怎么做？_____________________。（6）为进一步确定取自瘤胃中液体的适当稀释倍数，将接种的培养皿放置在37℃恒温培养箱中培养24〜48h，观察并统计具有红色环带的菌落数，结果见表，其中___________倍的稀释比较合适。稀释倍数103104105106107菌落数>5003672483618【答案】脲NH3和CO2能利用尿素的细菌能在该培养基上生长，不能利用尿素的细菌不能生长为细菌生长提供无机盐，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定否瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡平板划线法或稀释涂布平板①②③一是设置对照实验，用该培养基不接种样品观察；再配制一组完全培养基，接种该样品培养观察。二是最后要对该微生物进行鉴定，用酚红指示剂鉴定该微生物的菌落，看指示剂是否变红106或105【分析】1.培养基选择分解尿素的微生物的原理：培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。2.培养基的基本成分包括水、无机盐、碳源和氮源，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。3.微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。4.选择培养基是在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。【详解】（1）土壤中的部分细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶；尿素在脲酶的催化下可以分解成NH3和CO2；以尿素为唯一氮源的培养基具有选择作用是因为只有能合成脲酶的细菌才能利用尿素，能在该培养基上生长，不能利用尿素的细菌不能生长。（2）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，可以为细菌生长提供钾、钠、磷等无机营养，同时，二者构成缓冲对，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定。（3）根据题意，目的菌为来自于牛和山羊的瘤胃中的微生物，因此，实验中不需要振荡培养来提高溶氧量，因为瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡。转为固体培养时，为了获得单菌落，常采用平板划线法或稀释涂布平板法进行接种，获得单菌落后再继续筛选。（4）根据生物实验应遵循对照原则、等量原则、单一变量原则和控制无关变量原则，A同学的实验结果比其他同学多，可能是培养基污染造成的，还可能是A同学实验操作过程中污染造成的，也可能是与其他同学所取土壤样品不同造成的：土样不同可能导致计数偏差，①正确；培养基污染会导致菌落数增加，②正确；操作失误可能增加微生物的数量和种类，菌落会增多，③正确；没有设置对照不会增加菌落数目，④错误。因此，A同学的实验结果产生的原因可能是①②③。（5）微生物培养过程中，为了实验结果具有说服力，常需设置对照实验，用该培养基不接种样品观察；再配制一组完全培养基，接种该样品培养观察；另外，为了对分离的菌种进行进一步鉴定，还要用酚红指示剂鉴定该微生物的菌落，看指示剂是否变红。（6）在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间、适于技术的平板。由表可知，106或105倍的稀释比较合适。4．（2021·四川遂宁·）幽门螺杆菌（Hp菌）因为其导致胃痛、胃癌，成为最臭名昭著的细菌之一。它是一种异养微厌氧菌，胃里面还有胃酸（pH为1.5左右），绝大部分的细菌都适应不了。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：请回答下列问题：（1）上述培养过程中，能够“浓缩”幽门螺杆菌的步骤是____。梯度稀释操作时如何防止杂菌污染____。（2）有的化工厂会产生尿素废水，研究者提出用幽门螺杆菌来处理废水，如果该方法可行，根据题干信息可知，该处理过程对温度和氧气的要求是____。（3）实践证明有一种尿素分解菌比幽门螺杆菌处理尿素废水的能力强很多，最可能的原因是前者比后者产生的____多，科学家用分配色谱法分离该物质主要是利用了该物质与其他物质的____不同。在凝胶色谱柱的装填过程中，装柱前需要根据色谱柱的内体积计算需要的凝胶量的原因是___。（4）为了证明不分餐能导致胃幽门螺杆菌交叉传播，研究者提取了某胃炎患者家庭的100g剩菜，加入无菌水稀释。取上述稀释液分别接种到3个适宜的培养基中置于适宜的条件下进行培养，三个平板上胃幽门螺杆菌菌落数均介于30～300之间且相差不大，求平均值得到菌落数为B个。根据上述情景不能计算出每克剩菜中的幽门螺杆菌的数量，原因是______。【答案】选择培养试管口和移液管应该在离火焰1-2cm处（或者火焰附近）37℃左右、低氧（或无氧）脲酶相对分子质量干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差别很大因为不知道稀释倍数和接种体积【分析】1.分解尿素细菌的分离原理：（1）能合成脲酶的细菌才能分解尿素。（2）配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。2.梯度稀释操作时，无菌操作很关键。【详解】（1）据图分析可知，“选择培养”为“浓缩”幽门螺杆菌的过程。梯度稀释操作时，无菌操作很关键，要注意试管口和移液管应该在离火焰1-2cm处（或者火焰附近）进行实验操作。（2）胃幽门螺杆菌是一种异养微厌氧菌，生活环境具有胃酸（pH为1.5左右），故用幽门螺杆菌来处理废水应该在37℃左右、低氧（或无氧）环境中进行。（3）能合成脲酶的细菌才能分解尿素，若一种尿素分解菌比幽门螺杆菌处理尿素废水的能力强很多，最可能的原因是前者比后者产生的脲酶多。科学家用分配色谱法分离该物质主要是利用了该物质与其他物质的相对分子质量不同。根据色谱柱的内体积计算需要的凝胶量的原因干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差别很大。（4）不知道稀释倍数和接种体积，无法计算出每克剩菜中的幽门螺杆菌的数量。5．（2022·江西吉安·）工业企业每年都会产生大量高浓度工业废水，工业废水进入水体，其中的酚类会被酚降解菌分解。从活性污泥中分离高效降解酚类的菌株并计数的过程如图所示。回答下列问题：（1）酚类降解菌的富集培养基含有蛋白胨、K，HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中蛋白胨可为微生物生长提供的营养物质有________；实验中对所用的培养皿、培养瓶等玻璃制品应采用____法进行灭菌；对配制好的培养基应采用_______法灭菌。（2）用______吸取1mL培养的菌液注入含______的试管中获得101稀释液，以此类推获得105的稀释液。（3）取稀释倍数为105的菌液0.1mL采用________法接种到三个平板上，获得的菌落数分别是105、125、115，则1mL菌液中含有酚类降解菌__________个。若菌落长满整个平板，难以计数，最可能的原因是____________________________。【答案】碳源、氮源、维生素干热灭菌高压蒸汽灭菌无菌移液管9mL无菌水（稀释）涂布平板1．15×108菌液稀释度不够【分析】1.微生物培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。对异养微生物来说，含C、N的化合物既是碳源，也是氮源，即有些化合物作为营养要素成分时并不是起单一方面的作用。2.微生物常见的接种的方法有：平板划线法和稀释涂布平板法。【详解】（1）蛋白胨营养丰富，可为微生物生长提供的营养物质有碳源、氮源、维生素等。实验中对所用的培养皿、培养瓶等玻璃制品应采用干热灭菌法进行灭菌；对配制好的培养基应采高压蒸汽灭菌法灭菌；（2）一般用无菌移液管吸取菌液和培养液，所以用无菌移液管吸取1mL培养的菌液注入含9mL无菌水的试管中获得101稀释液，以此类推获得105的稀释液；（3）若要进行微生物的计数，需要用（稀释）涂布平板法培养微生物，所以取稀释倍数为10的菌液0.1mL采用（稀释）涂布平板法接种到三个平板上，获得的菌落数分别是105、125、115，则1mL菌液中含有酚类降解菌=C/V×稀释倍数=（105+125+115）÷3÷0.1×105=1.15×108个。若菌液稀释度不够则菌落长满整个平板，难以计数，因此若菌落长满整个平板，难以计数，最可能的原因是菌液稀释度不够。6．（2021·广东·）测定水样是否符合饮用水卫生标准，常用滤膜法测定大肠杆菌的数目。流程如图所示，滤膜法的大致流程：用滤膜过滤待测水样→水样中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到伊红美蓝的培养基（EMB培养基）上培养→统计菌落数目。据图回答问题：（1）过滤待测水样用到的滤杯、滤膜和滤瓶首先需要进行___________________处理，保证实验不受其他微生物干扰。与过滤有关的操作都要在___________________旁进行。（2）将完成过滤之后的滤膜紧贴在EMB培养基上，这属于微生物培养中的_______________操作。从物理状态角度分析，EMB培养基属于_______________培养基，制备培养基时需要采用_______________法灭菌。（3）某生物兴趣小组的某同学尝试按照上述方法进行测定，无菌操作下将10mL待测水样加入到90mL无菌水中，稀释后的100mL菌液通过滤膜法测得EMB培养基上的菌落数平均为124，黑色菌落数平均为31，则推测1升待测水样中的大肠杆菌数目为___________________个。（4）该同学进一步思考，利用滤膜法也可能用于测定待测水样中其他微生物的数目。他取了两份水样，一份待测水样来自变酸的果酒，从中检测到两种微生物，它们在结构上的主要区别是___________________。另一份来自某公园的观赏湖，若要通过测量蓝藻的数目来研究水华，培养基配方中则必须添加___________________（水、无机盐、碳源、氮源）。【答案】（1）消毒灭菌酒精灯火焰（2）接种固体高压蒸汽灭菌（3）3100（4）有无核膜为界限的（成形的）细胞核水、无机盐、氮源【分析】滤膜法是检测水样中大肠细菌群的方法，将一定量水样注入已灭菌的微孔薄膜的滤器中，经过抽滤，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴于伊红美蓝培养基上，经培养后计数和鉴定滤膜上生长的大肠菌群菌落即可推测计算出水样中的大肠杆菌数；伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料，大肠杆菌在伊红-美蓝培养基的菌落呈深紫色，并有金属光泽。（1）过滤待测水样需要用到滤杯、滤膜和滤瓶，其中需要对滤杯、滤膜和滤瓶进行消毒灭菌处理，与过滤有关的操作都要在酒精灯火焰旁进行，防止杂菌的污染。（2）将完成过滤之后的滤膜紧贴在EMB培养基上，这属于微生物培养