西普兰对慢性应激大鼠血糖及免疫功能的影响

西普兰对慢性应激大鼠血糖及免疫功能的影响

慢性休克是身体受到多种刺激后产生的一系列广泛而复杂的副作用，包括神经系统、内政部系统和循环系统。国内外研究结果表明,慢性应激可影响神经系统、内分泌系统、免疫系统的功能,导致机体形态结构、功能状态的改变,而某些药物对其具有一定的保护作用。西酞普兰是选择性较强的5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI),对抑郁障碍有较好的治疗效果。然而西酞普兰对血糖及免疫系统的影响如何,目前尚缺乏这方面的研究。我们试图在建立慢性应激大鼠模型的同时,预防性使用西酞普兰,观察大鼠血糖、免疫指标的变化,以探讨慢性应激及西酞普兰对大鼠血糖、免疫系统的影响,为慢性应激引起的神经精神疾病的预防和治疗提供理论依据。材料和方法一、材料表面1.实验动物中心雄性SD大鼠32只,体重(240±20)g,浙江中医药大学实验动物中心提供,绍兴文理学院生命科学院实验基地动物室饲养。大鼠按分组分箱饲养,每组8只,进食饮水自由,适应1周后,进入实验程序。2.-4-氟苯基-1,3-二氢-5-异苯并呋喃腈氢溴酸盐的合成氢溴酸西酞普兰(喜普妙),化学名为1-[3-(二甲胺基)丙基]-1-(4-氟苯基)-1,3-二氢-5-异苯并呋喃腈氢溴酸盐,与乙酰胆碱、组胺、去甲肾上腺素、多巴胺、γ-氨基丁酸及阿片受体结合作用轻微。3.试剂免疫组化试剂盒,均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。二、方法1.应激组和普兰片灌胃的处理饲养环境光/暗周期为各12h,光照时间为7:00～19:00,室温(22±2)℃。对照组不做任何处理,应激组以等体积生理盐水灌胃,实验1、2组分别以4和8mg·kg-1·d-1氢溴酸西酞普兰片灌胃(蒸溜水溶解)。并将应激组、实验组大鼠每天置于80cm×40cm×40cm,水深25cm、水温(20±2)℃的玻璃缸中强迫游泳15min,共4周,形成慢性应激模型。2.血液测试实验第1天、第10天、第20天、第29天,各组大鼠尾静脉采血,用美国强生血糖仪测量血糖(mmol/L)。3.肾上腺素尾腺、脾指数实验第29天,动物断头放血处死后,取出肾上腺、胸腺、脾脏组织称重,计算肾上腺(胸腺、脾脏)指数=肾上腺(胸腺、脾脏)质量(mg)/体质量(g)。4.石蜡包埋片组光镜标本将胸腺置于4%中性多聚甲醛溶液中固定48h以上,常规石蜡包埋、连续切片,片厚4μm。电镜标本置于2.5%戊二醛溶液中固定备用。5.免疫组织化学染色和细胞坏死检测按试剂盒说明书操作。6.电镜观察固定标本→梯度脱水→包埋→切片→载网→染色(柠檬酸铅、醋酸铀)→电镜观察。阳性凋亡细胞判别标准:细胞核皱缩,体积变小,核膜变形呈不规则形、呈锯齿状或边界不清或核膜消失。三、均数标准差表示采用SPSS11.5统计软件,计量数据以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示;组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果一、实验组血糖测定与应激组比较,对照组血糖在实验第1天、第10天,无明显变化(P>0.05),第20天、第29天降低(P<0.05);实验组血糖在实验第1天、第10天、第20天,无明显变化(P>0.05),第29天降低(P<0.05);与对照组比较,实验组血糖除在实验第20天增高(P<0.05),其余时间均无统计学差异(P>0.05)(表1)。二、各组大鼠脏器指数比较与应激组比较,对照组、实验1组大鼠肾上腺指数下降,胸腺、脾脏指数上升(P<0.05);与对照组比较,实验1组大鼠肾上腺、胸腺、脾脏指数无统计学差异(P>0.05),实验2组大鼠胸腺、脾脏指数下降(P<0.01);与实验1组比较,实验2组胸腺、脾脏指数下降(P<0.05)(表2)。与应激组比较,aP<0.05bP<0.01与对照组比较,cP<0.01与实验1组比较,dP<0.05eP<0.01三、bx-q-ms评分对照组胸腺细胞排列紧密、核圆,皮、髓质均可见大片Bcl-2蛋白阳性表达细胞,特别是髓质,细胞膜/细胞质呈深黄色或黄色,髓质偶见Bax蛋白阳性表达细胞(见封三图1,2),并可见较多染色阳性细胞,细胞核浓缩,呈椭圆形、不规则形,颜色为棕色或黄色(见封三图3)。与对照组比较,应激组胸腺细胞Bcl-2蛋白表达阳性细胞减少,髓质可见大片Bax蛋白阳性表达细胞(见封三图4,5),髓质可见大量TUNEL染色阳性细胞(见封三图6)。实验1组可见大片Bcl-2蛋白表达阳性细胞,染色增强、呈棕色,Bax蛋白表达阳性细胞减少,染色减弱(见封三图7,8),TUNEL染色阳性细胞减少,染色减弱(见封三图9)。实验2组胸腺细胞Bcl-2蛋白表达阳性细胞减少、Bax蛋白表达阳性细胞明显增多(见封三图10,11),并可见大量TUNEL染色阳性细胞,核浓缩现象明显(见封三图12)。四、应激组细胞的形态对照组大鼠胸腺细胞的细胞结构正常(见封三图13);应激组可见较多细胞的细胞核皱缩,体积变小,核膜变形呈不规则形、呈锯齿状或边界不清或核膜消失(见封三图14);实验1组较应激组凋亡细胞减少。应激对大鼠尾腺细胞的保护作用强迫游泳实验作为制造抑郁应激模型的经典方法,在应激相关研究及抗抑郁药疗效评定中得到广泛应用,我们的前期研究也证实了强迫游泳制造慢性应激模型的有效性。本研究结果显示,应激组大鼠肾上腺指数值变大、血糖呈升高趋势,并在20天后显著高于对照组,表明慢性应激对内分泌系统的影响,其机制可能是通过激活大脑-下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的作用,导致糖皮质激素分泌增加,使血糖升高,这与Herman等研究结果一致。另外,本研究实验组大鼠血糖除第20天高于对照组外,其余均与对照组相近,提示西酞普兰的干预作用,要在用药一段时间后才能起效,其作用机制可能是通过抑制大脑-下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的作用,导致糖皮质激素分泌减少。胸腺、脾脏是主管机体免疫功能的重要器官。本研究结果显示,应激组大鼠胸腺、脾脏指数低于对照组,提示慢性应激可致大鼠胸腺、脾脏的萎缩,这与施桂兰、杨宁波等研究结果一致,其调控机制可能与下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴功能有关,认为5-羟色胺(5-HT)能抑制应激的促肾上腺皮质激素(ACTH)反应。本实验使用西酞普兰的实验1组大鼠胸腺、脾脏指数接近对照组,提示适当剂量(4mg·kg-1·d-1)的西酞普兰对大鼠胸腺、脾脏具有保护作用,这可能与西酞普兰对5-HT再摄取抑制作用相关。而实验2组大鼠胸腺、脾脏指数低于对照组、接近应激组,可能是药物剂量(8mg·kg-1·d-1)过大对胸腺、脾脏的损害,提示在使用西酞普兰时,注意药物剂量的控制。Yang等认为细胞对死亡信号的敏感性取决于胞内Bcl-2/Bax竞争性的二聚体化过程。Bax同二聚体形成便可诱导凋亡;随Bcl-2蛋白表达量的上升,越来越多的Bax二聚体分开,与Bcl-2形成比Bax-Bax更稳定的Bax-Bcl二聚体,拮抗Bax-Bax诱导凋亡的作用,则细胞不发生凋亡。本研究结果表明,应激组大鼠胸腺细胞中Bcl-2表达减少减弱,而有更多更强的Bax表达,同时TUNEL检测凋亡细胞增多,电镜观察凋亡细胞增多,提示慢性应激对大鼠胸腺细胞的损害;而实验1组大鼠在使用西酞普兰后,与对照组比较胸腺细胞中Bcl-2表达增多增强,Bax表达减少减弱,同时TUNEL检测凋亡细胞减少,电镜观察凋亡细胞减少,提示西酞普兰对胸腺细胞的保护作用,同时也证实