不同剂量亚砷酸钠对大鼠皮肤和脏器的毒性损伤

不同剂量亚砷酸钠对大鼠皮肤和脏器的毒性损伤

慢性砷中毒的毒性物质严重影响了人类的健康。目前，尤其是分子机制，尚不清楚权限。此外，砷体具有很强的蓄积性，临床上可视为逐渐渐进的非叛逆过程，没有敏感的原检测方法和特效药物，限制了早期诊断和预防。本研究采用亚慢性毒性实验方法观察不同剂量的砷剂对皮肤和其他脏器的毒性损伤作用,进一步阐明砷中毒的作用机制,为今后地方性砷中毒的防治提供科学资料。1材料和方法1.1材料、试剂与仪器Virian240FS原子吸收仪(美国瓦里安公司),过氧化氢(分析纯,天津市福晨化学试剂厂),砷元素国家标准溶液(国家钢铁材料测试中心),亚砷酸钠(分析纯,北京化学试剂三厂)。1.2实验方法1.2.1干预浓度的确定选用SPF级SD大鼠40只,雌雄各半,体重(100±20)g,由新疆医科大学实验动物中心提供,动物使用许可证编号:SYXK(新)2003-0001。经1周适应性饲养,按性别和体重随机分成4组(对照组,低剂量组,中剂量组,高剂量组),每组10只。采用霍恩氏法测得大鼠经口半数致死量(LD50)为46.4mg/kg。在查阅、分析大量文献基础上,确定本实验各组的干预浓度。高剂量组约为受试物的1/5LD50,每个剂量组相差2倍。按大鼠每日饮水20ml,平均体重为100g计算,采用蒸馏水配制成50、25、12.5mg/L的亚砷酸钠水溶液,按大鼠每公斤体重计算的剂量为10、5、2.5mg/kg。正常对照组饮用蒸馏水。1.2.2大鼠的尿量检测均喂饲常规饲料。大鼠正常饮食,室温18~22℃,湿度40%~60%。每天换水,并记录各组的每天饮水量,每周一空腹称重,根据大鼠每天的平均饮水量及每周的平均体重调整各组砷含量。连续染毒90d。1.2.3观察指标和测试方法1.2.3.组织剪碎、分离取样品称重,所有标本重量均在0.5g左右,放入洗净小瓶中;用刻度吸管量取预冷的生理盐水(组织重量的9倍)于小瓶中,置于冰上,用眼科剪刀尽快将组织剪碎;将剪碎组织使用玻璃匀浆器进行匀浆,左手持匀浆管将下端插入冰浴中,右手将捣杆垂直插入套筒中上下转动研磨数十次,充分研碎,以上操作均在0~4℃下进行。离心10~15min(组织匀浆:3000r/min;皮肤:4000r/min;r=5cm),提取上清液,弃去沉淀,待检。1.2.3.2.一般情况和体重变化每天观察动物的摄食、饮水、活动、精神状态等一般情况,每天换水并记录各组的每天饮水量,每周按时称量体重,观察动物体重变化情况。1.2.3.3.器官系数1.2.3.4、测定硫含量1.2.3.皮肤组织学检测大鼠处死后,将皮肤、心、肝、肾、脑以4%甲醛溶液固定,石蜡包埋、切片、苏木素-伊红(HE)染色后,光镜下观察皮肤表皮结构及心、肝、肾、脑脏器的组织学变化。1.3量资料结果采用SPSS16.0统计软件进行分析,计量资料结果以表示。多组样本均数比较,方差齐时应用单因素方差分析及两两比较的LSD检验;方差不齐时采用秩和检验。检验水准α=0.05。2结果2.1一般情况下和体重变化2.1.1一般情况下2.1.2各组大鼠染毒前5周平均体重的比较不同时间、不同剂量亚砷酸钠染毒大鼠后,体重经重复测量资料的方差分析,发现时间和剂量存在时间-剂量交互作用(F=4.511,P=0.000)。进一步比较发现,染毒的前5周,低、中剂量组大鼠平均体重均高于对照组,但差异无统计学意义;自第7周开始,低、中剂量组大鼠平均体重低于对照组,差异无统计学意义;高剂量组大鼠平均体重总体都低于对照组,尤其以第7周开始为甚,且差异具有统计学意义(P<0.05);与低剂量组比较,自第3周开始高剂量组大鼠平均体重均降低,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。此外,大鼠体重的性别差异无统计学意义。2.2对大鼠脑脏器系数的影响表2结果表明,随着染毒剂量的增高,染毒组大鼠肝脏、肾脏的脏器系数随之升高,中、高剂量组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);高剂量组大鼠脑脏器系数与对照组相比有所升高,差异有统计学意义(P<0.05),但低、中剂量组与对照组相比,差异无统计学意义;低、高剂量组大鼠心脏脏器系数与正常对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。与低剂量组相比,高剂量组大鼠的心脏、肝脏、肾脏及脑脏器系数升高(P<0.05)。2.3皮肤和脏器中砷含量的比较表3中给出了对照组和染毒组大鼠皮肤和各主要脏器组织中砷的分布,可以看出,砷在大鼠皮肤和各脏器组织中并非均匀分布。经单因素方差分析后发现各组大鼠皮肤和各脏器中砷含量不全相同,差异有统计学意义(皮肤、心、肝、脑、肾中F值分别为550.06、545.21、471.73、1680.00、273.45;P值均为0.000)。由表3可见,随着染毒剂量的增高,低、中、高剂量组大鼠皮肤和脏器中砷的含量依次升高,与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);与低剂量组比较,中、高剂量组大鼠皮肤和脏器中砷的含量依次升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.4病理观察的结果2.4.1表皮形态正常及去皮层厚度均匀性光镜观察的结果显示,对照组(封三图1A)大鼠皮肤组织结构基本正常,表皮层厚度均匀,表皮细胞排列整齐;低剂量组(封三图1B)可见表皮轻度角化;中剂量组和高剂量组(封三图1C、D)可见表皮重度角化,表皮层厚度不均匀,部分细胞细胞核固缩、溶解或消失。2.4.2低剂量剂量组光镜观察的结果显示,对照组(封三图2A)大鼠心肌细胞呈梭形,细胞间通过胞体相连;低剂量组(封三图2B)可见部分心肌纤维轻度水肿,胞浆疏松、淡染;中剂量组和高剂量组(封三图2C、D)可见部分心肌灶性变性,间质出血。2.4.4神经胶质细胞光镜观察的结果显示,对照组(封三图4A)大鼠的大脑皮质层内锥体细胞突起明显,细胞轮廓清晰,细胞核深染,尼氏体清楚可见,神经胶质细胞体积小,核圆而清晰。各剂量组大鼠大脑皮质层内均见有不同程度的神经细胞出现核固缩、核溶解、树突拉长等病理改变,中、高剂量组可见胞浆疏松(封三图4B、C、D)。2.4.5小鼠骨髓细胞培养光镜观察的结果显示,正常对照组(封三图5A)大鼠肾小球和肾小管结构正常,肾小管上皮细胞呈正方形,无明显病变,细胞核圆形,位于基底部,排列整齐;低剂量组(封三图5B)肾小球毛细血管轻度扩张、充血,肾小管上皮细胞部分轻度水肿;中剂量组和高剂量(封三图5C、D)可见肾小球毛细血管扩张、充血,肾小管上皮细胞明显水肿,脂肪变性,管腔狭窄。3讨论3.1砷对大鼠体重的影响砷广泛存在于土壤、水体、作物和大气中,微量的砷具有生血和促进组织、细胞生长等功能。20世纪70年代后,人们逐渐发现动物缺砷会出现异常,当摄砷恢复到正常水平时,异常症状又会消失。但过量的砷在体内蓄积可引起严重的砷中毒,引起机体的多系统的损害,且砷对组织造成的损伤程度与砷的浓度有剂量-效应关系,慢性砷中毒的发病率及严重程度与砷暴露时间及水砷含量等因素密切相关。在本实验研究中,通过大鼠自由饮用含不同浓度NaAsO2的饮水染毒90d后,观察了不同剂量的砷对大鼠体重变化的影响。实验结果表明,砷可使低、中剂量组大鼠体重增长加快,在第1周末就已表现出来,在前5周内,低、中剂量组大鼠平均体重均高于对照组,这可能与砷促进生长,刺激机体代谢旺盛,促进蛋白质合成有关,据有关资料表明,在饲料中添加0.01%~0.02%的砷化合物(主要是对氨基苯砷酸、3-硝基-4-羟基苯砷酸)时,可刺激家禽的生长;以0.005%~0.01%水平添加可刺激猪的生长,并提高饲料效率。但随着染砷时间的延长,可能由于蓄积作用砷影响到大鼠的生长发育。自本实验第7周开始,低、中剂量组大鼠平均体重开始低于对照组;而高剂量组大鼠平均体重总体都低于对照组,尤其以第7周开始为甚。染毒组大鼠在经过一段时间的体重增长后,在染毒7周后,低、中、高剂量组大鼠平均体重呈现出增长缓慢现象,而高剂量组大鼠甚至出现体重下降现象,提示砷对动物增长的影响呈双相性,即短期低剂量砷对动物机体有一定的正向效应,而高剂量下和长期低、中剂量砷对机体可出现抑制或毒性效应。动物体重是综合反映动物健康状况最基本的灵敏指标之一,可以很好地反映动物机体中毒的效应,以往的实验研究也证实高砷刺激会对机体造成一些毒性效应,其中一个表现就是体重降低,本实验中高剂量染毒7周时体重的变化也验证了这一点。3.2大鼠砷中毒的病理组织学检测砷在体内有强蓄积性,易与巯基结合而蓄积在角蛋白含量较多的组织(如皮肤、毛发、指甲)中,本次实验研究发现,皮肤和心、肝、脑、肾主要脏器中砷的蓄积量随着砷染毒剂量的升高而增高,说明砷在体内具有较强的蓄积性,从而对皮肤和脏器造成严重损伤。另外,皮肤和各脏器组织对砷的蓄积有一定的差异,以皮肤中砷含量相对较高,脑组织中砷含量相对于其他脏器来说较低,说明血脑屏障对砷有一定的阻挡作用,这与以前的结果一致。造成皮肤和各脏器组织中砷分布不同的原因可能与各脏器与砷的亲和力不同有关,另外也与脏器本身的代谢情况有关。脏器系数是反映某个脏器受损的一个灵敏、有效和经济的指标,可为进一步进行生物化学和病理组织学检测以及寻找毒物作用靶器官提供重要线索。通过对心、肝、脑、肾各脏器的脏器系数进行测定,发现随着砷浓度的升高,大鼠心、肝、脑和肾脏器系数均随之升高,肝脏与肾脏分别是砷代谢与排泄的重要器官,心脏和脑也是砷毒性作用的主要靶器官,脏器系数的升高说明砷蓄积对机体各脏器造成了严重损伤。在排除体重变化对脏器系数变化影响的情况下,脏器系数的异常,可旁证病理组织学改变的可能性。皮肤是砷的主要靶组织之一,近年来,砷对皮肤损害的机制成为众多研究者关注的焦点之一。皮肤损害是慢性砷中毒时最早出现的病理改变,也是慢性砷中毒患者特异的临床特征,一旦发生,将很难恢复。光镜下观察皮肤病理切片,正常对照组大鼠皮肤组织结构基本正常,表皮层厚度均匀,表皮细胞排列整齐;而染毒组可见表皮不同程度的角化,表皮层厚度不均匀,部分细胞细胞核固缩、溶解或消失,尤以中、高剂量组病变明显。砷吸收后通过循环系统分布到全身各组织、器官,对循环系统的危害首当其冲。临床上主要表现为与心肌损害有关的心电图异常和局部微循环障碍导致的雷诺氏综合征、球结膜循环异常、心脑血管疾病等。对心脏组织行光镜观察,结果显示正常对照组心肌细胞呈梭形,细胞间通过胞体相连;低剂量组可见部分心肌纤维轻度水肿,胞浆疏松、淡染;中、高剂量组部分心肌灶性变性,间质出血。人群流行病学调查和动物实验结果显示,砷可以透过血脑屏障进入脑组织,并可在脑组织中蓄积,对脑神经细胞产生毒性作用,引起记忆障碍、智力低下等神经行为异常。从本实验的脑组织病理切片可以观察到砷染毒组大鼠的大脑皮质层有不同程度的神经细胞出现核固缩、核溶解、树突拉长等病理改变。提示砷可导致脑损伤,脑是砷毒性作用的一个敏感的靶器官,因此不容忽视砷对脑组织的损伤。肝脏组织形态学观察发现正常对照组大鼠肝小叶结构正常,肝细胞与肝血窦以中央静脉为中心向周围呈放射状排列,肝细胞形态基本正常,呈多边形,结构完好,细胞核大而圆,核染色质稀疏淡染,核仁清晰;染毒组大鼠肝脏出现细胞水肿及脂肪变性,部分细胞细胞核固缩或溶解,胞浆稀疏、淡染,细胞灶性坏死及炎细胞浸润,与以往的报道一致。砷主要通过肾脏排泄,因此会对肾脏产生一定的影响。砷还可导致染砷大鼠子代肾组织超微结构的改变。光镜下观察肾脏病理切片,正常对照组大鼠肾小球和肾小管结构正常,肾小管上皮细胞呈正方形,无明显病变,细胞核圆形,位于基底部,排列整齐;染毒组肾小球毛细血管扩张充血,肾小管上皮细胞出现细胞水肿、脂肪变性、管腔狭窄等病理改变。表明大鼠经饮水摄入NaAsO2,持续90d后,可致明显的肾脏损害。与其他研究者报告的结果一致。综上所述,饮水中砷的剂量与砷的作用有着直接关系,不同剂量的砷均可对机体造成不同程度的损伤。关于砷在皮肤及不同脏器中的作用机制有待在以后的研究中予以进一步研究。分别计算心脏,肝脏,脑及肾脏脏器系数,即各个脏器的湿重与单位体重的比值。采用火焰原子吸收法测定皮肤和心、肝、脑、肾各组织中总砷含量。在整个实验过程中,对照组大鼠活动正常,生长发育良好,未见任何明显的异常表现。染毒组大鼠与对照组比较进食量、饮水量都相对减少,染毒后期活动减少,反应迟缓,出现程度不等的被毛杂乱脱落,光洁度降低,以高剂量组更为明显。在染砷9周后,高剂量组大鼠出现烦躁、互相抓咬;部分大鼠出现毛发光泽度降低,背部掉毛,皮肤潮红,活动减少等异常