紫杉醇及其半合成类似物多西紫杉醇的研究进展

紫杉醇及其半合成类似物多西紫杉醇的研究进展

紫杉醇（paclatal，ptx，1）是从太平洋紫杉树皮中提取的两层天然产物。与半合成相似的多溪醇（logiccollaboration2）是迄今为止发现的最有效的抗癌药物。其抗癌作用机制是通过促进微管蛋白聚合,并抑制其解聚,将细胞周期阻断于G2/M期,从而导致癌细胞死亡。紫杉醇因其具有结构新颖、作用机制独特、抗癌效果显著、抗癌谱广等特点,自1992年底在美国上市后,已先后被40多个国家批准上市,并作为一线抗癌药物广泛应用于乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的治疗。然而,紫杉醇与其他化疗药物一样,也会产生一系列毒副作用,主要表现在对神经系统的破坏、心脏毒性以及脱发等。另外,紫杉醇低的水溶性及对于多药耐药(MDR)肿瘤细胞的低活性也限制了其临床应用。因而,开发具有较低的毒副作用、较好的水溶性、较强的靶向性并且对于多药耐药细胞具有较强活性的紫杉醇前药一直是国内外药物化学家的研究热点,本文作者对近十几年来紫杉醇类前药的设计策略及活性研究状况进行综述。1前药策略的评价前药是生物可逆的药物分子的衍生物,它在体外活性较小或无活性,在体内能够经酶或非酶作用释放出活性原药从而发挥药效。当药物的药剂学、药动学、药效学方面存在缺陷时就会影响药效的发挥,因此,前药策略是一种有效的方法。这里所说的缺陷主要是指化学不稳定性、水溶性低、口服吸收差、难以穿越血脑屏障、毒副作用、非靶向性等。前药结构通常分为原药和载体两部分,基于紫杉醇的结构,其前药的设计多数是在其2′-OH、7-OH引入亲水性或者靶向性基团,以提高其水溶性和靶向性。其中,2′-OH是理想的前药设计功能基,此类前药在体内能够经酶或化学作用释放出具有活性的原药;而7-OH经结构修饰所得的紫杉醇衍生物往往由于其极强的稳定性而难以在体内释放出原药,因而不是最佳的前药设计功能基。2生物前体药物按照前药的靶标以及前药键合载体种类的不同,紫杉醇类前药可以大致分为6类:1)以亲水性小分子基团作为载体的前药,包括磷酸盐类、羧酸盐类、氨基酸轭合物、糖基衍生物等。2)以靶向肿瘤组织为设计理念的前药,包括靶向肿瘤组织过表达的酶或转运蛋白、靶向癌细胞低氧组织、靶向癌细胞过表达受体、靶向癌细胞过表达多肽、抗体导向酶前药(ADEP)以及不饱和脂肪酸轭合物等。3)靶向癌细胞过表达抗原的紫杉醇-抗体轭合物。4)以水溶性高分子为载体的紫杉醇轭合物,包括透明质酸轭合物、聚乙二醇轭合物、聚L-谷氨酸轭合物等。5)不键合任何载体的前药(生物前体药物)。6)Fe3O4纳米粒和Au纳米粒作为转运载体的前药。2.1磷酸酯类前药为了改善紫杉醇的水溶性(0.25mg·L-1),早期的前药设计主要是在2′-OH或7-OH处引入磺酸基、磷酸基、戊二酸(盐)、苹果酸(盐)、叔胺盐等亲水性基团。Mathew等人设计合成的化合物3对人乳腺癌细胞异种移植的大鼠体内抑制活性与紫杉醇相当,且水溶性显著增加(大于10g·L-1)。磷酸酯类前药化学稳定性比较好,并能快速地被分布在小肠壁和肝脏的磷酸酯酶所水解,是一个优良的前药载体。因此,磷酸酯类前药是水溶性前药设计中最重要的一类,经典的“三甲锁”前药4就是基于这个设计思想而设计的。体外实验结果表明,前药4能够释放出原药;然而体内实验结果显示,其活性与紫杉醇相比有所下降,原因可能是前药广泛地与血浆蛋白结合,不能全部被磷酸酯酶所激活。Damen等合成了紫杉醇-苹果酸轭合物5,其水溶性为0.6g·L-1,且具有较高的稳定性,它在血浆中的半衰期为4h。体外实验结果显示,5对人乳腺癌细胞株MCF-7、EVSA-T的活性与紫杉醇相当;对小鼠P388白血病肿瘤模型体内实验显示,轭合物5的活性明显优于紫杉醇。糖类化合物在细胞间的相互识别、相互作用、癌症的发生和转移等生物过程中都起着关键的生物信息作用。Shimoda与Hamada研究小组在紫杉醇7-OH处以羟基乙酰基作为间隔基,合成了系列紫杉醇-葡萄糖轭合物6。实验结果显示,这些化合物均具有很好的水溶性,其中葡萄糖单糖、五糖轭合物的水溶性分别为紫杉醇的53、6800倍。体外活性评价结果显示,对于卵巢癌细胞株KF、HAC-2,葡萄糖单糖轭合物的活性与紫杉醇相比有所下降,且活性随着葡萄糖单元的增加而下降,糖基轭合物6的体内活性研究目前正在进行中。2.2激活前药的专一性以小分子为前药载体的紫杉醇前药能够显著地改善药物的水溶性,有利于临床上注射给药。然而,紫杉醇面临的一个棘手难题是如何解决或缓解由于靶向性差而引起的毒副作用。要想专一性地在肿瘤组织处激活前药,参与激活前药的酶、受体等也必须是专一性分布在靶组织内或者其附近,然而肿瘤细胞往往很少含有某些特定的靶标(例如酶、受体等)。幸运的是,目前已经发现了几种用于区分肿瘤细胞与正常细胞表型差异的酶及受体(例如过表达特定的酶、受体等)。2.2.1靶向转运前药及纤溶酶前药利用靶细胞过表达的酶或转运蛋白,从而专一性的酶解或者转运前药是提高药物靶向性的一种重要策略。目前已知的可能的特异性靶酶主要有:葡萄糖转运蛋白(GLUTs)过表达、纤溶酶(plasmin)过表达、唾液酸糖苷(sialidase)酶过表达等。Chen研究小组设计合成了在紫杉醇的2′-OH处以丁二酰基为间隔基的紫杉醇-葡萄糖甲苷轭合物7。他们期望以癌细胞过表达葡萄糖转运蛋白(GLUTs)为靶标,靶向转运前药7。实验结果显示,前药7不仅具有很好的水溶性(0.35g·L-1)和稳定性,而且可以选择性地被癌细胞膜表面过表达的葡萄糖转运蛋白(GLUTs)转运。7对人乳腺癌细胞株MCF-7的活性与紫杉醇相当;它对RPTEC人正常细胞没有明显的细胞毒性(IC50=1.575μmol·L-1),而紫杉醇对RPTEC细胞系却显示出很强的细胞毒性(IC50=9.0nmol·L-1),这一结果表明肿瘤细胞能够靶向转运前药7,提高了药物对肿瘤细胞的选择性。纤溶酶(plasmin)在癌细胞表面过表达,它在癌浸润和转移过程中,参与基质降解活化、肿瘤生长以及血管生成等作用,在癌组织中被尿激酶纤维蛋白溶酶原活化因子所激活,因此,这种丝氨酸蛋白酶可以作为肿瘤组织中特异性的靶标来设计前药。Scheeren研究小组设计合成了靶向纤溶酶的前药8,它是以碳酸酯的形式将三肽片段与紫杉醇的2′-OH轭合。实验结果表明,8在磷酸盐缓冲溶液中(pH=7.3)具有较好的稳定性(t1/2=42min),且在纤溶酶的作用下可以平稳地释放出紫杉醇原药,此酶解过程见图1。体外活性评价结果显示,8对试验的肿瘤细胞株的抑制活性均比紫杉醇稍差,原因可能是纤溶酶并没有完全被激活,目前体内活性评价正在进行中。2.2.2-硝基苯丙烯醇前药癌细胞代谢旺盛,需要消耗大量的能量和氧气,与正常细胞相比,大多数实体瘤细胞处于一种乏氧的环境中,因而,肿瘤细胞的低氧环境可作为前药的设计靶标。Damen等合成了以此为靶标的前药9,它是将对-硝基苯丙烯醇以碳酸酯的形式与紫杉醇的2′-OH轭合,期望硝基作为癌细胞内源性还原酶的激发点将前药激活,进而通过1,8-消除的电子级联转移,脱除轭合载体,释放出原药。实验结果显示,该前药在磷酸盐缓冲液(pH=7.4,37℃)中24h内保持稳定,具有很好的稳定性。体外活性评价结果显示,它对实验的7种肿瘤细胞株的抑制活性是紫杉醇的1/60～1/80,虽然前药9在低氧环境下并没有被激活,但是他们已通过化学手段证实,将硝基还原后能很好地激活前药,释放出紫杉醇。2.2.3靶向药物治疗肿瘤的理论依据和细胞生物学特性快速增殖的癌细胞的一部分膜受体往往过表达,因而有可能成为前药设计的靶标,其设计思想是:在紫杉醇合适的功能基处通过适当的间隔基与膜受体配体轭合,从而达到靶向转运紫杉醇的目的。整合素是广泛存在于细胞表面的一类细胞黏附分子,能与其他细胞黏附分子和细胞外基质相互作用,介导细胞黏附。整合素通过与配体分子中的RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列结合而发挥其对细胞活性的调节。Haubner等设计研发了环状RGD肽(cilengitide),靶向作用于αvβ3和αvβ5整合素,通过阻止整合素与细胞外基质中纤维黏连素和黏蛋白的相互作用,诱导内皮细胞和肿瘤细胞的移行、分化、增殖、凋亡,抑制血管生成和肿瘤的发展。这些研究结果为整合素靶向药物治疗肿瘤提供了理论依据。Chen研究小组将双环肽10与紫杉醇的2′-OH以丁二酰基为间隔基轭合得到靶向整合素的前药11(E-[c(RGDfK)2]-紫杉醇),对植入过表达αvβ3整合素受体的MDA-MB-435乳腺癌细胞的裸鼠体内实验结果显示,在相同的给药剂量下,与紫杉醇相比,前药11具有更高的癌靶向性和较低的毒副作用。该前药可诱导细胞于G2/M期凋亡,而与双环肽10相比,它对αvβ3整合素受体的亲和力稍差。Claudia研究小组对前药11进行体外活性测试,结果表明,其对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的抑制活性与紫杉醇相当(IC50值约为0.4nmol·L-1),然而在用药30min时前药11和紫杉醇对HUVEC抑制作用的IC50值分别为25、10nmol·L-1。这种明显的变化说明11与紫杉醇进入细胞的途径不同,前者包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)双环肽E-[c(RGDfK)2]载体,可黏附于过表达αvβ3整合素的内皮细胞中,通过受体介导的胞吞作用将药物分子转运至细胞内,而疏水性的紫杉醇可快速地扩散至细胞内。进一步研究发现,前药11能够抑制血管内皮细胞的迁移和毛细血管的形成。然而,对异种植入人卵巢癌细胞的裸鼠体内实验结果显示,前药11没有抗癌效果,相反,紫杉醇却表现出中等强度的抗癌效果。最近,Cao等报道了前药11对于植入MDA-MB-435乳腺癌模型的裸鼠体内实验结果,前药11以相当于10mg·kg-1紫杉醇的剂量给药,而紫杉醇与E-[c(RGDfK)2]分别以10、10mg·kg-1剂量联合给药,结果显示,该轭合物与紫杉醇相比具有温和提高的抗癌效果,但是没有观察到肿瘤的消失。2.2.4紫杉醇酯化衍生物及其应用多不饱和脂肪酸(PUFA)是人体膳食所需的营养成分之一,其中,ω-3不饱和脂肪酸中的α-亚麻酸(LNA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)可以抑制癌基因编码蛋白的表达和功能,抑制肿瘤血管生成,抑制癌细胞与内皮细胞黏附,对乳腺癌、胃癌、子宫癌等多种癌症有较好的抑制作用。快速增殖的肿瘤细胞往往比正常细胞需要消耗更多的包括天然脂肪酸在内的初级代谢产物作为生物化学行为的前体,因此,多不饱和脂肪酸可以作为靶向前药设计的重要载体。Sparreboom等将紫杉醇的2′-OH与二十二碳六烯酸(DHA)进行酯化来改变紫杉醇的药动学行为,延长了紫杉醇对肿瘤细胞的作用时间,从而使药物在癌细胞内达到足够的有效浓度。实验结果显示,前药12对多种人肿瘤细胞株均无抑制活性,体外实验结果表明该前药无微管聚合活性。然而,轭合物12作为P-糖蛋白(P-glycoprotein)外排泵作用的底物,其剂量为紫杉醇的1/4。它对小鼠、大鼠和狗的最大耐受剂量分别是紫杉醇的4.5、3.6、2.9倍。对植入Madison109肿瘤的雌鼠体内实验结果表明,前药12以120mg·kg-1的剂量60d内使10组雌鼠肿瘤完全消失,而同样剂量下,给予紫杉醇并没有观察到肿瘤消失。由此可见,PUFA可将药物靶向肿瘤细胞环境。最近,Ojima研究小组设计合成了几类PUFA-紫杉烷轭合物,主要针对MDR细胞,研究发现,不仅二十二碳六烯酸可以作为优良的轭合载体,而且α-亚麻酸(LNA)-紫杉烷轭合物的体内活性也与DHA-紫杉醇相当。2.2.5前药及其类化药抗体导向酶前药治疗(ADEPT)是近年来颇具应用前景的肿瘤导向治疗新策略,它开拓了靶向抗癌药物研究的新方向,该策略可以显著降低药物毒性,提高药物在癌细胞环境中的浓度。Scheeren研究小组按照ADEPT策略设计合成了糖苷类前药13、14,他们期望该类前药可以被人体内β-葡萄糖醛酸苷酶所激活。实验结果显示,前药13、14的水溶性为紫杉醇的数百倍,在pH=6.8和37℃环境下具有很好的稳定性。酶催化激活前药的实验证明,在10μmol·L-1酶浓度下,100μmol·L-1前药13、14释放紫杉醇的半衰期分别为45、120min。β-葡萄糖醛酸苷酶催化裂解糖苷键,通过系列化学转化释放出紫杉醇,其过程如图2所示。体外实验结果显示,前药13、14在人体内β-葡萄糖醛酸苷酶作用下对细胞株OVCAR-3抑制活性的IC50值分别为0.6、1.1nmol·L-1,而紫杉醇为0.2nmol·L-1。他们认为这种活性的降低是因为所用酶的浓度不足以激活前药,并发现激活前药所需酶的浓度至少为10mg·L-1,而更长的间隔基可解决酶水解无效的问题。Schmidt小组将前药的间隔基加长以避开庞大的紫杉烷环,设计合成了系列ADEP前药,其中,前药15在pH=7.2和37℃环境下具有很好的稳定性,在2.5mg·L-1酶浓度下,前药15的半衰期为10min。目前,此类前药的体内活性实验正在进行。2.3靶向转运细胞毒抗体对于相应抗原具有高度的识别能力和特异性结合能力,以抗体作为载体,通过合适的间隔基与抗癌药物轭合,可以将药物导向含有互补抗原的细胞或组织上,从而提高药物的选择性。研究表明,单克隆抗体(mAbs)也可以作为靶向转运细胞毒药物的载体。Dubowchik研究小组利用溶酶体组织蛋白酶B作为前药的激活酶设计了前药16(通过间隔基将对溶酶体组织蛋白酶B敏感的二肽载体轭合到紫杉醇的2′-OH处),16在人血浆中具有很好的稳定性,在鼠的肝脏溶酶体作用下的半衰期为19min,而在人的溶酶体组织蛋白酶B作用下具有较长的半衰期(t1/2=9h),前药16较好的稳定性使得该二肽成为靶向转运紫杉醇前药的很好载体。2.4联合用药的疗效水溶性高分子能够靶向转运药物到达特定部位,并在肿瘤组织附近特异性累积,这是因为肿瘤组织对于此类高分子前药具有很好的通透性,并且可以控制药物的缓慢释放,使药效持久。此类前药往往具有很好的稳定性、较低的毒副作用、极好的水溶性等特点。2.4.1紫杉醇和聚乙二醇载体的筛选聚乙二醇是一种高水溶性药物轭合载体,且在肾脏和肝脏中很容易被代谢清除。Greenwald小组设计合成了聚乙二醇轭合物17,其分子质量为5kDa,水溶性为600g·L-1,体外活性与紫杉醇相当。体内活性结果显示,17对P388非白血性白血病细胞的抑制活性比紫杉醇稍低。此外,轭合在紫杉醇7-OH处的聚乙二醇载体难以水解释放出原药,因而体外活性比紫杉醇差,而紫杉醇的2′-OH轭合物的体内活性比紫杉醇稍好,说明聚乙二醇载体的最佳轭合位点为紫杉醇的2′-OH。Feng等合成了系列以不同种类的氨基酸为间隔基的聚乙二醇前药,此类前药毒副作用显著降低,体外活性评价显示其细胞毒活性要高于紫杉醇,体内活性与紫杉醇相当。2.4.2紫杉醇单次给药抑制肿瘤生长聚L-谷氨酸也是一种水溶性的轭合载体,它可在体内降解为无毒的L-谷氨酸。Li等设计合成了前药18(PG羧基端直接与紫杉醇的7-OH轭合),分子质量达到36kDa,具有很高的水溶性(100g·L-1),在血浆中144h内仅有0.1%的紫杉醇释放出来。体内活性评价结果显示,该前药具有显著的抗癌活性。对鼠卵巢癌OCa-1细胞系,以80mg·kg-1的最大耐受剂量(MTD)一次性给予紫杉醇可使肿瘤生长受到抑制,10d后观察到肿瘤继续生长;而前药18以同样剂量给药也可显著地抑制肿瘤的生长,当以160mg·kg-1一次性给药可使肿瘤生长完全抑制,两周后所有给药组的鼠体内没有观察到肿瘤。对于鼠乳腺癌13762F细胞,紫杉醇以20mg·kg-1一次性给药仅在5d内能够抑制肿瘤的生长;而前药18以同样剂量给药,在23d内均可抑制肿瘤的生长,当以40mg·kg-1剂量一次性给药可使肿瘤生长完全得到抑制。Poliglumex(CT-2103)是由18衍生而来的轭合物(聚L-谷氨酸载体直接轭合于紫杉醇的2′-OH处),其最大分子质量为80kDa,其m、n之比约为10,紫杉醇所占的比例为37%。目前该前药已经进入Ⅲ期临床研究,单独或者联合其他化疗药物用于治疗卵巢癌、非小细胞肺癌、乳腺癌。临床研究显示,Poliglumex与紫杉醇相比毒副作用较低,白细胞减少、脱发、秃顶等症状明显减轻,无需按照常规前驱给药法给药。2.5生物前体前药生物前体前药不包含任何载体,在体内可经生物转化作用激活前药,生成原药。与载体前药相比,此类前药不需要考虑载体部分释放所引起的毒副作用,因此,生物前体前药将成为极具发展潜力的设计策略。Skwarczynski等设计合成了前药19,该前药水溶性达到0.45g·L-1,约为紫杉醇的1800倍。前药19在固体状态或酸性环境中具有较好的稳定性,但在碱性条件下(pH=7.4,37℃,t1/2=15min)可生物转化为紫杉醇。目前,关于此类前药的体内评价结果尚未报道。其释放过程如图3所示。2.6不同有机溶剂释放速率纳米粒(NPs)由于其独特的生药学特性一直倍受人们的关注,纳米粒前药设计已经成为前药设计的策略之一。氧化铁纳米粒(Fe-NPs)和金纳米粒(Au-NPs)是研究最为广泛的两种。氧化铁纳米粒具有强大的磁化作用且在体内几乎无毒性,因而广泛地应用于药物、基因