微生物实验报告

功能微生物的筛选、培养与选育生科院09012109091711月30日概要：以产抗生素细菌的筛选和选育为目的，通过培养基制备及灭菌、菌种的分离纯化、菌种的鉴定、培养条件的优化以及诱变育`种五个试验，学习有关的试验技术和措施.关键词：分离纯化、灭菌、酶活性、诱变一、材料与措施：1.11牛肉膏蛋白胨培养基的配制配方（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，琼脂20，pH7.0～7.2。注：配制3000mL，分装20支固体斜面试管（不超过试管高度的1/3）和20支液体试管（不超过试管高度的1/3），其他分装于1L三角瓶，每瓶500mL。不一样pH值配制1(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5pH4.0

配制2(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5pH7.2不一样碳源

配制3：淀粉3g，蛋白胨10g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O1.5g，去离子水1000mLpH7.2

配制4：葡萄糖3g，蛋白胨10g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O1.5g，去离子水1000mLpH7.2不一样氮源

配制5：硝酸钠10g，葡萄糖3g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O1.5g，去离子水1000mLpH7.2

配制6：蛋白胨10g，葡萄糖3g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O1.5g，去离子水1000mLpH7.21.12无菌水的准备50ml三角瓶内盛入18ml蒸馏水，放入8～10颗玻璃小珠，加盖瓶塞，包扎待灭菌；50ml三角瓶内盛入18-20ml蒸馏水，加盖瓶塞，包扎待灭菌；1.13灭菌材料与器皿的包扎1.试管的包扎：7支试管为一包扎单位，用报纸将试管塞部分包扎严实并绳之以纱线；2.三角瓶的包扎：用报纸将瓶塞部分包扎严密，并以纱线系之；3.培养皿的包扎：6个平皿为一包扎单位，用报纸以滚筒方式将其包紧；4.玻璃移液管的包扎：每1支吸管为包扎单位，用细长条报纸以卷烟方式扎之5.1.5mL离心管的包扎：6个离心管为包扎单位，用报纸包成小包。固体斜面的摆放注：斜面长度不超过试管长度的1/21.14灭菌首先将具有培养基的三角瓶和试管放入灭菌锅，注意不要让培养基倾斜以防溢出，然后再放入其他的玻璃器材。灭菌物品之间不要摆放太挤，以保证高压蒸汽灭菌可以彻底。1.21土壤样品的采集

在国教中心前取土，天气晴朗，用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的灭菌信封内。1.22制备土壤稀释液：

称取土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，振荡5min，即为稀释10－1的土壤悬液，土壤悬液80℃水浴加热10分钟，然后在离心管中依次稀释至10-2、10-3等稀释度。1.23制备淀粉培养基平板制5块牛膏蛋胨培养基平板

详细制法为：倒入融化好的淀粉琼脂培养基（温度为不烫手为宜）并轻轻摇摆混匀，置于桌面冷却为平板。

在无菌培养皿底部注明个人信息（分离菌名、稀释度、组别、班级）。1.24a吸取稀释液

无菌操作法分别吸取10－1、10－2、10－3土壤稀释液0.1mL，分别加在已制好的3块淀粉平板培养基上。b涂板

用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充足混匀铺平，倒置于恒温箱培养。1.25培养置于504房间30℃培养24小时。1.26观测水解圈的产生并测其半径。a、48小时后，在之前稀释涂布的三块淀粉培养基上选用经典的单个菌落，并用记号笔在平板背面进行编号。然后将编号后的菌落用无菌牙签挑取，在备用的淀粉培养基平板上分别划线接种（编号与被挑菌落相似）b、将碘液滴加在之前稀释涂布的三块淀粉培养基上，观测与否有水解圈的产生，并测量其半径。c、根据水解圈的有无以及大小鉴定有关菌落与否产生淀粉酶，并记录该菌落编号，并将接种有分离平板上菌落的备用淀粉琼脂平板冰箱保留留作后续试验之用。1.27菌种活化在1.28前的48h将平板菌种接入牛肉膏蛋白胨液体试管活化，并接种一支斜面试管保藏。提前18h按0.2％接种量分别转接如下五种液体摇瓶发酵培养基：1牛肉膏蛋白胨培养基30℃培养2牛肉膏蛋白胨培养基18℃培养3牛肉膏柠檬酸钠培养基30℃培养4牛肉膏硝酸钠培养基30℃培养5牛肉膏蛋白胨培养基pH430℃培养1.28不一样条件对淀粉酶活性的影响测定a倒制淀粉培养基平板一块。培养基倒入量规定不要太多，尽量薄一点，铺满平板底部即可。b用小滤纸片分别蘸取各瓶18小时培养物少许，规定不要蘸太多，保证每片所蘸培养物尽量一致c如右图所示，将小滤纸片贴在淀粉培养基表面，并分别在底板上做上标识d将平板置于30℃培养箱作用1h。然后将碘液铺在平板上，分别测量水解圈的大小1.29不一样条件对菌体生长量影响的测定a将培养18小时后液体摇瓶培养物分别取出3mL于比色杯中，在721型分光光度计600nm波长下测定吸光度。假如菌液浓度过大，可做合适稀释后再进行测量。b分别记录多种不一样培养基和不一样培养条件下OD600值大小，评价对菌体生长量的影响。产淀粉酶菌种的鉴定1.31产淀粉酶待检菌的培养特性与形态特性的观测与鉴定1.培养特性的观测：菌落形状与大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落与培养基颜色等；2.细菌细胞的显微观测：细胞形状是杆状（长杆或短杆）还是球状？有无芽孢？有无荚膜？3.细菌的革兰氏染色：按照试验二的操作措施进行（设置原则的革兰氏阳性和阴性菌为对照）。1.32细菌的16SrDNA分子鉴定反应体系：在一种PCR管中用微量移液枪依次加入列物质：Taqbuffer（10×）

2.5μlMgCl2（25mM）1μldNTP（2.5mM）

2.5μlPrimerForward（50mM）

1μlPrimerReverse（50mM）

1μlddH2O

16.5μl用灭菌牙签挑取单菌落于PCR管中，使菌体悬浮于反应体系中。rTaq（2U/μl）

0.5μlPCR反应条件：95℃预变性15min后，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共25个循环，72℃延伸10min。1.33琼脂糖凝胶电泳1.制胶：配制0.7%琼脂糖溶液20mL，用1×TAE电泳缓冲液做溶剂，加热溶解，稍冷后，加入模具中，插入梳子，待胶凝固；2.制样：PCR反应结束后，取出PCR管，吸取5μl与1μl6×样品Buffer混合后所有点入浸于TAE电泳缓冲液中的琼脂糖凝胶的样品孔中；3.电泳：100V电泳20min；4.染色：将凝胶置于样品染料溴化乙锭中染色；10min，然后将凝胶置于紫外灯下进行检测，当在凝胶上出现预期大小的DNA条带（约1.5Kb），则认为是PCR阳性，这时将与此电泳样品对应的PCR反应管放置冰箱短期保留。1.34PCR扩增片段测序获得的PCR阳性样品由专人送往测序企业进行测序，大概一周后测序成果可以返回，然后在电脑的有关软件上进行读序。1.35序列比对分析使用NCBI网站看待测菌的16SrDNA序列与数据库中多种菌的16SrDNA序列进行比对。登陆美国国立生物技术信息中心网站，使用BLASTn在GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB基因库中进行同源性搜索。从Genebank中选择近与待测菌目的基因序列同源性最高的已知分类的菌株的16SrRNA基因序列,初步确定待测菌的分类位置。用Clustal软件将已知分类菌株的16SrRNA序列与待测菌的16SrRNA序列进行多序列比较。1.41菌种的活化与接种每组提前40h将分离的产淀粉酶菌株转接至试管斜面，30℃培养箱培养。培养24h后，每组挑取一环活化菌株，接种至含10ml淀粉培养基的50ml三角瓶中，于25℃，150r/min的摇床中振荡培养。1.42诱变a.菌悬液的制备取出培养约16h的摇瓶，取0.5ml菌悬液（吸取前三角瓶要摇匀）于离心管中（每组3管），5000r/min离心5min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2次，加入1.5ml无菌生理盐水制成菌悬液。b.平板制作融化淀粉培养基，每组倒4块平板，在平板上做好标识。c.诱变处理(1)启动紫外灯预热10-20min。(2)紫外处理：取制备好的菌悬液3mL移入6cm的无菌培养皿中，将上述平皿置于紫外灯下的脱色摇床上，打开皿盖，距离紫外灯管30cm，照射3min（单号排）或者6min（双号排），盖上皿盖。(3)稀释菌液：在超净台内，将照射后的菌悬液用无菌水按10倍稀释法依次稀释成10-1-10-5（在dorf管中进行）。(4)涂布平板：取10-3、10-4（单号组）和10-4、10-5（双号组）两个稀释度的菌悬液各0.1ml涂布均匀。以同样的操作，取未经紫外线处理的菌悬液稀释涂布平板作为对照。平板于37℃倒置培养48h(用黑布包好平板)。1.43计算成活率和致死率a.存活率将培养48h后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1mL菌液中的活菌数。b．致死率将培养48h后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1mL菌液中的活菌数。1.44观测诱变效应在平板菌类计数后，分别向菌落数在5~6个左右的平板内加入碘液，分别测量透明圈直径与菌落直径并计算比值(H/C值)，与对照平板进行比较（紫外照射和对照组随机选出6个算平均值）。选用H/C比值大的菌落移接到新鲜牛肉膏斜面上培养，用于复筛。理解微生物分类与鉴定中的基本程序和常规试验技术与措施；2.熟悉16SrRNA基因PCR扩增进行细菌鉴定的基本原理并初步掌握PCR的操作技术二、试验成果21765431.26观测水解圈的产生并测其半径。2176543半径：1号2号3号4号5号6号7号2.5mm2.5mm4mm无水解圈1.5mm0.5mm0.5mm后期试验选用的为三号。

1.29不一样条件对菌体生长量影响的测定分别记录多种不一样培养基和不一样培养条件下OD600值大小，评价对菌体生长量的影响。培养基类型OD600值牛肉膏蛋白胨培养基（30℃培养）0.770牛肉膏蛋白胨培养基（18℃培养）0.913牛肉膏柠檬酸钠培养基（30）0.440牛肉膏硝酸钠培养基（30）0.770牛肉膏蛋白胨培养基pH4（30）0.0051.31产淀粉酶待检菌的培养特性与形态特性的观测与鉴定1.培养特性的观测：菌落形状与大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落与培养基颜色等；小而均匀、单个分散、较湿、表面突起、不透明呈白色。2.细菌细胞的显微观测：细胞形状是杆状（长杆或短杆）还是球状？有无芽孢？有无荚膜？细菌细胞是杆状，无芽孢，无荚膜。ResultofG-3.细菌的革兰氏染色：按照试验二的操作措施进行（设置原则的革兰氏阳性和阴性菌为对照）。ResultofG-1.35序列比对分析T-3C-4C-3T-31.43计算成活率和致死率T-3C-4C-3T-3T-4T-4C-3C-4T-3T-4菌落个数41255a.存活率将培养48h后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1mL菌液中的活菌数。试验误差较大，无法计算存活率。b．致死率将培养48h后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1mL菌液中的活菌数。试验误差较大，无法计算致死率。1.44观测诱变效应在平板菌类计数后，分别向菌落数在5~6个左右的平板内加入碘液，分别测量透明圈直径与菌落直径并计算比值(H/C值)，与对照平板进行比较（紫外照射和对照组随机选出6个算平均值）。C-4C-3C-4C-3T-4T-3T-4T-3首先目视水解圈较大且无明显变化。标志测量成果如下(大小均为直径，单位mm)：菌落序号123456菌落大小3321.51.52水解圈大小10910111011H/C值3.333.005.007.336.665.50菌落来源t-4t-4c-4t-3t-3c-3H/C值的平均值为5.13.测量成果显示，-4的菌落经6MIN紫外照射后H/C值有略微的变大。-3的菌落有略微的变小。三、讨论：1、牛肉膏蛋白胨培养基的配制过程中的注意事项a牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。本试验中用的是后一种措施。b蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。c称药物时严防药物混杂，一把牛角匙用于一种药物，或称取一种药物后，洗净、擦干，再称取另一药物，瓶盖也不要盖错。d在琼脂溶化的过程中，需不停搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最终补足所失的水分。e调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量\o"培养基"培养基的原始pH值，假如pH偏酸，用滴管向\o"培养基"培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.0～7.2。反之，则用1mol/LHCl进行调整。尽量pH值不要调过头，以防止回调，否则，将会影响\o"培养基"培养基内各离子的浓度。在本试验中明显看到培养基颜色较清。也许原因是水过多。2、第二次斜面划线较第一次有很大的进步，经验如下：划线时调取菌落应适量，不要贪多，划线速度与密度应慢一点，不规定快，但过慢也不行，力度应使接种环刚接触培养基表面，技术成熟度方面还需要多加实践与总结。3、培养基配好后为何要立即灭菌？怎样检查灭菌后的培养基是无菌的？培养基自身就是用来培养细菌的，里面的营养成分很适合细菌的生长，不立即来菌，细菌就会在里