第15章DNA的生物合成和损伤修复课件

CrickWatsonCrickWatson1DNAReplicationTranscriptionTranslationTheCentralDogmabyFrancisCrickin1958DNAReplicationTranscriptionTr2

DNA的生物合成和损伤修复DNABiosynthesisandDNADamageRepair第十五章第三篇基因信息传递DNA的生物合成第3染色体DNA复制的一般特征ThegeneralfeaturesofreplicationofchromosomalDNA第一节染色体DNA复制的一般特征第一节4一、DNA复制是半保留复制一、DNA复制是半保留复制51958Meselson-Stahl实验1958Meselson-Stahl实验6双螺旋DNA复制时，复制区生长点的结构呈Y形或叉形，称之为复制叉(replicationfork)。二、DNA复制的生长点形成复制叉目录双螺旋DNA复制时，复制区生长点的结构呈Y形或叉形，称之为复7三、DNA复制是双向复制

一个起点，两个复制叉，双向复制。两个起点，两个生长点，单向复制。一个起点，一个复制叉，单向复制。三、DNA复制是双向复制一个起点，两个复制叉，双向复制。83

5

3

5

3

5

3

5

前导链(leadingstrand)后随链(laggingstrand)解链方向冈崎片段3

5

四、DNA复制为半不连续复制前导链（leadingstrand）后随链（laggingstrand）冈崎片段（Okazakifragments)DNA半不连续复制。35353535前导链后随链解链方向冈崎片段9复制起点（origin）：五、复制起点由多个短重复序列组成原核生物单一复制起点真核生物多个复制起点复制子（replicon）从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域。

复制起点（origin）：五、复制起点由多个短重复序列组成原10E.coli复制起始点oriC复制起点的一般特征:①多个短重复序列;②可被复制起始因子所识别;③一般富含AT，利于DNA解旋。Green:initiatorbindingsitesBlue:

unwoundregionRed:replicationinitiationsiteE.coli复制起始点oriC复制起点的一般特征:Gre11六、DNA复制必须有引物（一）多数DNA复制使用RNA引物（二）个别DNA复制以DNA或核苷酸为引物

174等噬菌体以双链环形DNA的一条链上产生切口处的3

-OH为引物；腺病毒及某些线性DNA病毒以DNA末端蛋白上的dCTP的3

-OH为引物。(三)体外DNA合成采用DNA作引物六、DNA复制必须有引物（一）多数DNA复制使用RNA引物12Proteinprimingasasolutiontotheendreplicationproblem.Proteinprimingasasolution13DNA聚合酶：催化合成DNADNA解旋酶（helicase）：解开DNA双螺旋，暴露复制模板链引发酶：引发，即合成RNA引物，利用引物3’-OH开始延伸DNA连接酶：连结冈崎片段其它酶和蛋白因子七、DNA复制需要多种酶参与如：起稳定作用的单链DNA结合蛋白（SSB）和改变DNA超螺旋状态的DNA拓扑异构酶（topoisomerase）等。DNA聚合酶：催化合成DNA七、DNA复制需要多种酶参与14DNA聚合酶的合成前误差控制(presyntheticerrorcontrol)和校正控制(proofreadingcontrol)功能。细胞修复系统是DNA复制高度忠实性的重要因素。复制起始利用引物也是确保DNA复制忠实性的重要机制之一。八、DNA复制具有高度忠实性DNA聚合酶的合成前误差控制(presyntheticer15

DNA聚合酶的特征

FeaturesofDNApolymerases第二节 DNA聚合酶的特征第二节16一、DNA聚合酶的底物是dNTP和引物-模板连接处dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）引物-模板复合物/连接处(primer-templatejunction)一、DNA聚合酶的底物是dNTP和引物-模板连接处dNTP17CorrectlypairedbasesarerequiredforDNApolymerasecatalyzednucleotideaddition.二、DNA聚合酶的活性中心催化DNA合成Correctlypairedbasesarereq18SchematicillustrationofWHYrNTPcannotbeusedbyDNApolymeraseSchematicillustrationofWHY19三、DNA聚合酶半闭合右手结构有3个结构域聚合酶活性中心，位于手掌上部，即手指和拇指接合部；3

5

外切酶活性中心，位于手掌底部。手掌结构域手指结构域拇指结构拇指手掌引物链手指聚合酶活性中心外切酶活性中心模板链三、DNA聚合酶半闭合右手结构有3个结构域聚合酶活性中心，位20DNA聚合酶合成的进行性（processivity):DNA夹子（slidingclamp）可增强DNA聚合酶的进行性。四、可滑动的DNA夹子增强DNA聚合酶的进行性DNA聚合酶合成的进行性（processivity):四、可21DNA聚合酶3

5

外切酶活性与校对功能(proofreading).五、DNA聚合酶还有一个3’

5’外切酶活性中心DNA聚合酶35外切酶活性与校对功能(proofrea22大肠杆菌DNA复制过程DNAreplicationinE.coli第三节大肠杆菌DNA复制过程第三节23E.coliDNA复制起始

一、在复制起点解旋酶和多种因子形成复合物识别复制起点；解旋解链,形成复制叉单链DNA形成，SSB结合单链引发体组装及引物合成。E.coliDNA复制起始一、在复制起点解旋酶和多种因24DnaA、DnaB、DnaC、HU、促旋酶（gyrase，即拓扑异构酶Ⅱ）、单链DNA结合蛋白(singlestrandbindingprotein,SSB)DNA复制起始需要6种蛋白因子：DnaA、DnaB、DnaC、HU、DNA复制起始需要6种蛋25E.coli中DnaB结合引发酶DnaG，催化合成RNA引物，其序列始于pppAG，模板链序列3

-GTC-5

，引物长度一般11~12个碱基。二、引发酶合成RNA引物E.coli中DnaB结合引发酶DnaG，催化合成RNA引26负责切除RNA引物。三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合酶Ⅰ切除引物DNA聚合酶Ⅰ可利用损伤尚未修复的DNA链作为模板合成DNA，但不能修复损伤。负责合成DNA。DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅱ负责切除RNA引物。三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合27TLS1Rev1TLS，体细胞高变1Pol

相对准确的TLS（穿越环丁烷二聚体）1Pol

TLS1Pol

体细胞高变（somatichypermutation）1Pol

减数分裂相关的DNA损伤修复1Pol

TLS1Pol

DNA交联损伤修复1Pol

DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复4Pol

DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复2~3Pol

线粒体DNA复制和损伤修复3Pol

碱基切除修复1Pol

合成引物4Pol

功能亚基数目真核生物TLS（translesionsynthesis）3PolⅤ(UmuC,UmuD)DNA损伤修复，穿越损伤合成（TLS）1PolⅣ(DinB)染色体DNA复制9PolⅢ全酶染色体DNA复制3PolⅢ核心酶DNA损伤修复1PolⅡ去除RNA引物，DNA损伤修复1PolⅠ功能亚基数目原核生物（E.coli）原核、真核细胞DNA聚合酶的类型和功能目录TLS1Rev1TLS，体细胞高变1Pol相对准确的28DNA聚合酶Ⅲ全酶结构核心酶由

、

和

亚基组成：

亚基（130000）主要功能是合成DNA

亚基具有3

5

外切酶活性（校正功能）

亚基可增强其活性

亚基可能起组装作用γcomplex/clamploaderDNA聚合酶Ⅲ全酶结构核心酶由、和亚基组成：293

5

3

5

3

5

3

5

前导链(leadingstrand)后随链(laggingstrand)解链方向冈崎片段3

5

在复制叉同时合成前导链和后随链

同一个聚合酶如何同时合成两条链?35353535前导链后随链解链方向冈崎片段30

在复制叉同时合成前导链和后随链在复制叉同时合成前导链和后随链31第15章DNA的生物合成和损伤修复课件32三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合酶Ⅰ切除引物三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合酶Ⅰ切除引物33DNA聚合酶Ⅰ切除引物DNA连接酶（ligase）将两个冈崎片段之间的缺口DNA聚合酶Ⅰ

5

3

外切酶：去除RNA引物3

5

外切酶：起校正作用DNA聚合酶活性：填补缺口DNA聚合酶Ⅰ切除引物DNA聚合酶Ⅰ34323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段：Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端枯草杆菌蛋白酶DNA-polⅠ323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段：Kl35Ter(terminus)Tus(terminusutilizationsubstance).四、Tus蛋白识别复制终点使复制终止Ter(terminus)四、Tus蛋白识别复制终点使复制361)ParentDNAarefullymethylated;2)DaughterDNAarehemimethylated3)SeqAquicklybindstohemimethylatedsequences;4)InhibitsfullmethylationandbindingofOriCbyDnaA;DammethylasemethylatesDNAattheN6positionofalladenineswithinGATCsequences.五、DNA甲基化保证复制起点在每个复制周期中仅起一次作用1)ParentDNAarefullymethyla37E.ColiDNAreplicationisregulatedbyDnaA,ATPlevelsandSeqASeqAsequesterDnaAbindingofOriC;AdditionalDnaAbindingsitesinthechromosome(~300,afterreplicationitisduplicated)andthusdecreasetheDnaAlevelavailable;ATPlevelandthereplacementofDnaA-ADPtoDnaA-ATPisaslowprocess.E.ColiDNAreplicationisregu38复制过程中产生正超螺旋。拓扑异构酶消除正超螺旋。六、DNA复制需要两类DNA拓扑异构酶复制过程中产生正超螺旋。六、DNA复制需要两类DNA拓扑异构39E.coIi的TopoⅠ只作用于负超螺旋DNA，消除负超螺旋。

DNA拓扑异构酶Ⅰ的功能：E.coIi的TopoⅠ只作用于负超螺旋DNA，消除负超螺旋40E.coli的TopoⅡ将前方产生的正超螺旋转变为负超螺旋。DNA拓扑异构酶Ⅱ的功能E.coli的TopoⅡ将前方产生的正超螺旋转变为负超螺旋。41E.coli的TopoⅣ分离连环体E.coli的TopoⅣ分离连环体42ReplicationterminationinEukaryotes:

TheendreplicationproblemPage333ReplicationterminationinEuk43Solution1:Proteinprimingasasolutiontotheendreplicationproblem.Solution1:Proteinprimingas44Solution2:Replicationoftelomeresby

telomeraseSolution2:Replicationoftel45ReplicationoftelomeresbytelomeraseReplicationoftelomeresbyte46线粒体和噬菌体的DNA复制DNAreplicationinmitochondriaandphages第五节线粒体和噬菌体的DNA复制DNAreplicationi47一、线粒体DNA按D环方式复制环形、双螺旋DNA分子、一条H链和一条L链dNTPDNA-polγ

线粒体DNA分子特点：两条链具有不同的复制起点和相反的合成方向；一、线粒体DNA按D环方式复制环形、双螺旋DNA分子、一条H48二、噬菌体DNA按滚环方式复制环形双螺旋DNA分子；一条为模板链，另一条为非模板链??E.coli噬菌体DNA的分子结构特点：二、噬菌体DNA按滚环方式复制环形双螺旋DNA分子；E.co493

-OH5

-P5

5

5

3

3

3

3

5'滚环复制5'

5

3

3

5

3-OH5-P55533335'滚环复制550DNApolymeraseerrorratesInitialpairingerror=1/105Afterproofreading-Finalcopy=1/107Actualerrorrates~1/109Humangenome=3.2x109bp3errors/replication!DNApolymeraseerrorratesInit51MutationofDNAToofast:harmfultosurvivalandproliferation;Tooslow:lackofevolutionforce.MutationofDNAToofast:harmf52DNAdamageandrepairDNADamage:AnychangesintheDNAmoleculeisreferedtoas~.Mutation:ApermanentchangeinthenucleotidesequenceofDNAiscalledamutation.DNAdamageandrepairDNADamag53ImportanceofDNARepair•DNAistheonlybiologicalmacromoleculethatisrepaired.Allothersarereplaced.•Morethan100genesarerequiredforDNArepair,eveninorganismswithverysmallgenomes.•CancerisaconsequenceofinadequateDNArepair.ImportanceofDNARepair54DNA损伤修复TheRepairofDNADamage第六节DNA损伤修复第六节55一、复制差错和化学/物理因素造成体内DNA损伤DNA复制产生误差化学或物理损伤转座子（transposons）的转座作用自发突变遗传信息的突变来源：一、复制差错和化学/物理因素造成体内DNA损伤DNA复制产生56首先，在基因组中迅速找到错配的核苷酸；然后，准确地校正错配核苷酸。二、错配修复系统修复DNA复制中出现的差错错配修复系统（mismatchrepairsystem）能够发现和修复DNA复制中错配的核苷酸，提高复制准确率。错配修复系统：首先，在基因组中迅速找到错配的核苷酸；二、错配修复系统修复D57E.coli错配修复系统修复复制差错（一）E.coli依赖Dam甲基化酶识别错配碱基所在的DNA链E.coli错配修复系统修复复制差错（一）E.coli依赖D58模板链的GATC序列甲基化MutH仅切割新合成的DNA链MutH仅切割新合成的DNA链模板链的GATC序列甲基化MutH仅切割新合成的DNA链59MSH（MutShomologs）蛋白与MutL同源的MLH和PMS蛋白（二）真核细胞利用冈崎片段连接前的DNA缺口辨别错配碱基所在的DNA链真核细胞错配修复系统无MutH，也无半甲基化标记母链。错配修复系统利用冈崎片段连接前的DNA缺口辨别错配碱基所在的DNA链。真核细胞核苷酸修复错配系统：MSH（MutShomologs）蛋白（二）真核细胞利用冈60三、多种化学或物理因素造成细胞DNA损伤碱基丢失碱基改变核苷酸插入或缺失DNA链断裂DNA链间共价交联DNA损伤类型其一，导致复制或转录障碍其二，导致复制后产生基因突变DNA损伤的结果:三、多种化学或物理因素造成细胞DNA损伤碱基丢失DNA损伤类61四、DNA损伤修复系统有多种类型DNA聚合酶（Y-家族），如E.coli：UmuC嘧啶二聚体，无嘌呤位点跨损伤DNA合成E.coli：RecA和RecBCD双链断裂重组修复E.coli：UvrA,UvrB,UvrC,UvrD人：XPC,XPA,XPD,ERCCI-XPF,XPG嘧啶二聚体，碱基烷基化核苷酸切除修复DNA糖苷酶（即DNA糖基水解酶）碱基损伤碱基切除修复E.coli：DNA光裂合酶等嘧啶二聚体直接修复E.coli：MutS,MutL,MutH人：MSH,MLH,PMS复制差错错配修复酶损伤修复系统的类型四、DNA损伤修复系统有多种类型DNA聚合酶（Y-家族），如62修复对象：将DNA中因紫外线照射而形成的嘧啶二聚体分解。分布：分布广泛，除哺乳动物外均有之。（一）直接修复（directrepair）系统利用酶简单地逆转DNA损伤光复活修复系统：修复对象：将DNA中因紫外线照射而形成的嘧啶二聚体分解。（一63修复对象：DNA中被甲基化修饰的鸟嘌呤（O6-甲基鸟嘌呤，与T配对）。特点：DNA甲基转移酶一旦接受甲基就不再具有催化活性，修复代价高昂。O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶修复修复对象：DNA中被甲基化修饰的鸟嘌呤（O6-甲基鸟嘌呤，与64E.coli碱基切除修复系统切除胞嘧啶自发脱氨基产生的尿嘧啶（二）碱基切除系统修复切除受损碱基Baseexcisionrepair,BERE.coli碱基切除修复系统（二）碱基切除系统修复切除受损碱65胞嘧啶脱氨基产生的尿嘧啶；氧化的鸟嘌呤（oxoG）；脱氨基的腺嘌呤；开环碱基；碳原子之间双键变成单键的碱基等。

DNA糖苷酶识别的异常碱基包括：胞嘧啶脱氨基产生的尿嘧啶；DNA糖苷酶识别的异常碱基包括：66（三）核苷酸切除修复系统识别DNA双螺旋变形nucleotideexcisionrepair,NERNER识别DNA双螺旋结构变形而非特殊碱基UvrA识别DNA双螺旋结构变形UvrB负责解链，募集核酸内切酶UvrCUvrC在损伤部位的两侧切断DNA链UvrD去除这两个切点之间的DNA片段DNA聚合酶Ⅰ和连接酶填补缺口（三）核苷酸切除修复系统识别DNA双螺旋变形nucleoti67（四）重组修复系统能够修复双链断裂损伤（四）重组修复系统能够修复双链断裂损伤68E.coli跨损伤DNA合成（五）跨损伤DNA聚合酶能够跨越损伤部位合成DNAE.coli跨损伤DNA合成（五）跨损伤DNA聚合酶能够跨69第七节逆转录概念：在逆转录酶