基因工程基本操作过程(目的基因与运载体结合)

目的基因与运载体结合基因工程基本操作过程基因工程（geneticengineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。基因工程要素：包括外源DNA，载体分子，工具酶和受体细胞等1.提取目的基因2.目的基因与运载体结合（基因表达载体的构建）是基因工程的核心。3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测和表达切、接、转、增、检重组DNA技术的操作步骤：

外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用.

基因重组:就是利用限制性内切酶及其他一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基因．将两者连接起来，将目的基因插入于可以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以这种外源性的目的基因在受体细胞内得到扩增或正确表达。依不同的研究目的而定，认真设计最终构建的重组体分子。需要考虑下列2个方面。如果研究目的是：(1)表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启动子、增强子等调节序列和终止序列，要将目的基因置于启动子的转录起始点的下游，并审视“阅读框”是否正确，这些对表达融合蛋白至关重要。(2)对某一基因的上游序列进行调控机能分析，则需考虑选择适当的报告基因，并将可能具有调控机能的目的基因置于报告基因的上游适当位置。若调控基因可能有增强子作用，还应在报告基因下游适当部位插入一个功能基因，由此反映增强子的作用。一、连接前的准备为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，使其可以互相连接，形成新的重组分子。二、连接前的处理载体DNA通常有着许多酶切位点．但是并不是所有的酶切位点都可用于重组切割，理想的酶切位点应该符合下列几个条件:1）位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好是单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA以最高的几率正确组合.2）

在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使插入的目的基因可在该启动子的指导下高效表达。3）选择的载体必须在连接后对基因转录和翻译过程中的编码区读框不改变。1.对载体的要求当载体和外源DNA用同样的限制性内切酶切割时，所形成的DNA末端就能够彼此相匹配，可以被T4连接酶共价地连接起来，形成重组体分子。但是,当靶片段的末端与载体不匹配时，必须转换其中一个或两个片段的末端形式以便使之连接。这种末端的转换通常用以下三种方式转换：①

3’凹端补平：使用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段部分补平3’凹端，将不匹配的3‘凹端转换为粘端；或者完全补平，产生平端DNA分子，可与任何其他平端DNA相连接。

②3’突端切除：T4噬菌体DNA聚合酶具有强烈的3’-5’外切核酸酶活性，可将3’突端切除。

③平端加上人工合成接头：合成接头是自相互补的两个化学合成的寡核苷酸的等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带一个或多个限制性酶切位点的平端双链体。因此在平端DNA加接头可为其亚克隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。2、连接前的处理：末端的转换载体DNA和目的基因DNA的连接,按DNA片段末端性质不同，可有下述不同的连接方法：①粘性末端连接法

②平端连接法③同聚物加尾连接法④人工接头连接法三．基因与载体的连接4种方法1.同一限制酶切位点连接:由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割产生单链突出的粘性末端和酶切位点附近的DNA序列不影响连接.在连接酶的作用下即可形成重组DNA分子.

上述方法的缺点：由限制酶产生的具有粘性末端的载体DNA分子，在连接反应中常发生自我环化作用，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合环状结构。解决方法：用细菌的碱性磷酸酶预先处理线性的载体DNA分子，去除其5‘末端的磷酸基。（一）粘性末端DNA片段的连接

2.不同限制酶切位点连接:由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段、具有相同类型的粘性末端，彼此称为互补末端也可以采用粘性末端连接。外源DNA和载体DNA经过两个限制性内切酶切割后一侧产生的黏性末端，另一侧产生平未端（可先生成黏性末端再补平）。双酶切片段的定向克隆的优点外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质粒中，以便目的基因的正确转录和表达。载体与外源DNA结合处的限制酶切位点仍然保留，可以随时从重组载体中通过相应的限制性内切酶切割后分离获得目的基因。不会自身环化，转化率高，转化后的细菌克隆大多数携带有目的基因的重组质粒。

一些内切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割产生DNA的片段没有粘性末端，而是平末端。具有平末端的酶切载体只能与平末端的目的基因连接。T4DNA连接酶可催化相同或不相同的限制性内切酶切割的平端间的连接。平端连接比粘性末端连接要困难的多，其连接效率很低，约有粘性末端连接的1%。适用于限制性内切酶切割产生的平端适用于粘端补齐或切平形成的平端

（二）平端连接提高平头末端连接效率的方法包括：

①加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）②加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会；③加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用；④加入单价阳离子（NaCl）。

当载体和外源DNA片段两端的酶切位点之间，不可能找到恰当的匹配时，解决方法：

⑴人工接头连接法：通过依次加入、连接合成DNA接头，再用限制酶切加以解决。

⑵同聚物加尾连接法：可以利用末端转移酶分别在载体酶切位点处和外源DNA片段的3’端加上相互补的同聚尾加以解决。⑶PCR法：通过PCR(聚合酶链反应)技术扩增外源DNA片段，从而加上合适的限制性内切酶的单一识别序列，再用限制酶切加以解决。同聚物加尾连接：利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3′端各加上一段寡聚核