青枯雷尔氏菌脂肪酸型种下分化的分类方法

青枯雷尔氏菌脂肪酸型种下分化的分类方法

0青枯雷尔氏菌种下分化的分析方法【研究意义】植物细菌的绿色干燥病是由绿枯萎雷土（ralstoniasona）引起的毁灭性土壤传播疾病。青枯雷尔氏菌可危害44个科300多种植物，造成农林业生产巨大经济损失。【前人研究进展】青枯雷尔氏菌在寄主范围、地理分布、致病特征、流行特征、种下分化等方面存在较大的差异，具有明显的多态性。青枯雷尔氏菌的种下分化复杂，前人从生理小种（race）、生化型（biovar）、血清型（serotype）、溶源型（lysotype）、基因型（genetype）等方面对种下分化进行研究。然而，许多研究表明，采用的种下分化的分析方法与青枯雷尔氏菌的致病性无特定的相关性，同一个生理小种的青枯雷尔氏菌中存在着不同的致病性菌株。王国平等分析了湖南省烟草青枯雷尔氏菌的生化型，认为青枯雷尔氏菌致病力的强弱与生化型没有直接的相关性。血清型、溶源型、基因型的分析，无法区别不同致病力的青枯雷尔氏菌菌株。【本研究切入点】寻找与致病性相关的青枯雷尔氏菌种下分化的分析方法，成为研究的焦点。微生物学研究表明：细胞结构中普遍含有的脂肪酸成分与细菌的DNA具有高度的同源性，各种细菌具有其特征性的细胞脂肪酸指纹图谱，可用于建立脂肪酸细菌鉴定系统方法。脂肪酸是构成青枯雷尔氏菌生物膜的重要物质，作为细胞表面物质与细胞识别、种下特异性和细胞免疫等有密切关系。表面脂肪酸能有效地用于与致病力相关的青枯雷尔氏菌种下分化的分析有过报道。【拟解决的关键问题】本文利用与青枯雷尔氏菌致病力相关的指标——弱化指数和回接组培苗发病率，通过聚类分析建立不同致病性菌株脂肪酸模式类型，对菌株的脂肪酸种类进行聚类分析，通过主成分分析，找到与致病性相关的脂肪酸的主要成分，用判别分析建立青枯雷尔氏菌脂肪酸型判别模型，为青枯雷尔氏菌脂肪酸型的鉴别提供理论基础。1材料和方法1.1青枯雷尔氏菌的分离纯化从福建省经济作物番茄、茄子、辣椒和生姜青枯病严重发生的田块采集样本，参照方中达的方法，用2,3,5-氯化三苯基四氮唑培养基（简称TZC）培养基分离纯化，得到40株青枯雷尔氏菌，保存于20～25℃的无菌水中，备用。菌种来源见表1。1.2脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本的制备脂肪酸提取所用的试剂：包括脂肪酸甲酯混合物标样（由美国MIDI公司提供）、菌落收集培养基（TSB培养基）、脂肪酸提取所需试剂[皂化试剂、甲基化试剂、萃取试剂和洗涤试剂（由美国Fisher公司提供）]，除脂肪酸甲酯混合物标样为直接应用外，其它试剂配制由MIDI公司提供；脂肪酸的提取包括菌落收集、细菌细胞皂化释放脂肪酸、脂肪酸的甲基化、脂肪酸甲酯萃取和基本洗涤等步骤，具体操作由Midi公司提供。在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本：二阶程序升高柱温，170℃起始，5℃/min升至260℃，而后40℃/min升温至310℃，维持90S；汽化室温度250℃、检测器温度300℃；载气为氢气（2ml·min-1）、尾吹气为氮气（30ml·min-1）；柱前压10.00psi(1psi=6.895kPa）；进样量1µl，进样分流比100﹕1。气相色谱系统采用的是美国Agilent6890型（AgilentChromatograph:GC），包括全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器；分析软件应用美国MIDI公司开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定细菌的软件MIS4.5(MicrobialIdentificationSystem）和LGS4.5(LibraryGenerationSoftware）。1.3田间致病类型的确定将上述40株青枯雷尔氏菌（表1）作为研究对象，在TZC平板培养基上培养青枯雷尔氏菌单细胞菌落，按照刘波等建立的弱化指数的测定方法，测定40株供试菌株的弱化指数N=D1/D2，（其中N为弱化指数，D1和D2分别表示在TZC平板培养基上青枯雷尔氏菌细胞单菌落的红斑半径和菌落半径），每个菌株测定60个单菌落弱化指数，同时用剪叶法对测定过弱化指数的青枯雷尔氏菌单菌落进行番茄组培苗回接，每个菌株选择30个测定过弱化指数的单菌落回接30株组培苗，设清水对照，将回接的组培苗放置于28～30℃的人工气候箱内培养，10d后观察发病率。根据弱化指数和回接发病率，确定其致病类型。比较青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与其致病性之间相互关系。1.4青枯雷尔氏菌的图谱选择青枯雷尔氏菌脂肪酸指纹图谱匹配率最高菌株的图谱作为模式图谱，说明青枯雷尔氏菌脂肪酸种类、特征、种类鉴定参数等。对被测的40株菌株特征峰值，用DPS软件进行方差分析。1.5青枯雷尔氏菌脂肪酸分型以脂肪酸种类为指标，以菌株为样本，构建聚类分析数据矩阵，以欧氏距离为相关尺度，用类平均法为聚类方法，利用LGS软件对40株青枯雷尔氏菌脂肪酸色谱结果进行聚类分析，得出系统树图，分析脂肪酸特点的菌株脂肪酸型类别，与菌株致病性指标弱化指数和发病率进行比较，阐明菌株脂肪酸型与致病性的相互关系。1.6脂肪酸型判别模型的建立首先，进行脂肪酸特征色谱同质性聚类分析，选择40株被测菌株的脂肪酸特征色谱18个峰值数据，以菌株为指标，以色谱峰值为样本，构建分析矩阵，以马氏距离为相关尺度，用类平均法为聚类方法，将色谱峰进行系统聚类，分成不同的色谱峰组，同一色谱峰组的脂肪酸峰具有同质性。其次，进行各色谱峰组中关键成分分析，用主成分分析选择色谱峰组中的主要成分，以累计特征值大于90%为指标，在因子得分矩阵中，从各色谱峰组中选择一个得分因子总和为最高的色谱峰，组成色谱峰组特征脂肪酸。最后利用判别分析建立脂肪酸型判别模型，以选出的特征脂肪酸为指标（Xj），被测的青枯雷尔氏菌菌株（Xi）为样本，青枯雷尔氏菌脂肪酸型级别（Y）为测定值，以组建判别分析数据矩阵如下：其中，j为脂肪酸峰序号，i为菌株脂肪酸型级别序号。用Bayes逐步判别方法建模，多组逐步判别分析是按照Bayes准则，用WILKS统计量从M个因子中，根据各因子判别能力大小的显著性检验结果，精选出若干判别能力大的且配合较好的因子，建立Bayes判别函数。并可判别新的样本是属于哪一组。Bayes判别函数方程：聚类分析、主成分分析、判别分析采用DPS数据处理系统进行计算。2结果与分析2.1不同脂肪酸峰的划分试验结果见表2。选用的青枯雷尔氏菌为25号，菌株名称Rs-T.1.3-010702-25，采集地点福州北峰，寄主植物番茄，采集日期2001年07月02日。色谱的有效峰从保留时间1.776起点到保留时间16.332为终点，共18个峰，每个峰代表一（类）脂肪酸。不同的菌株，峰的数量、峰值大小和脂肪酸种类不同。大部分菌株鉴定用的脂肪酸峰从序号4（即十四碳脂肪酸）开始，到序号18（即十八碳脂肪酸）结束，约15组脂肪酸。不同的菌株，进入鉴定判别脂肪酸峰的数量不同，就该菌株而言，进入鉴定参考的脂肪酸峰有8条，即序号4、5、8、9、10、11、16、17。不同脂肪酸峰值百分比不同，就该菌而言，<1%的脂肪酸有序号5、9、11、13、14、17,1%～9%的脂肪酸有序号4、6、10、12、16、18,10%～30%的脂肪酸有序号7、8、15。青枯雷尔氏菌脂肪酸特征图谱见图1。被测的青枯雷尔氏菌40株菌株，脂肪酸种类最多的为22种，最少的为17种。选择较为常见的18种脂肪酸，进行方差分析，结果可知菌株的脂肪酸种类间差异显著（P<0.01），不同菌株间差异显著（P<0.01）。不同的菌株，脂肪酸出现的种类不同，有的脂肪酸在所有菌株中出现，如十四碳脂肪酸（C14﹕0）、混合脂肪酸（C14﹕03OH/16﹕1ISOI）、混合脂肪酸（C16﹕01ω7c/C15ISO2OH）、十六碳脂肪酸（C16﹕0）、2-羟基十六碳脂肪酸（C16﹕12OH）、ω7c-十八碳脂肪酸（C18﹕1ω7c）、2-羟基十八碳脂肪酸（C18﹕12OH），能进入计算机进行种类鉴定的脂肪酸一般为5～8种，当相似性指数大于0.5时，被计算机判别为青枯雷尔氏菌。2.2青枯雷尔氏菌的致病性利用LGS软件对40株青枯雷尔氏菌脂肪酸色谱结果进行聚类分析，系统树图（dendrogram）见图2。基于LGS软件，样品的欧氏距离（euclidiandistance）在10或以下时为同一种菌（species）；欧氏距离为6时，表示同一种的不同类群。从图2可以看出，当λ=6.15时，40株青枯雷尔氏菌分成3个脂肪酸型类群，可用脂肪酸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型（groupⅠ、Ⅱ、Ⅲ）表示。3个类群脂肪酸之间的主要差异（表3）：有（1）平均脂肪酸种类：groupⅠ最多，有22种，groupⅡ最少，有17种，groupⅢ介于两者之间，有19种。（2）主要脂肪酸的平均含量：3个类群中含量最低的脂肪酸都是C18﹕1ω7c，而在groupⅢ中其含量（16.23%）明显的低于其在groupⅠ（20.21%）和groupⅡ（21.14%）中的含量；含量最高的脂肪酸，在groupⅠ和groupⅡ中是C16﹕1ω7c/C15﹕0ISO2OH含量最高，在groupⅢ中则是C16﹕0含量最高；C16﹕1ω7c/C15﹕0ISO2OH和C16﹕0含量的差值，groupⅠ（9.01%）明显大于groupⅡ（4.54%）。（3）在groupⅠ中，第3个特征性色谱峰C16﹕1ω7c/C15﹕0ISO2OH和第4个特征性色谱峰C16﹕0之间出现一个小的波峰，而在groupⅡ和groupⅢ中则没有。（4）代表非优势脂肪酸的小波峰，在groupⅠ中，主要集中在第1个特征性色谱峰C14﹕0和第2个特征性色谱峰C14﹕03OH/C16﹕1ISOⅠ之间以及第4个特征性色谱峰C16﹕0和第5个特征性色谱峰C18﹕1ω7c之间，而在groupⅡ和groupⅢ中，只有第4个特征性色谱峰C16﹕0和第5个特征性色谱峰C18﹕1ω7c之间比较多。测定供试的40株青枯雷尔氏菌菌株的序号、菌株名称、相似性指数、弱化指数和回接发病率、脂肪酸型、致病类型见表4。根据刘波等的研究，菌株的致病性区间划分如下：弱化指数<0.60时，菌株回接发病率为100%，定义为强致病力菌株；弱化指数>0.80时，菌株回接发病率为0，定义为无致病性菌株；弱化指数介于0.60和0.80之间的，菌株的致病性为不确定性，定义为过渡性菌株。从表4可以看出，脂肪酸Ⅰ型菌株的弱化指数>0.80，菌株回接发病率为0，为无致病性菌株；脂肪酸Ⅲ型的弱化指数<0.60，菌株回接发病率为100%，为强致病性菌株；脂肪酸Ⅱ型的弱化指数介于0.60和0.80之间，菌株回接发病率在6.7%～100%之间变动，为过渡性菌株。表明青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与致病性之间存在着相关性。2.3青枯雷尔氏菌脂肪酸型的筛选首先，选择40株被测菌株的脂肪酸色谱18个峰值数据，以菌株为指标，以色谱峰值为样本，构建分析矩阵，以马氏距离为相关尺度，用类平均法为聚类方法，将色谱峰进行Q型系统聚类，分成不同的色谱峰组，分析结果见图3，当λ=10.84时，脂肪酸种类可以分为3组，第1组包括了1～7序号的脂肪酸种类，第2组包括了8～11序号的脂肪酸种类，第1组包括了12～18序号的脂肪酸种类，同一色谱峰组的脂肪酸峰具有同质性。其次，用主成分分析选择色谱峰组中的主要成分，以累计特征值大于90%为指标，在因子得分矩阵中，从各色谱峰组中选择一个因子得分总和最高的色谱峰，组成色谱峰组特征脂肪酸。分析结果见表5。前3个主成分的特征值的累计百分比达90.8217%，表明前3个主成分代表了总体信息量的90%以上。前3个主成分的因子得分按脂肪酸色谱峰组归类见表6。从各脂肪酸组中选择一个因子得分总和最高的成分，作为判别模型建立的因子，选择Y(i,1）即十四碳脂肪酸（14﹕0）因子、Y(i,9）即十七碳脂肪酸因子（17﹕00）、Y(i,13）即十八碳脂肪酸因子（18﹕0）（表5）。最后，以选出的特征脂肪酸为指标（Xj），被测的青枯雷尔氏菌菌株（Xi）为样本，青枯雷尔氏菌脂肪酸型级别（Y）为测定值，以组建判别分析数据矩阵如表7。当Fa临界值=5.00时，计算结果建立的判别模型如下：Y1=-16.3353+0.0012X1+0.0056X9-0.0016X13Y2=-3.4928+0.0002X1+0.0003X9+0.0025X13Y3=-9.1550-0.0003X1+0.0039X9+0.0042X13式中，X1代表十四碳脂肪酸，X9代表十七碳脂肪酸，X13代表十八碳脂肪酸，Yi代表第i类脂肪酸型。计算后分类和后验概率见表8。模型对青枯雷尔氏菌脂肪酸型的判别准确率达92.50%，对于40个菌株的脂肪酸型的判别，错误4个，分别是7、26、34、37号菌株，判别错误的原因都是将原来属于脂肪酸型Ⅲ的判别成脂肪酸型Ⅱ，判错的级别不算太高，因为脂肪酸型Ⅱ属过渡型，其中存在着致病性菌株，模型的判别精确度可以满足青枯雷尔氏菌脂肪酸型归类。模型的用法为，对于一个未知脂肪酸型的青枯雷尔氏菌菌株，首先测定脂肪酸图谱，取出X1（十四碳脂肪酸）、X9（十七碳脂肪酸）、X13（十八碳脂肪酸），代入方程，计算Yi，当1≤Yi≤2时，归为脂肪酸型Ⅰ，当2≤Yi≤3时，归为脂肪酸型Ⅱ，当Yi>3时，归为脂肪酸型Ⅲ。3青枯雷尔氏菌脂肪酸型的判别模型青枯雷尔氏菌作为模式微生物，完成了基因组的测序。青枯雷尔氏菌作为植物病原菌，具有十分丰富的多态性，在寄主中有单子叶、双子叶，1年生、多年生，草本、木本，表现出高度的生态适应性，这种适应性导致该菌的种下分化的复杂性。以往的研究提出了青枯雷尔氏菌生理小种（race）、生化型（biovar）、血清型（serotype）、溶源型（lysotype）、基因型（genetype）等，试图从不同角度，解释种下分化与致病性的关系，但是研究结果表明，该菌的各种下分化的分析方法无法与其致病性建立相关关系。从基因分析结果表明，青枯雷尔氏菌的致病性至少由22个基因控制，任何一个基因的改变都会改变其致病性，这给基因分析方法进行致病力检测带来了很大的困难。寻求简易可行、稳定可靠的分析青枯雷尔氏菌致病性分化的方法，是研究该菌致病力变化的核心。脂肪酸是构成细菌生物膜的重要物质；作为细胞表面物质与细胞识别、种族特异性、遗传变异、毒力、耐药性和细胞免疫等有密切关系，同时其分析方法简便，标准化程度高，具有较高的稳定性，用于青枯雷尔氏菌种下分化的分析是个理想方法，作者分析青枯雷尔氏菌脂肪酸型与其致病性关系，建立青枯雷尔氏菌脂肪酸型判别模型，该方法对于青枯雷尔氏菌种下分化的研究具有重要的意义。前人研究表明，青枯雷尔氏菌在不同寄主感病植株、在同一寄主不同侵染状态植株和同一寄主不同发病阶段植株体内分布及其致病力存在着异质性，根据弱化指数的划分标准，青枯雷尔氏菌的分布在番茄体内依次为根部>中部以上茎>中部以下茎；茄子和花生从根到上部茎依次含菌量逐渐降低；烟草根部和中部茎的含菌量显著高于下部和上部茎；生姜下部茎的含菌量显著高于姜块和中上部茎。不同植物感病植株体内青枯雷尔氏菌平均弱化指数的大小依次为茄子>烟草>花生>番茄>生姜。青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与其生理小种和生化型之间不存在相关关系，但是青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与致病性之间存在的相关性，可以作为青枯雷尔氏菌小种鉴定的新指标。但是青枯雷尔氏菌脂肪酸生物标记（biomarker）存在着质和量的变化，这种变化反映致病性的变化，只有通过模型的建立，才能准确判断青枯雷尔氏菌的致病性，本研究首次引入Bayes判别分析，建立青枯雷尔氏菌脂肪酸型的判别模型，并提出了判别模型建立中的因子选择策略。在建立青枯雷尔氏菌脂肪酸型模型中，作者采用了分层因子筛选方法，首先通过青枯雷尔氏菌脂肪酸组成与致病性的关系，确定各菌株的脂肪酸型，而后用聚类分析，对