观察小鼠睾丸染色体的数目及其形态特征实验报告 山东大学

山东大学实验报告2013年12科目细胞生物学实验题目_观察小鼠睾丸染色体的数目及其形态特征第1页共4页细胞生物学实验报告·观察小鼠睾丸染色体的数目及其形态特征【实验目的】1、掌握染色体的制备方法；2、观察小鼠睾丸染色体的数目及其形态特征；3、认识不同生物染色体的特征，学会做染色体组型图【实验原理】(一)制作染色体标本的先决条件：1、细胞具有旺盛的分裂能力（a.选择活跃的组织如睾丸，骨髓。b.施加药物使细胞分裂如PHA）2、设法得到大量中期细胞，秋水仙素处理。染色体特征：1.数目（2n=？）2.长度（绝对长度、相对长度）3.着丝粒位置（M\SM\ST\T）4.随体与次溢痕的数目、大小和位置5.带型分析(二)操作方法利用睾丸细胞的制片技术虽然需要离心以及细致的操作，但其基本程序是简便的。在小鼠睾丸中，细胞有丝分裂和减数分裂比较旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到分裂中期细胞。通过小鼠睾丸得到染色体比较简便，一般不需要无菌操作。用秋水仙素作为有丝分裂的抑制剂。由于小鼠睾丸细胞分裂活动旺盛，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。减数分裂是细胞分裂染色体数目减半时发生在性细胞的形成过程中。哺乳动物在性成熟以后，精巢内的性细胞总是在分批分期不断的成熟，因此，对哺乳动物的精巢进行一定的技术处理，随时都可以获得减数分裂过程中各个时期染色体的标本。用适量的秋水仙素溶液注入动物腹腔内，可以阻止分裂细胞纺锤丝的形成，从而积累大量处于分裂中期的细胞。利用上述原理，通过常规的制片方法，观察小鼠睾丸细胞的染色体。(三)中期染色体的特征1、突出在纺锤丝的牵引下，染色体的着丝点集中到细胞中央的道板上；2、DNA高度螺旋化。短粗的染色体清晰可见，染色体数目形态稳定，便于观察；3、由于染色体高度集中，造成纺锤体清晰可见。通过本实验的结果看，本实验要想做的较好不太容易，需要娴熟的技术和耐心，(四)原理分析通过获取小鼠睾丸细胞（分裂能力强），本实验采用这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。一般观察有丝分裂中期，染色体的形态最典型、最易辨认和区分。因此，制备染色体标本获取的是中期细胞。【实验用品】材料小白鼠试剂秋水仙素、0.3%KCl低渗液、固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）、Giemsa染液、0.9%生理盐水、柠檬酸钠溶液器材注射器（1ml,5ml）、5号针头、解剖盘、解剖剪、镊子、玻璃吸管、10ml刻度的离心管、离心机、载玻片、盖玻片、显微镜、滤纸、擦镜纸、棉花、量筒、天平、恒温水浴锅【操作步骤】预处理→取睾丸→剪碎→离心→低渗→离心→固定→离心→固定→滴片→染色→观察1．预处理：取雄性小鼠按每克体重注射4ug，给小白鼠注射秋水仙素，经14-16h后，断头法杀死小鼠，去除睾丸用生理盐水（0.9%的NaCl）洗去血污；2．放入装有1ml0.3%KCl液的小烧杯中剪碎（呈乳白色）；3．用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3%KCl液至4ml；4．37℃静置30min，进行低渗处理；5．离心：800-1000r/min离心8min,弃上清6．加入2ml甲醇冰醋酸固定液（3:1），并用吸管吹气，轻轻打散细胞，固定8min；7．再以800-1000r/min离心8min；8.弃去上清液，加1ml固定液，制成细胞悬液固定5min；9.取清洁的低温预冷载片，距10-15min高度滴下2-3滴细胞悬液，从一边轻轻吹气并随时轻轻敲打，以使细胞均匀分布和促进染色体展开；10.用滤纸擦去载片上多余液体，空气干燥后染色20-30min，用自来水冲洗后可观察；11.观察：先用低倍镜寻找细胞及中期分裂相，然后转入高倍镜下观察并记录。对实验步骤的分析简介如下：1.预处理——为了取出小鼠的睾丸细胞，在此之前要进行秋水仙素的注射，目的在于抑制纺锤丝的形成，使染色体排列在赤道板上，便于观察，而不至于纺锤丝的牵引下移动向细胞两极；2.低渗——此步骤不能使细胞因吸水而涨破；3.离心——务必要控制在800-1000r/min，过大会使细胞涨破，导致实验失败，时间也要控制，过长也会影响观察；4.固定——用固定液固定小鼠睾丸细胞，使细胞达到我们想要的状态；5.滴片——距10-15min高度滴下细胞悬液，并吹气和敲打，目的在于使细胞均匀分布和促进染色体展开；6.染色——采用倒置染色法，目的在于可使载玻片充分接触染液，若有杂质也可沉降至底部，不会和玻片直接接触。【实验结果】勉强可以数，有一小块染色体重叠。图中染色体数为20【实验结果分析】在此次试验中，我们主要出现了以下几种问题：染色体凝缩程度不够染色体没有分散开染色较浅，有的甚至没有染上颜色出现较多没有涨破的细胞处于分裂中期的细胞数量太少，导致在看滴片时很难找到中期染色体由此分析导致出现这些问题或影响实验结果的因素可能有以下一些1.不同低渗时间的影响通过两次实验并与其他组实验结果进行比较我们组比较了不同低渗时间对染色体制片的影响。低渗25min比第一次低渗的制片成功率稍高一些，但差异不明显；而在制备良好率上，低渗25min的效果明显优于其他低渗时间（结合其他组的实验结果分析得到）。2.不同滴片高度的影响在显微镜下发现，一些染色体出现断裂、染色体过于分散的情况，这在20和35cm的滴片高度下尤为明显，而25cm滴片高度的制备成功率和良好率都明显优于其他高度3.秋水仙素处理的时间和用量：由于细胞分裂不同步，小鼠睾丸内分裂中期细胞不多．所以一般在处死小鼠前要腹腔内注射秋水仙素，它可抑制纺锤体的形成，让细胞周期同步化，使同时达到中期的细胞增多，从而获得大量的中期分裂相。本次我们组染色体标本质量不佳的一个重要原因就是秋水仙素处理不当。因此秋水仙素处理时要注意：①注射的方法：应废左手提起腹部皮肤，右手拿注射器．针尖稍向上，进针后有落空感，表示进入腹腔。如果将秋水仙素注射在皮下，会影响小鼠的吸收．导致中期细胞的数量减少；我们在注射时发现部分秋水仙素流出，而且伴有血迹，因此推测可能注射部位不当，伤到了小鼠的脾脏等器官②秋水仙素处理的时间和用量：一般处理时间16h．处理时间过长或用量过高，染色体过分收缩或着丝粒分离，染色体短小．甚至破碎。处理时间过短或注射用量不够．不能阻断细胞分裂，导致中期分裂相减少。我们本次试验主要是出现了第①种问题4.低渗：低渗的作用是使细胞吸水膨胀，使其在制片时细胞易破裂利于染色体分散。本次低渗采用的是浓度为0.3%的KCl，水浴温度与动物体温一致，小白鼠为37度，水浴时间20min。低渗液使用前应进行预热防止温度变化使细胞低渗效果不好。低渗时问不宜过长，温度不宜过高，否则会使细胞提前破裂，造成细胞和中期分裂相大量丢失而较少，低渗时间过短，温度过低，细胞膨胀不足，造成制片后染色体分散不好，多重叠。在第一次试验时我们不仅在低渗时间上没有达到应有的长度，而且温度上也过低，导致第一次实验中出现大量没有涨破的细胞，即使涨破染色体也凝聚成团状，影响了观察。固定液的使用：固定时间要足够，固定作用不足，染色体出现边缘发毛，结构不清晰。加入固定液混匀细胞时用力也要适当，如果过猛，会使细胞破碎，染色体丢失，用力不够，细胞不易打散而成团块。通过照片显示染色体边缘不清晰可能是固定时间不够导致滴片：滴片时细胞悬液的浓度和滴数均可以影响细胞的多少，如在制作细胞悬液时，加入新鲜固定液太少，浓度大，制片后细胞密集，增加观察难度，如果加入新鲜固定液太多，细胞悬液太稀释，制片后细胞少，分裂相少。【注意事项】(一)制备方法要点:1.用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期,使中期染色体停留在赤道面处；2.用低渗法使将细胞膨胀,以至于在滴片时细胞被胀破,使细胞的染色体铺展到载玻片上，低渗与离心等步骤的操作要轻；3.空气干燥法可使使细胞的染色体在载片上展平,经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。(二)观察细胞的标准为：1．细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面上；2．染色体形态和分布良好，最好无