何首乌毛状根对倍半类化合物的生物转化研究

何首乌毛状根对倍半类化合物的生物转化研究

通过在植物细胞、组织或转化器官等生物体系中添加特定的外源化合物或功能物质，以获得具有价值的各种化学产物的过程，称为植物生物转化技术。由于高等植物中的次生代谢产物量相对很低且有些产物不能或难于通过化学合成途径得到,因此,人们期望能够充分利用植物组织培养以及植物酶对外源底物进行转化,得到目标化合物。其中很多反应具有区域选择性及立体特异性,其反应类型包括氧化反应、还原反应、羟基化反应、甲基化反应、乙酰化反应、异构化反应、糖基化反应以及酯化反应等。Furannoligularenone属于eremophilane型倍半萜,为菊科橐吾属植物的主要活性成分。该属植物具有止咳化痰、活血化瘀等功效,多种药材的根及根茎用作中药“紫菀”的代用品。目前用于生物合成/转化的植物培养系统很多,包括愈伤组织(callus)、器官培养、毛状根(hairyroot)等。由于毛状根系统具有生长迅速、不需加入外源激素、遗传性状稳定等特点,越来越受到重视。本研究组利用发根农杆菌浸染何首乌PolygonummultiflorumThunb.的无菌苗诱导得到何首乌毛状根,以考察其对倍半萜类化合物的转化能力。1材料和方法1.1培养瓶、培养液和培养时间所用培养基为无激素的MS培养基,蔗糖浓度为30g/L,在消毒前pH调至5.75,分装至250ml培养瓶,每瓶100ml,121℃灭菌20min。控制接种量为每100ml培养基5g鲜重毛状根(折合干重约为0.5g)。25℃振荡暗培养,摇床转速为110r/min;继代周期为12d。一般悬浮培养连续继代3次后,获得稳定生长的液体培养体系,可用作生物转化实验。1.2基本内容Furannoligularenone,王乃利教授惠赠,HPLC检测纯度>98%。1.3底物甲醇溶液的培养精确控制接种量,往3瓶预培养了9d的何首乌毛状根培养瓶中分别加入20mg/ml的底物Ⅰ甲醇溶液0.5ml,迅速摇匀。同样条件下继续培养。另取3瓶培养物,每瓶加入相同体积的甲醇(不含底物)作为空白对照。1.4提取液、培养基底物加入培养物中,共培养一段时间后,抽滤,分别获得何首乌毛状根培养物和培养基。培养物于55℃条件下烘干至恒重,乳钵研细,称取10mg粉末于容量瓶中,甲醇定容至5ml,超声提取1h后,甲醇补足至刻度;培养基定容至100ml后,取10ml,-20℃保存。HPLC分析前,将提取液、培养基经0.45μm微孔滤膜过滤后用于HPLC检测。同法平行处理对照组培养基和培养物,进行HPLC检测。HPLC检测条件:流动相为55%甲醇-水;流速为1.0ml/min;柱温25℃;检测波长280nm;进样量10μl。1.5培养基浸提液制备将200mg底物Ⅰ投入预培养9d的何首乌毛状根中,共培养6d。抽滤,分别获得培养物和培养基。培养物55℃条件下烘干至恒重,甲醇提取。合并提取液和培养液,减压浓缩,得浸膏。行硅胶柱层析,丙酮:石油醚梯度洗脱;合并产物,甲醇溶解,上SephadexLH-20柱,甲醇洗脱,经重结晶,得转化产物Ⅱ(8mg)和Ⅲ(6mg)。1.6底物共培养液制备精确控制接种量,向18瓶预培养了9d的何首乌毛状根培养瓶中分别加入20mg/ml底物甲醇溶液0.5ml,培养条件同上。分别在共培养1、2、3、4、5和6d后取出3瓶终止转化。抽滤获得培养物和培养基,处理方法同1.4项。2结果与分析2.1实验组的结果比较对照组和实验组的HPLC谱图(图1)可看出,在实验组中存在2个新色谱峰(保留时间tR约为6.2min和6.8min),结合TLC结果可以初步判定该生物转化是成功的。2.2cnmr格局化合物Ⅱ:C15H18O3,无色针晶,mp:184～186℃。1HNMR(CD3OD,400MHz)δ:6.67(dd,J=10.0,2.0Hz,H-1),6.00(dd,J=10.0,3.2Hz,H-2),2.50(q,J=6.8Hz,H-4),2.34(d,J=13.5Hz,H-6a),2.82(d,J=13.5Hz,H-6b),4.93(m,H-8),1.47(dd,J=12.3,1.4Hz,H-9a),2.58(dd,J=13.6,6.8Hz,H-9b),2.91(m,H-10),1.79(t,J=1.71Hz,H-13),0.62(s,H-14),1.12(d,J=6.8Hz,H-15)。13CNMRδ:151.9(C-1),130.2(C-2),202.5(C-3),44.2(C-4),45.0(C-5),35.2(C-6),161.9(C-7),81.5(C-8),37.9(C-9),55.0(C-10),123.6(C-11),176.6(C-12),8.0(C-13),11.5(C-14),7.6(C-15)。参考文献数据,化合物Ⅱ鉴定为3-oxo-eremophila-1,7(11)-dien-12,8-olide。化合物Ⅲ:C15H18O4,无色针晶,mp:204～206℃。1HNMR(CD3OD,400MHz)δ:6.83(dd,J=10.0,2.0Hz,H-1),6.15(dd,J=10.0,3.3Hz,H-2),2.78(q,J=6.8Hz,H-4),2.52(br.d,J=13.2Hz,H-6a),2.86(d,J=13.1Hz,H-6b),1.89(t,J=13.4Hz,H-9a),2.54(dd,J=13.2,3.4Hz,H-9b),3.24(br.dd,J=11.5,1.0Hz,H-10),1.95(d,J=1.56Hz,H-13),0.78(s,H-14),1.27(d,J=6.86Hz,H-15)。13CNMRδ:152.1(C-1),130.0(C-2),202.6(C-3),44.6(C-4),45.6(C-5),36.8(C-6),169.2(C-7),104.7(C-8),39.7(C-9),55.1(C-10),125.4(C-11),173.9(C-12),8.0(C-13),10.9(C-14),7.5(C-15)。参考文献数据,化合物Ⅲ为3-oxo-8-hydroxy-eremophila-1,7(11)-dien-12,8-olide。2.3样品的生物合成方法由产物的结构,推测底物Ⅰ和产物之间可能存在如下的生物合成途径:2.4培养基中各产物的转化率从图2可看出,在考察的6d中,产物Ⅱ在培养物和培养基中的变化趋势相似:随着共培养时间的延长先增加,第3d达到最高,在培养物中的量达到42.5mg/L;在培养基中仅有1.8mg/L,此时产物Ⅱ的总转化率最高为20.7%。共培养的第1d时分泌率最高(5.6%),而后随着产物产量的增加分泌率反而下降,可能是由于培养体系对产物存在反馈抑制。2.5培养基中产物的总转化率从图3中可以看出,产物随着共培养时间的延长总体呈先升后降的趋势,产物在培养物中含量第5d时升至最高(29.9mg/L),此时产物Ⅲ的总转化率也达到最大(12.1%);而在培养基中产物量先逐渐上升,第3d时量最多(1.69mg/L),而后开始下降。产物的分泌率在共培养的第1d最高,为15.0%。2.6共培养时间和产物的量实验结果表明,转化产物Ⅱ和Ⅲ均随着共培养时间的延长先逐渐升至最高值再开始降低,但两者并非同时达到最高峰,其中当共培养时间为3d时产物Ⅱ的量达到最高,分泌率仅有4.1%,此时总的转化率为最高值27.2%。而产物Ⅲ的量在5d时才达到最高,分泌率仅有4.4%。在实验考察范围内产物Ⅱ的分泌率都在5.6%以下,Ⅲ的分泌率都在15%以下。综合分析:最佳共培养时间为3d。总之,对于底物Ⅰ在何首乌毛状根中的转化过程而言,产物主要在培养物中累积。3活性物质的降解本研究利用何首乌毛状根对倍半萜类化合物furannoligularenone进行生物转化研究并获得成功,底物在系统中发生了氧化反应和羟基化反