紫外可见吸光光度法及分子荧光分析法课件

第10章吸光光度法（AbsorptionPhotometry）

基于物质对光的选择性吸收建立起来的一种分析方法。包括比色法、紫外-可见吸光光度法和红外光谱法等。1第10章吸光光度法基于物质对光的选择性吸收建立起来的一10.1物质对光的选择性吸收和光吸收定律1、光的基本性质

光是一种电磁波，具有波粒二象性，用普郎克公式可以把波性和粒性联系在一起。10.1.1物质对光的选择性吸收210.1物质对光的选择性吸收和光吸收定律1、光的基本性质光的波粒二象性波动性粒子性

E光的折射光的衍射光的偏振光的干涉光电效应E：光子的能量（J,焦耳）

：光子的频率（Hz,赫兹）

：光子的波长（cm）c：光速（2.99791010cm.s-1）h：Plank常数（6.625610-34J.s焦耳.秒）3光的波粒二象性波动性粒子性E光的折射光的衍射光的偏光学光谱区远紫外近紫外可见近红外中红外远红外（真空紫外）10nm~200nm200nm

~380nm380nm

~780nm780nm~2.5

m2.5

m

~50

m50

m

~300

m紫外光度法比色及可见光度法跃迁类型：分子中价电子的跃迁4光学光谱区远紫外近紫外可见近红外中红外远红外（真空紫2、吸收光谱产生的原理1.电子相对于原子核的运动--电子能级;2.原子核在其平衡位置附近的相对振动--振动能级;3.分子本身绕其重心的转动--转动能级.物质分子内部3种运动形式及其对应能级：分子吸收光谱，是由于分子中价电子选择性地吸收了某些范围内的光52、吸收光谱产生的原理1.电子相对于原子核的运动--电子能基态激发态分子总能量：E分子＝E电子＋E振动＋E转动分子吸收光，从基态跃迁到激发态，能量发生变化△E分子＝△E电子＋△E振动＋△E转动

1~20ev0.05~1ev<0.05ev若吸收光，则必须：即：只有光的能量与分子中基态与激发态能量差相等时，物质才会吸收光。由于物质基态与激发态能量差是固定的，所以物质对光的吸收是选择性的6基态激发态分子总能量：E分子＝E电子＋E振动＋E转动若吸收光吸收光谱AbsorptionSpectrum纯电子能态

间跃迁S2S1S0S3h

E2E0E1E3S2S1S0h

A

h

h

h

分子内电子跃迁带状光谱锐线光谱

A7吸收光谱AbsorptionSpectrum纯电子能*单色光（monochromaticlight）：具有同一波长的光。*复合光（multiplexlight）：由不同波长组成的光。*紫外光（ultravioletlight）：波长200~400nm。*可见光（visiblelight）：人眼能感觉到的光，波长在400~750nm。它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成的*波段（waveband）：各种色光的波长范围不同。*互补色光（complementarycolorlight）：按一定比例混合，得到白光（whitelight）。*物质的颜色是因物质对不同波长的光具有选择性吸收作用而产生的。8*单色光（monochromaticlight）：具有同蓝黄紫绿青蓝橙红青白光9蓝黄紫绿青蓝橙红青白光9物质的颜色与吸收光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光10物质的颜色与吸收光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表吸收光/nm吸收光颜色物质颜色400～450紫黄绿450～480蓝黄480～490绿蓝橙490～500蓝绿红500～560绿红紫560～580黄绿紫580～610黄蓝610～650橙绿蓝650～760红

表6-2物质颜色与吸收光颜色的关系蓝绿11吸收光/nm吸收光颜色物质颜色400～450紫黄绿I’0ItIa浓度Cb吸收光Ir反射光10.1.2光吸收的基本定律----朗伯-比尔定律把I0当作入射光，I0＝Ia＋It吸光溶液：I’0＝Ia＋It＋Ir定义：透光度：通常用I表示透光度越大，溶液对光的吸收越小1、朗伯-比尔定律I’0I0bIr反射光空白溶液：I’0＝I0＋Ir12I’0ItIa浓度Cb吸收光Ir10.1.2光吸收的基本定朗伯定律:(1760)A=lg(I0/It)=k1b当入射光的

,吸光物质的c一定时,溶液的吸光度A与液层厚度b成正比.比尔定律(1852)A=lg(I0/It)=k2c 当入射光的

,液层厚度b

一定时,溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比.吸光度：13朗伯定律:(1760)A=lg(I0/It)=k1b比朗伯-比尔定律意义: 当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比.A=lg(I0/It)=KbcK：常数，与吸光物质性质、入射光波长和温度等因素有关光吸收具有加和性.A=A1+A2+

14朗伯-比尔定律意义:A=lg(I0/It)=KbcK：常数，K吸光系数Absorptivity

a的单位:L·g-1·cm-1当c的单位用g·L-1表示时，用a表示，

A＝abc

的单位:L·mol-1·cm-1当c的单位用mol·L-1表示时，用

表示.

－摩尔吸光系数MolarAbsorptivity

A＝

bc

2、摩尔吸光系数和桑德尔灵敏度

a：表示每升1g物质，液层厚度为1cm时溶液的吸光度：表示物质的量浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时溶液的吸光度越大，物质对光的吸收程度越大，

最大时的吸收波长即λmax，此时测定灵敏度最高。问：如何测

？15K吸光系数Absorptivitya一般情况<104

~104~105

>105低灵敏度中等灵敏度高灵敏度实际测得的是条件摩尔吸收系数，′实际测定332+桔红色

508邻二氮菲=1.110416一般情况<104~104~105>

Sandell(桑德尔)灵敏度

(S)定义：当仪器的检测限A=0.001时,截面积为1cm2的液层内所能检出的物质的最低含量。用S表示，单位：

g·cm-2S与

关系S小，灵敏度高;

相同的物质，M小，则灵敏度高.17Sandell(桑德尔)灵敏度(S)S小，灵敏度单光束、单波长可见：72、721、722、723、724紫外-可见：751G、754双光束、双波长10.2分光光度计及吸收光谱10.2.1分光光度计18单光束、单波长可见：72、721、722、723、724紫外单波长单光束分光光度计0.575光源单色器吸收池检测器显示19单波长单光束分光光度计0.575光源单色器吸收池检测器显示1主要部件光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)20主要部件光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。

棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同.玻璃350～3200nm,石英185～4000nm问：玻璃能用于紫外区吗？光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便.21单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。棱镜：依吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。 可见光区：光学玻璃池 紫外区：石英池问：紫外区能用玻璃吗？显示装置（指示器）：记录A或T 低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。光电管，光电倍增管22吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。显示装置（指示器）：

任何一种溶液．对不同波长的光的吸收程度是不相等的。如果将不同波长的单色光依次通过一定浓度的某一溶液，测量该溶液对各种单色光的吸收程度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标可以得到一条曲线，叫做吸收光谱或吸收曲线。它清楚地描述了溶液对不同波长的光的吸收情况。

10.2.2吸收光谱23任何一种溶液．对不同波长的光的吸收程度是不相等的。如Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱300400500600700

/nm350525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance350光吸收曲线24Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱30040050060不同物质吸收光谱的形状以及

max不同——定性分析的基础例如：KMnO4溶液的光吸收曲线，λmax＝525nm，如果浓度改变，吸光度改变，但吸收曲线形状不变，如下页同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形状相同，Amax不同——定量分析的基础25不同物质吸收光谱的形状以及max不同252626选择适当的参比溶液原则：扣除非待测组分的吸收以显色反应为例进行讨论M+R=M-R

max试液 显色剂溶剂吸光物质参比液组成无吸收无吸收光学透明溶剂基质吸收无吸收吸收不加显色剂的试液无吸收吸收吸收显色剂基质吸收吸收吸收吸收显色剂+试液+待测组分的掩蔽剂若欲测M-R的吸收

maxA（样）=A（待测吸光物质）

+A（干扰）+A（池）A（参比）

=A（干扰）+A（池）27选择适当的参比溶液原则：扣除非待测组分的吸收以显色反应为例进10.3显色反应及其影响因素10.3.1显色反应和显色剂显色反应：将待测组分转变成可测量的有色化合物的反应，叫显色反应。显色剂：与待测组分形成有色化合物的试剂称显色剂。2810.3显色反应及其影响因素10.3.1显色反应和显色剂显（1）显色反应的选择A选择性好，干扰少，或干扰容易消除;灵敏度高，有色物质的ε应大于104。B有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式。C有色化合物的化学性质稳定，至少保证在测量过程中溶液的吸光度基本恒定。这就要求有色化合物不容易受外界环境条件的影响。D有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大，即显色剂对光的吸收与络合物的吸收有明显区别，要求两者的吸收峰波长之差Δλ(称为对比度)大于60nm。29（1）显色反应的选择29（2）显色剂

无机显色剂不多，因为生成的络合物不稳定，灵敏度和选择性也不高。如用KSCN显色测铁、钼、钨和铌；用钼酸铵显色测硅、磷和钒;用H2O2显色测钛等。

有机显色剂分子中含有生色团（chromophoricgroup）和助色团（auxochromegroup）。生色团是某些含不饱和键的基团，如偶氮基、对醌基和羰基等。这些基团中的π电子被激发时需能量较小，可吸收波长200nm以上的可见光而显色。助色团是含孤对电子的基团，如氨基、羟基和卤代基等。这些基团与生色团上的不饱和键作用，使颜色加深。30（2）显色剂30

有机显色剂A磺基水杨酸OO型螯合剂，可与很多高价金属离子生成稳定的螯合物，主要用于测Fe3+。B丁二酮肟NN型螯合显色剂，用于测定Ni2+。C1，10-邻二氮菲NN型螯合显色剂，测微量Fe2+。D二苯硫腙含S显色剂，萃取光度测定Cu2+，Pb2+，Zn2+，Cd2+，Hg2+等。E偶氮胂Ⅲ(铀试剂Ⅲ)偶氮类螯合剂，强酸性溶液中测Th(Ⅳ),Zr(Ⅳ)，U(Ⅳ)等；在弱酸性溶液中测稀土金属离子。F铬天青S三苯甲烷类显色剂，测定Al3+。G结晶紫三苯甲烷类碱性染料，测定Tl3+。31有机显色剂31

（3）多元络合物

多元络合物是由三种或三种以上的组分所形成的络合物。目前应用较多的是由一种金属离子与两种配位体所组成的三元络合物。三元络合物在吸光光度分析中应用较普遍。重要的三元络合物类型。*三元混配络合物金属离子与一种络合剂形成未饱和络合物，然后与另一种络合剂结合，形成三元混合配位络合物，简称三元混配络合物。例如，V(V)，H2O2和吡啶偶氮间苯二酚(PAR)形成1:1:1的有色络合物，可用于钒的测定，其灵敏度高，选择性好。32（3）多元络合物32*

离子缔合物金属离子先与络合剂生成络阴离子或络阳离子，再与带反电荷的离子生成离子缔合物。主要用于萃取光度法。如，Ag+与1，10-邻二氮菲形成阳离子，再与溴邻苯三酚红的阴离子形成深蓝色的离子缔合物。用F-、H2O2、EDTA作掩蔽剂，可测定微量Ag+。作为离子缔合物的阳离子，有碱性染料、1，10-邻二氮菲及其衍生物、安替比林及其衍生物、氯化四苯砷(或磷、锑)等;作为阴离子，有X-，SCN-，ClO4-，无机杂多酸和某些酸性染料等。33*离子缔合物金属离子先与络合剂生成络阴离子或络阳离子，

*金属离子-络合剂-表面活性剂体系

金属离子与显色剂反应时，加入某些表面活性剂，可以形成胶束化合物，它们的吸收峰向长波方向移动(红移)，而测定的灵敏度显著提高。目前，常用于这类反应的表面活性剂有溴化十六烷基吡啶、氯化十四烷基二甲基苄胺、氯化十六烷基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵、溴化羟基十二烷基三甲基铵、OP乳化剂。例如，稀土元素、二甲酚橙及溴化十六烷基吡啶反应，生成三元络合物，在pH8~9时呈蓝紫色，用于痕量稀土元素总量的测定。34*金属离子-络合剂-表面活性剂体系金属离子与显色*杂多酸

溶液在酸性的条件下，过量的钼酸盐与磷酸盐、硅酸盐、砷酸盐等含氧的阴离子作用生成杂多酸，作为吸光光度法测定相应的磷、硅、砷等元素的基础。杂多酸法需要还原反应的酸度范围较窄，必须严格控制反应条件。很多还原剂都可应用于杂多酸法中。氯化亚锡及某些有机还原剂，例1-氨基-2-萘酚-4-磺酸加亚硫酸盐和氢醌常用于磷的测定。硫酸肼在煮沸溶液中作砷钼酸盐和磷钼酸盐的还原剂。抗坏血酸也是较好的还原剂。35*杂多酸溶液在酸性的条件下，过量的钼酸盐与磷酸盐、硅酸10.3.2影响显色反应的因素1.溶液的酸度(1)酸度低，金属离子水解

(2)酸度影响显色剂的浓度和颜色(3)酸度影响络合物的组成和颜色2、显色剂用量3.显色时间和温度4.溶剂（1）溶剂影响络合物的离解度（2）溶剂影响显色反应的速度3610.3.2影响显色反应的因素1.溶液的酸度(1)酸度低10.4.1测定波长的选择和标准曲线的绘制1、测定波长的选择

515655415500钍-偶氮砷III

钴-亚硝基红盐

AA络合物络合物试剂试剂

/nm

/nm最大吸收原则：选λmax的光作入射光。此时，灵敏度较高，测定时偏离朗伯-比耳定律的程度减小，其准确度也较好。“吸收最大、干扰最小”的原则：当有干扰物质存在时，应据此来选择入射光的波长。10.4吸光光度分析及误差控制3710.4.1测定波长的选择和标准曲线的绘制1、测定波长的选根据A＝εbc作A～C曲线从工作曲线上查浓度AAxC2.标准曲线的制作1231、3不通过原点，主要原因有：A、参比溶液选择不当B、吸收池厚度不等C、吸收池表面不清洁38根据A＝εbcAAxC2.标准曲线的制作1231、3不通过10.4.2对朗伯-比耳定律的偏离A＝εbc3910.4.2对朗伯-比耳定律的偏离A＝εbc391.单色光不纯所引起的偏离避免方法：选最大吸收波长处，使用分光效能高的单色器ACAλλ1λ2λ1λ2λ1处无偏差401.单色光不纯所引起的偏离ACAλλ1λ2λ1λ2λ1处无偏2．介质不均匀性引起的偏离

朗伯-比耳定律是建立在均匀、非散射基础上的一般规律,如果介质不均匀，呈胶体、乳浊、悬浮状态存在，则入射光除了被吸收之外、还会有反射、散射作用。在这种情况下，物质的吸光度比实际的吸光度大得多，必然要导致对朗伯-比耳定律的偏离。412．介质不均匀性引起的偏离413.

由于溶液本身的化学反应引起的偏离溶液中吸光物质常因解离、缔合、形成新的化合物或在光照射下发生互变异构等，从而破坏了平衡浓度与分析浓度之间的比例关系，也就破坏了吸光度A与分析浓度之间的线性关系。产生对朗伯-比耳定律的偏离。例：K2Cr2O7

λmax=450nm稀释，离解度增大，吸光度降低实际测定时：可控制强酸性测Cr2O72-

或控制强碱性测CrO42-423.由于溶液本身的化学反应引起的偏离例：K2Cr2O74.显色反应的干扰及其消除

试样中存在干扰物质会影响被测组分的测定,使得标准曲线严重偏离朗伯-比尔定律,这是造成光度分析误差的重要原因.例干扰物质本身有颜色或与显色剂反应,在测量条件下也有吸收,造成干扰.干扰物质与待测组分反应或与显色剂反应,使显色反应不完全,也会造成干扰.干扰物质在测量条件下从溶液中析出,使溶液变混浊,无法准确测定溶液的吸光度.434.显色反应的干扰及其消除43

消除干扰的方法主要有以下几种：（1）控制酸度许多显色剂是有机弱酸，控制溶液的酸度，就可以控制显色剂R的浓度，这样就可以使某种金属离子显色，使另外一些金属离子不能生成有色络合物。（2）加入掩蔽剂在显色溶液里加一种能与干扰离子反应生成无色络合物的试剂，也是消除干扰的有效而常用的方法。(3)改变干扰离子的价态以消除于扰。（4）选择合适的参比溶液.（5）增加显色剂的用量（6）分离干扰离子44消除干扰的方法主要有以下几种：4410.4.3吸光度测量的误差

由于仪器精度不够，光源不稳、检测器、读数不准，实验条件偶然变动等引起的误差，这些误差，都反映到读数误差ΔT

ΔT（绝对误差）：与T本身的大小无关，对于一台给定仪器它基本上是常数，一般在0.002-0.01之间，仅与仪器自身的精度有关。010T%90100A01.0∞读数标尺T：分布均匀，A=εbc，当T不同时，ΔA非常数，∴ΔC非常数4510.4.3吸光度测量的误差由于仪器精度不够，光源不稳A=-lgT=-0.434lnT测量误差公式推导:dA=

-0.434dT/T若：dT=ΔT=±0.01，则：由于T与浓度c不是线性关系，故不同浓度时的仪器读数误差ΔT

引起的测量误差Δc/c不同。46A=-lgT=-0.434lnT测量误差公式可绘制∣Er∣～T曲线TlgT最大时，即(TlgT)′=0时误差最小,算得lgT=-0.434,T=36.8%,A=0.434适宜测量范围：T：0.15～0.65A：0.80～0.20工作中可控制A：0.90～0.10通过使用不同厚度的比色皿1086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.43447可绘制∣Er∣～T曲线1086420204060800.70484810.5.1目视比色法标准系列未知样品特点利用自然光比较吸收光的互补色光准确度低（半定量）不可分辨多组分方法简便，灵敏度高10.5其它吸光光度法4910.5.1目视比色法标准系列未知样品特点利用自然光比较吸10.5.2示差吸光光度法分光光度法可用于测量微量组分，控制A在0.1～1.0之间，若浓度过大，即使不偏离比尔定律，但会使A>1.0，无法测定。所以可采用示差法。示差法可分三种：

高浓度示差法（常用）低浓度示差法极限精密法5010.5.2示差吸光光度法501、示差法原理

被测物浓度设：空白液0标液C0待测液Cx（Cx>C0,但与C0接近）以空白液作参比：A0＝

bc0Ax＝

bcx△A=Ax-A0=

b(cx-c0)=

b△c以标液作参比，调A0＝0，（相当于把C0的浓度当作0）A相对＝△A=

bc相对若已知

b，示差法测A，求浓度：Cx＝Cs＋△C511、示差法原理被测物浓度以空白液作参比：A0＝示差法提高准确度的实质：扩展了读数标尺。常规法TxT051050100

落在测量误差较大的范围示差法T051050100TxTsTs

落在测量误差较小的范围结论：示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度52示差法提高准确度的实质：扩展了读数标尺。常规法TxT051010.5.3双波长光度分析法1、双波长原理切光器使两个波长的光交替照射到吸收池上设λ1、λ2处两束光强度相等，Aλ1＝

λ1

bcAλ2＝

λ2

bc△A=Aλ1

-Aλ2

=（

λ1-λ2）bc△A∝C光源单色器单色器检测器吸收池λ1λ2切光器5310.5.3双波长光度分析法1、双波长原理切光器使两个2、应用A、可测混浊液只一个吸收池，当λ1与λ2相差不大时，混浊液对两束光散射相同B、单组分测定，用一个吸收池，消除了比色皿不一致产生的误差C、可测吸收光谱重迭组分542、应用A、可测混浊液54测P：选λ2作参比，在λ1处测A，Q在两处吸光度相等，相互抵消A＝（

λ1-λ2）bc55测P：选λ2作参比，在λ1处测A，Q在两处吸光度相等，相互抵

测定苯酚(X)与2，4，6-三氯苯酚(Y)混合物中的苯酚时就可用