elisa方法检测hbsag的影响因素

elisa方法检测hbsag的影响因素

目前，我国最流行的方法是对肝肾双重半（hbv血清功能指数hbsag、hbsa、hbeag、hbeag和hbcag）进行酶联免疫吸附试验（elisa），但同一人在不同医院的科学研究报告可能会不同。同一样本可以由同一个实验室的两名成员执行。而乙肝两对半作为乙肝的一项重要检测指标,对临床医生为病人设计治疗方案影响很大,因此,提高乙肝两对半检测的准确性显得尤为重要。影响乙肝两对半检测结果的因素很多,根据多年实验室检测的经验,笔者认为可以从以下几大方面加强监测。1仪器正常运行ELISA方法检测乙肝两对半所用的仪器有酶标仪、洗板机、电热恒温培养箱、冰箱、全自动加样机等,日常操作应保证各仪器的正常运行,每年检修1次。移液器每隔一段时间应校正1次,冰箱、电热恒温培养箱每日有专人记录其内部温度,冰箱中应放入冰袋,以免停电后温度上升时间过长而使酶失活。2同一厂家试剂不使用过期的试剂,正规厂家生产的试剂盒上都有生产日期和过期日期,应用在保质期内的产品。具体操作前,室温平衡20～30min,用完后立即放入4℃冰箱中。由于质量好坏对报告产生重大影响,应选用其产品被各大医院长期使用并认同的的知名厂家所生产的试剂。另外由于生产厂家不同,试剂的灵敏度也有所不同,有1、2、5ng/ml不等,这对低水平的样品会有影响,因此,选用同一厂家的试剂,有利于提高各实验室之间的重复性和可比性。例如,池晓霞等报道1029例HBsAg阳性患者中,HBsAg浓度在5μg/L以下者就有312例(2.73%),其中HBsAg含量<1μg/L者有147例(47.12%),1～2μg/L的有61例(19.55%),2～5μg/L的有104例(33.33%)。可见低水平血清HBsAg人群不容忽视,重视并提高HBsAg检测灵敏度有重要意义。3月和8月hbeag试验样品存放时间对血清保存时间及条件直接影响结果的准确性。何印蕾等报道,在室温下保存的血清标本HBsAg从第9天、HBeAg从第7天、HBsAb从第5天开始发生明显变化(均P<0.01);在4～8℃保存的血清标本HBsAg从第14天、HBsAb从第7天、HBeAg从第14天开始发生明显变化(均P<0.01)。在-80℃低温冰箱保存的血清标本HBV血清标记物在4个月内均保持稳定(均P>0.05)。溶血程度和红细胞对乙肝两对半的检测结果影响也很大,当溶血程度和红细胞浓度越高时,出现HBsAg、HBsAb、HBeAg假阳性的可能就越大。温洪周等报道,当红细胞达到0.25×1012/L时,有100%的HBsAg、96%的HBsAb、98%HBeAg为假阳性。因此,当结果出现“HBsAg+,HBsAb+,HBeAg+”等不易解释的模式时,可考虑样品是否有溶血。而HBsAg+或HBsAb+或HBcAb+的标本,也可能是因为溶血而出现假阴性的结果。因此,样品最好及时检测,若不能及时检测,应根据需要放在不同温度的冰箱中。采血时动作不能过猛,以防止溶血。另外,要注意儿童的抽血量不能过少。4操作步骤4.1移液枪作标准量加样加样过程中,样品不可过多也不可过少,否则都会影响结果,应用移液枪作标准量加样,同时尽量不要吸到纤维蛋白原,以免洗板时堵塞洗板机吸头,或洗板机洗不去沉淀的纤维蛋白原而影响了显色结果。4.2影响显色装置的工作原理一般试剂盒的酶都有滴瓶,说明中有的要求加1滴酶,有的要求加50μl,但建议用移液枪作标准量滴加。因为直接用滴瓶滴时,因角度不同,瓶口大小,用力大小等都会影响滴下的试剂量,而且经常会滴在两孔之间造成洗板机无法洗去而影响显色。另外,移液枪的枪头务必一次性使用,不可重复,因为即使洗净后高温消毒也会因为变形而漏气,影响了加样的准确度。4.3空气氧化法严格按照说明操作,若时间过短,可能产生假阴性;时间过长,可能因空气氧化而产生假阳性;温度过高,酶易失活,而温度过低,也可能产生假阴性。4.4清洗液的使用目前,一般大医院都采用自动洗板机洗板,要注意的是有些血清中有纤维蛋白原或气泡,应在洗板后再用清水冲洗,拍干。清洗液按说明配制,每次使用前保证有足够的清洗液,否则会造成严重的假阳性;废液要及时倒去,否则会损伤洗板机或有的洗板机干脆停止工作。另外,废液瓶应加入84消毒剂,而清洗液瓶中千万不可用84等氧化剂消毒,否则结果呈全部阳性。4.5因震动的震动将ELISA板放入酶标仪一定要按平,否则因不平引起的震动会使孔中的有色液体溅出,甚至溅到相邻的孔中,使全部工作功亏一篑;另外,要注意酶标仪的除尘,否则也会影响读出的结果。4.6hbcab检测每次实验应设阴阳对照,根据试剂盒的说明报结果。但是,因ELISA方法检测HBcAb时要对血清做30倍稀释,使HBcAb结果的假阳性较其他4孔明显偏高,因此报结果时需参考前面4项指标。另外,因为肝炎的潜伏期是3个月,所以乙肝两对半的体检报告有效期只有3个月。5对hbv的pcr检测科学发展至今,已明确乙肝病毒颗粒由3部分组成,乙肝表面抗原、核心抗原和e抗原,因核心抗原存在于感染病毒的细胞核内,因此,在血清中无法检测到,只能在细胞浆中检测到其抗体即HBcAb,以及HBsAg,HBeAg及其抗体,因此,我们平时检测的只是叫两对半,而不是三对,但可以用PCR方法弥补。PCR不但能检测到核心抗原,而且能检测出HBV复制的情况和变异的乙肝病毒。若这2种方法同时运用,相互补充,就能使医生综合评价患者病情与用药疗