无籽西瓜愈伤组织诱导及植株再生研究

无籽西瓜愈伤组织诱导及植株再生研究

无核生瓜比普通二倍体西瓜糖含量高，食用方便，耐贮藏，深受人们喜爱。但其制种复杂,成本高,所得的三倍体无籽西瓜种子中很多胚芽发育不良,子叶畸形,种皮厚,种子发芽率低,苗期生长缓慢,这些因素制约了无籽西瓜的生产。西瓜组织培养始于20世纪70年代,自1979年获得初步成功以来,国内外相继报道了这方面的研究进展,但利用无籽西瓜子叶作为外植体获得再生植株的报道甚少。为此,我们以无籽西瓜子叶为外植体,研究了通过愈伤组织阶段诱导芽及获得再生植株的培养条件。1材料和方法1.1种子离体培养及植株再生试验选用无籽西瓜品种黑蜜5号为试材,于2002年起在河南农业大学林学园艺学院组培室进行子叶离体培养及植株再生试验。利用郑先波等报道的方法获得无籽西瓜无菌苗。1.2一般培养基配方的选择和实验方法1.2.1接种法培养暗传统种以MS为基本培养基,附加不同浓度的6-BA和NAA,共12个处理,各培养基配方见表1。每处理接种10个外植体为1次重复,设4次重复。将无籽西瓜无菌苗的子叶切成0.5cm×0.5cm的小块,放入培养皿中,在温度为(25±2)℃的人工气候箱内进行暗培养,7天后移到光周期为16小时光照、8小时黑暗,光照强度为2000lx的培养室中继续培养。28天后观察并统计愈伤组织及芽的诱导情况。1.2.2光照对无籽西瓜模拟芽诱导的效果研究设光照28天、先黑暗7天再光照21天、先黑暗14天再光照14天、一直在黑暗下28天、先光照7天再黑暗21天5种不同的光周期处理,将芽接种到筛选出的最佳芽诱导培养基中,研究光周期对无籽西瓜子叶外植体芽的诱导情况。1.2.3生根培养基上将在芽诱导培养基上达到一定高度的幼芽从基部切断,然后接种到不同生根培养基上。生根培养基以1/2MS为基本培养基,蔗糖15g/L,附加不同浓度的IAA和IBA,共7个组合,不同培养基配方见表2。放在培养条件相同的三角瓶中培养,20天后观察生根情况。2结果与分析2.1-ba和naa对无籽西瓜子叶芽诱导的效果由表1可看出,12种培养基都成功诱导出了愈伤组织,且6-BA2.0～5.0mg/L范围内愈伤组织的诱导率无明显差异,而芽的诱导情况则有很大差异,芽诱导率随6-BA浓度的增加呈上升趋势,最大诱导率达20.0%。这说明较高浓度的6-BA对无籽西瓜子叶芽的诱导很有效,但并非6-BA的浓度越高对无籽西瓜子叶芽的诱导越有利,研究发现,当6-BA浓度达5.0mg/L时,虽然愈伤组织及芽的诱导率与6-BA3.0mg/L差别不大,但诱导的芽出现明显的畸形或玻璃化,这与任春梅等的研究结果相似。NAA对无籽西瓜愈伤组织及芽的诱导率则表现出与6-BA相反的趋势,NAA在0.1～0.3mg/L范围内芽的诱导率随其浓度的升高而下降。这说明低浓度NAA促进芽的生长,高浓度则抑制其生长。在与6-BA的组合中NAA都表现在较低浓度(0.1mg/L)诱导效果较好,其中以MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L效果最佳,因此,选择此培养基作为无籽西瓜子叶芽诱导的最适培养基。2.2诱导愈伤组织的诱导接种后将培养皿一直在光照下培养28天和先光照7天后转移到黑暗下21天都不能诱导出芽,说明光照抑制了无籽西瓜子叶芽的产生。接种后一直在黑暗中培养28天,愈伤组织诱导率为10.0%,只能形成白色雪花状的愈伤组织不能形成芽。接种后先置于黑暗中7天或14天再转移至光照下均能诱导出愈伤组织,从而在愈伤组织上诱导出芽,愈伤组织诱导率分别为30.0%、27.5%,芽诱导率分别为12.5%、10.0%。此结果说明无籽西瓜芽的诱导和愈伤组织的诱导一样都需要在黑暗条件下启动,进一步的生长分化则需要在光照下进行。2.3不同浓度对植物叶片生根性能的影响由表2可看出,无籽西瓜子叶诱导的幼芽生根相对较容易,健壮的芽可以在不含任何生根调节物质的1/2MS中生根,生根率达37.5%,在加入不同浓度IAA和IBA后,生根效果明显提高。IBA和IAA的浓度在0.1～0.6mg/L范围内,生根率随着生长调节物质浓度的升高而增加,最高生根率在90%以上,平均根数也随之增加,且形成的根生长旺盛,无愈伤组织产生,须根多。因此,可选用1/2MS+IAA0.4mg/L和1/2MS+IBA0.3mg/L为理想的生根培养基。3-ba和naa对5号愈伤组织诱导芽的影响(1)以往的研究表明,6-BA是子叶外植体芽诱导效果最好的生长调节物质,其有效浓度因品种而有所差异,低浓度6-BA(1.0～3.0mg/L)对芽的诱导有良好的促进作用,较高浓度(高于3.0mg/L)则对芽的分化有抑制作用,且再生芽多畸形,难以发育成正常植株。我们研究发现,6-BA在无籽西瓜芽的诱导过程中,起着非常重要的作用,但在较低浓度下(低于2.5mg/L)不能诱导芽的产生,只有在其浓度达到2.5mg/L时才有芽的出现,最适浓度为3.0mg/L,当浓度达5.0mg/L时芽出现畸形及玻璃化。6-BA与其他生长调节物质的组合使用的效果因品种不同而有很大差异。牛爱国等用6-BA与IBA组合以无籽西瓜顶芽为外植体诱导了再生植株。我们则用6-BA与NAA组合从子叶外植体上成功地进行了芽的诱导,并研究发现,以无籽西瓜黑蜜5号子叶为外植体,通过愈伤组织诱导芽的最佳培养基是MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L。(2)研究发现,无籽西瓜接种后直接进行光处理,抑制愈伤组织及芽的形成,接种后一直进行黑暗处理也不利于芽的产生,只能生成雪花状的愈伤组织,接种后先在黑暗条件下处理再在光照条件下处理才能诱导芽的产生。此结果表明,无籽西瓜芽的产生首先需要黑暗条件的启动,其进一步的生长分化则须在光照下进行。此结果也进一步证实了郑先波等在黑蜜5号愈伤组织诱导上的研究结果。(3)研究发现,无籽西瓜的幼芽生根相对比较容易,IBA和IAA都能很好